基于pcr-rflp鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的方法。本发明提供了一种用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒，含有由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶MfeI或其同裂酶。本发明通过分析金银花品系“大毛花”和“鸡爪花”腺毛发育相关的COi基因序列，获得“大毛花”和“鸡爪花”差异的SNP位点，设计鉴别引物和对应的限制性内切酶，采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术实现了两个品系金银花的准确鉴别。
【专利说明】基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物品种鉴定领域，涉及一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花 和鸡爪花的方法，特别涉及一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒 及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 药材金银花的基源植物为忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb?，在长期的 栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系。对山东、河 南传统金银花道地产区进行调查，发现金银花栽培品系"大毛花"和"鸡爪花"是金银花的 主流商品，其原植物形态、药材性状、化学成分均存在一定差异。"大毛花"因其叶片和花蕾 被毛多而密得名，鸡爪花的花蕾细长聚拢，形似鸡爪，因而命名为"鸡爪花"，其植株腺毛多 不发达。由于鸡爪花和大毛花的适生长环境不同，民间栽培引种需要先确定其品系。目前 人们主要通过传统的性状鉴别方法来区分这两个主流品系，但在幼苗时期，两个品系金银 花的性状差别不明显，且不同产地的金银花性状亦有区别。此外，也有研究表明可采用随机 扩增多态性DNA(RAPD)技术和同工酶（P0D)电泳分析技术对这两个品系进行鉴别，但鉴别 结果不够直观，操作略显复杂。
[0003] 鸡爪花和大毛花商品价值也有区别，传统认为，大毛花品系更符合传统道地产区 的特征，价格较高。然而，大毛花和鸡爪花苗期形态相似，而市场流通的商品金银花经由炮 制加工、运输储藏后，形态有所改变，腺毛脱落，难以区分。因此，急需建立科学性强、使用方 便的种质鉴别方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒，具体含有由序列 表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶Mfel或其 同裂酶。
[0006] 其中，序列1由21个核苷酸组成，序列2由24个核苷酸组成。
[0007] 所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花品系中的 应用也属于本发明的保护范围。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种基于限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花品系的方法。
[0009] 本发明所提供的基于PCR-RFLP技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还 是鸡爪花品系的方法，具体可包括如下步骤：
[0010] (1)以待测金银花的基因组DNA为|旲板，米用由序列表中序列1和序列2所不的两 条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增；
[0011] (2)采用限制性内切酶Mfel对步骤⑴所得PCR产物进行完全酶切；
[0012] 所述完全酶切是指酶切体系中所有可以被限制性内切酶AvaII或其同裂酶识别 并酶切的所述PCR产物均被切开，即不存在酶切不完全的情况。
[0013] (3)按照如下方法确定所述待测金银花的品系：若经步骤（2)酶切获得的DNA片 段为如下（al)，则所述待测金银花为或候选为大毛花品系；若经步骤（2)酶切获得的DNA 片段为如下（a2)或（a3)，则所述待测金银花为或候选为鸡爪花品系。
[0014] (al)大小分别为102bp和177bp的两个DNA片段（大毛花纯合子）；
[0015] (a2)大小为279bp单一DNA片段（鸡爪花纯合子）；
[0016] (a3)大小为102bp、177bp和279bp的三个DNA片段（鸡爪花杂合子）。
[0017] 进一步，所述步骤（3)中，大小为102bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列 3的第1-102位，大小为177bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第103-279 位，大小为247bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列4。
[0018] 在实际应用中，判断酶切产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将酶切产物进 行琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上含有目的条带，则酶切产 物中含有相应的目的DNA片段。
[0019] 在实际应用中，判断酶切产物中是否含有序列3的第1-102位、序列3的第 103-279位或序列4所示DNA片段，可通过对酶切产物进行核苷酸序列测定来判断。
[0020] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时，组成所述引物对的两条引物在反 应体系中终浓度均为80nmol/L。
