利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法。该方法包括如下步骤：A)建立数学模型：a1)取若干已知年限人参位于芦头以下1～2cm处的样品，分别提取基因组DNA；a2)以各基因组DNA为模板，用特异于人参端粒和人参单拷贝基因的2个引物对分别进行qPCR，所得Ct值分别记为T和S；a3)针对每个人参，计算T/S；a4)以人参年限数值为横坐标，T/S为纵坐标，制作线性标准曲线，获得曲线方程；B)采用所得数学模型鉴别待测人参年限：按步骤a1)-a3)操作，获得待测人参T/S，将其代入数学模型，得待测人参的年限。该方法测定的人参年限与实际年限吻合度极高，且低成本，高通量，相比传统Southern印迹法测量人参端粒长度，本发明对DNA的需求量更少，试验周期更短。
【专利说明】利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法，特 别涉及一种利用qPCR法根据人参相对端粒长度鉴别人参年限的方法。
【背景技术】
[0002] 人参为五加科（Araliaceae)植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根 茎。在众多草本植物里，人参以其寿命长、价格昂贵而闻名于世，被称为百草之王。人参的 最大的价值是在于它的药用功效，早在《神农本草经》中就有着对人参神奇功效的描述。而 在当今社会，人参是以一种文化的象征或者作为收藏品出现在市场上。年限长、根型好的人 参为人所追捧，一个小小的山参，价格可能几十到几百万元。
[0003] 人参价格的高低关键在于年限的长短。传统的山参年限鉴别是根据"芦头"上的 "芦碗"个数、折芦、整体根型和"堆花芦"的形态来判断人参的生活轨迹，考虑人参的休眠、 损伤生长情况以后，由经验足的老药工判断个体的年限；产地栽培人参年限普遍较短（5? 20年），是根据芦碗数和参农经验来判断年限。然而，不管哪一种鉴别都具有商业夸大成分 在里面，真正的将人参年限鉴别量化、数字化的研究不成系统也不能被人认可。
[0004] 近年来，随着分子生物学的发展，通过分子手段用来检测人参的年限已成为了一 个突破口。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR技术利用人参相对端粒长度鉴 别人参年限的方法。
[0006] 本发明所提供的鉴别人参年限的方法，具体可包括如下A和B的步骤：
[0007] A.按照包括如下步骤（al)-(a4)的方法获得用于鉴别人参年限的数学模型： [0008] (al)取若干已知年限人参位于芦头以下1?2cm处的样品，分别提取基因组DNA;
[0009] 在本发明中，所述若干已知年限人参具体为：年限为2-6年的人参。
[0010] (a2)以步骤（al)获得的若干已知年限人参的基因组DNA分别作为模板，用特异于 人参端粒的引物对1进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T;用特 异于人参单拷贝基因的引物对2进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷贝基因的 Ct值，记为S;
[0011] 其中，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，荧光 阈值设定为PCR3-5 (如4)个循环荧光信号标准差的10倍。
[0012] (a3)针对每个已知年限人参，计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因 的Ct值之间的比值，即τ/s比值；
[0013] (a4)以所述若干已知年限人参的年限数值为横坐标（X)，以对应的所述Τ/S比值 为纵坐标（y)，制作线性标准曲线，所得线性标准曲线方程即为所述用于鉴别人参年限的数 学模型；
[0014]B.采用步骤A所得数学模型按照包括如下步骤（bl)-(b2)的方法对待测人参的年 限进行鉴别：
[0015] (bl)按照步骤（al)_(a3)进行操作，仅采用所述待测人参替代所述若干已知年限 人参，获得所述待测人参的T/S比值；
[0016] (b2)将步骤（bl)获得的所述待测人参的T/S比值代入步骤A获得的所述数学模 型中，从而获得所述待测人参的年限。
[0017] 在所述方法中，所述引物对1具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链 DNA组成的引物对。
[0018] 在所述方法中，所述人参单拷贝基因为PGKl基因。
[0019] 进一步，所述引物对2具体为由序列表中序列3和序列4所不的两条单链DNA组 成的引物对。
[0020] 在所述方法的步骤（al)中，所取的所述样品的量可为干重0.1?Ig(如 10_50mg)。
[0021] 在本发明的一个实施例中，所述基因组DNA的提取方法具体为CTAB法。
[0022] 在所述方法的步骤（a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的退火 温度具体为56°C;用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度具体为58°C。
[0023] 更加具体的，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的反应程序为：95°C预 变性30s ;95°C变性5s，56°C退火及延伸34s，循环25次。用所述引物对2进行实时荧光定 量PCR扩增时的反应程序为：95°C预变性30s ;95°C变性5s，58°C退火及延伸34s，循环40 次。
[0024] 在所述方法的步骤（a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时，作为 上游引物的序列表中序列1所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列2所示 的单链DNA分子的摩尔比为1:3 ;用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游 引物的序列表中序列3所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列4所示的单链 DNA分子的摩尔比为1:1。
[0025] 进一步，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中 序列1所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度为0. 1μmol/L，作为下游引物的序列表 中序列2所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度为0. 3μmol/L。用所述引物对2进行 实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列3所示的单链DNA分子和作为下 游引物的序列表中序列4所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度均为0. 2μmol/L。
[0026] 用所述引物对1和所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为模板的所述 基因组DNA的用量均可为5-50ng(如14ng)。
[0027] 更加具体的，在本发明的一个实施例中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR 扩增时的反应体系（10μ1)为：5μISYBRPremixExTaq? (2X)、0· 1μIROXReference DyeUpmol上游引物、3pmol下游引物、14ng基因组DNA、水补足至10μI;用所述引物对2 进行实时荧光定量PCR扩增时的反应体系（