[0021] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时，所述反应体系具体为： 2.5iiL10XExTaq缓冲液、2iiL0.25mmol/LdNTPs，上下游引物各 2.0pmol，rTaq酶 1.5U， 10mg?mlASA0? 5y1，25%PVP1y1，DNA模板约 70ng，灭菌蒸馈水补足至 25yL。
[0022] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为52_58°C(如 54。。）。
[0023] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时的反应程序具体为：95°C预变性 5!^11;951：变性3〇8,541：退火3〇8,721：延伸3〇8,35个循环 ；721：延伸5111111;反应结束后 4°C保存。
[0024] 在所述方法的步骤（2)中，采用限制性内切酶Mfel对步骤（1)所得PCR产物进 行酶切时，酶切体系具体可为：限制性内切酶Mfel-HF的buffer2.OiU，限制性内切酶Mfel-HF(为Mfel内切酶经基因工程改造获得的高保真内切酶变体）0. 5iil(10U)，PCR产 物 17. 1。
[0025] 在本发明的一个实施例中，所述限制性内切酶Mfel-HF及其buffer均为NEB公司 产品，其产品目录号为#R3589L)。
[0026] 在所述方法的步骤（2)中，采用限制性内切酶Mfel-HF对步骤（1)所得PCR产物 进行酶切时，酶切反应条件具体可为37°C孵育15min。
[0027] 本发明的再一个目的是提供一种用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的引物对。
[0028] 本发明所提供的用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的引物对，具体为由序列表 中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0029] 所述引物对在鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花品系中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0030] 本发明的还一个目的是提供一种基于PCR技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为大 毛花品系还是鸡爪花品系的方法
[0031] 本发明所提供的基于PCR技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡 爪花品系的方法，具体可包括如下步骤：
[0032] (1)以待测金银花的基因组DNA为模板，采用所述引物对（序列1和序列2)进行 PCR扩增，得到PCR产物；
[0033](2)按照如下方法确定所述待测金银花的品系：若所述PCR产物为如下（bl)，则所 述待测金银花为或候选为大毛花品系；若所述PCR产物为如下（b2)或（b3)，则所述待测金 银花为或候选为鸡爪花品系：
[0034] (bl)单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段（大毛花纯合 子）；
[0035] (b2)单一PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列4所示的DNA片段（鸡爪花纯合 子）；
[0036] (b3)两种PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，以及核苷酸 序列为序列表中序列4所示的DNA片段（鸡爪花杂合子）。
[0037] 在实际应用中，判断PCR产物中是否含有序列3或序列4所示DNA片段，可通过对 PCR产物进行核苷酸序列测定来判断。
[0038] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时，组成所述引物对的两条引物在反 应体系中终浓度均为80nmol/L。
[0039] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时，所述反应体系具体为： 2.5iiL10XExTaq缓冲液、2iiL0.25mmol/LdNTPs，上下游引物各 2.0pmol，rTaq酶 1.5U， lOmg.mriBSA0.5iil，25%PVPliil，DNA模板约 70ng，水补足至 25iiL。
[0040] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为52-58°C(如 54。。）。
[0041] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时的反应程序具体为：95°C预变性 5!^11;951：变性3〇8,541：退火3〇8,721：延伸3〇8,35个循环 ；721：延伸5111111;反应结束后 4°C保存。
[0042] 另外，所述试剂盒的制备方法以及所述引物对的制备方法也都属于本发明的保护 范围。
[0043] 所述试剂盒的制备方法，具体可包括将序列表中序列1和序列2所示的两条单链 DNA分子以及限制性内切酶Mfel或其同裂酶分别单独包装的步骤。
[0044] 所述引物对的制备方法，具体可包括将序列表中序列1和序列2所示的两条单链 DNA分子分别单独包装的步骤。
[0045] 在本发明中，所述待测金银花为大毛花品系或鸡爪花品系（如大毛花品系或鸡爪 花品系的干燥药材标本）。在本发明的一个实施例中，具体为表1中的75个金银花品系。
[0046] 本发明通过分析金银花品系"大毛花"和"鸡爪花"腺毛发育相关的COi基因序列， 获得"大毛花"和"鸡爪花"差异的SNP位点，设计鉴别引物和对应的限制性内切酶，采用限 制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP)技术实现了两个品系金银花的准确鉴别。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 图1为部分供试金银花的PCR-RFLP电泳检测结果。其中，M为DNA分子量标准； 泳道1-10为已知的金银花品系鸡爪花（对应表1中编号为1-5以及35-39的共10个金 银花）；泳道11-20为已知的金银花品系大毛花（对应表1中编号为64-73的共10个金银 花）。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 下述实施例中所用的仪器有：台式高速离心机（Eppendorf公司）、9700基因扩增 仪（ABI公司）、电泳仪、紫外凝胶成像仪。
[0051] 实施例1、鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒的制备及鉴定方法的建立
[0052] -、鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒的组成
[0053] 本发明用于鉴定鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒，是基于PCR-RFLP技 术设计的，含有由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限 制性内切酶Mfel。其设计过程大致如下：
[0054] 本发明的发明人通过分析金银花品系"大毛花"和"鸡爪花"腺毛发育相关的COi 基因序列，获得"大毛花"和"鸡爪花"差异的SNP位点，发现其中有一个SNP位点（记为 SNP位点甲）的存在造成了在大毛花品系（纯合）中形成限制性内切酶Mfel的识别位点， 而在鸡爪花品系（纯合）中的相应位置则没有形成限制性内切酶Mfel的识别位点，且在两 个品系中这个SNP位点的上下游各有一段保守区段，进而设计了用于鉴别两种品系的引物 对C01-2-F/C01-2-R和对应的限制性内切酶Mfel。
[0055] 其中，引物对为：
[0056] C01-2-F:5, -ACAATTAAACATCGCGGCTCT-3'（序列 1);
[0057] C01-2-R:5' -GAGTCAGATCACAGATATGGTGGA-3'（序列 2)。
[0058] 二、基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的方法的建立
[0059] 1、待测金银花基因组DNA的提取
[0060] 选取无霉变的待测金银花干燥药材标本0.lg，置于粉碎机中研磨粉碎至可过40 目筛；将粉末转移到2.OmL的微量离心管中，加入900yL已灭菌的CTAB(十六烷基三甲 基溴化铵）提取液（配方：2% (2g/100ml)CTAB，100mmol/LTris-HClpH= 8.0,20mmol/ LEDTA，1.4mol/LNaCl)、0.02gPVP40000、10iiLP-巯基乙醇充分振荡混匀，65°C水浴 1. 5h-2h，期间轻摇2-3次；结束后取出冷却至室温（25°C)，加入900yL氯仿-异戊醇（体 积比24 : 1)，充分振荡混勻，12000Xg离心lOmin;取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（体 积比24 : 1)充分振荡混匀，12000Xg离心lOmin;取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶 液，-20°C放置0.5h以上；取出，12000Xg离心10min，弃上清，沉淀用70% (体积分数）乙 醇洗涤两次，37°C挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20°C保存。
[0061] 2、PCR扩增
[0062] 以步骤1所得待测金银花的基因组DNA作为模板，采用引物对C01-2-F/C01-2-R 进行PCR扩增。
[0063] 反应体系（25iiL) :2. 5iiLlOXExTaq缓冲液、2iiL0? 25mmol/LdNTPs，上下游 引物各 2.0pmol，rTaq酶l.SUaOmg.mriBSA0.5ii1，25%PVPlii1，DNA模板约 70ng，灭 菌蒸馏水补足至25iiL。其中，lOXExtaq缓冲液和rTaq酶均为Takara公司产品，其产品 目录号分别为RR001Q和R001Q。
[0064] 在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为：95°C预变性5min; 95°〇变性3〇8,541：退火3〇8,721：延伸3〇8,35个循环；721：延伸5111111 ;反应结束后41：保 存。
[0065] 3、完全酶切
[0066] 采用限制性内切酶Mfel-HF对步骤2的PCR产物进行酶切鉴定。
[0067]酶切体系（20ill):限制性内切酶Mfel-HF的buffer2. 0ill，限制性内切酶 Mfel-HFO. 5ill(相当于10U)，步骤2获得的PCR产物17. 5ill。其中，限制性内切酶Mfel-HF 及相应的buffer均为NEB公司产品，其产品目录号为#R3589L。
[0068] 反应条件：37°C孵育15min。
[0069] 4、酶切产物检测
[0070] 酶切反应结束后，取4iiL反应液，与2iiL6X上样缓冲液充分混勻，于2.0%的 EB染色的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察。
[0071] 5、目的条带的测序及分析
[0072] 6、根据电泳和测序结果确定待测金银花的品系
[0073] 鉴于金银花品系鸡爪花相对于SNP位点甲而言有纯合子和杂合子两种情况，故而 得到根据电泳和测序结果确定待测金银花的品系的方法如下：
[0074] 若电泳仅得到大小分别为102bp(序列3的第1-102位）和177bp(序列3的第 103-177位）的两个目的条带，则所述待测金银花为大毛花品系（纯合）；若电泳仅得到大 小为279bp(序列4)单一目的条带，则所述待测金银花为鸡爪花品系（纯合）；若电泳得到 大小分别为279bp(序列4)、102bp(序列3的第1-102位）和177bp(序列3的第103-177 位）的三个目的条带，则所述待测金银花为鸡爪花品系（杂合）。
[0075] 当然，在实际操作中，也可以不采用限制性内切酶Mfel对PCR产物进行酶切，而是 直接将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，按照如下确定待测金银花的品系：若PCR产物 为单一产物--序列表中序列3所示的DNA片段（279bp)，则所述待测金银花为大毛花品 系（纯合）；若PCR产物为单一产物--序列表中序列4所示的DNA片段（279bp)，则所述 待测金银花为鸡爪花品系（纯合）；若PCR产物为两种产物--序列表中序列3所示的DNA 片段（279bp)和序列表中序列4所示的DNA片段（279bp)，则所述待测金银花为鸡爪花品系 (杂合）。
[0076] 实施例2、基于PCR-RFLP鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的方法的有效验证
[0077] 供试金银花：表1中所示的75个来自不同产地的品系已知的金银花。
[0078] 采用实施例1步骤一中的试剂盒，按照实施例1步骤二的方法对各供试金银花进 行PCR-RFLP检测。
[0079] 结果显示，所有的75个品系已知的金银花，采用实施例1的方法进行PCR-RFLP检 测的结果均与实际情况相符，可见检测准确率高达100%。75个品系的具体检测结果参见 表1。图1为部分供试金银花的PCR-RFLP电泳结果。
[0080] 进一步，将表1中扩增得到的大小为102bp的目的条带进行测序，发现其正为序列 表中序列3的第1-102位；将表1中扩增得到的大小为177bp的目的条带进行测序，发现其 正为序列表中序列3的第103-279位；将表1中扩增得到的大小为279bp的目的条带进行 测序，发现其正为序列表中序列4。
[0081] 表175个来自不同产地的品系已知的金银花及其PCR-RFLP检测结果
[0082]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的试剂盒，含有由序列表中序列1和序列 2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶Mfel或其同裂酶。
2. 权利要求1所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花 品系中的应用。
3. -种鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花品系的方法，包括如下步 骤： ⑴以待测金银花的基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增； (2) 采用限制性内切酶Mfel对步骤（1)所得PCR产物进行完全酶切； (3) 按照如下方法确定所述待测金银花的品系：若经步骤（2)酶切获得的DNA片段为 如下（al)，则所述待测金银花为或候选为大毛花品系；若经步骤（2)酶切获得的DNA片段 为如下（a2)或（a3)，则所述待测金银花为或候选为鸡爪花品系： (al)大小分别为102bp和177bp的两个DNA片段； (a2)大小为279bp单一 DNA片段； (a3)大小为102bp、177bp和279bp的三个DNA片段。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，大小为102bp的DNA片 段的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-102位，大小为177bp的DNA片段的核苷酸序列 为序列表中序列3的第103-279位，大小为247bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序 列4。
5. -种用于鉴定金银花品系大毛花和鸡爪花的引物对，为由序列表中序列1和序列2 所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
6. 权利要求5所述的引物对在鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花 品系中的应用。
7. -种鉴定或辅助鉴定待测金银花为大毛花品系还是鸡爪花品系的方法，包括如下步 骤： (1) 以待测金银花的基因组DNA为模板，采用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增， 得到PCR产物； (2) 按照如下方法确定所述待测金银花的品系：若所述PCR产物为如下（bl)，则所述待 测金银花为或候选为大毛花品系；若所述PCR产物为如下（b2)或（b3)，则所述待测金银花 为或候选为鸡爪花品系： (bl)单一 PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段； (b2)单一 PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列4所示的DNA片段； (b3)两种PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段，以及核苷酸序列 为序列表中序列4所示的DNA片段。
8. 根据权利要求3、4或7所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，进行所述PCR扩增时 采用的退火温度为52-58°C。
9. 权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括将序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子以及限制性内切酶Mfel或其同裂酶分别单独包装的步骤。
10. 权利要求5所述引物对的制备方法，包括将序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子分别单独包装的步骤。
【文档编号】C12Q1/68GK104328180SQ201410599277
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 蒋超, 胡添源 申请人:中国中医科学院中药研究所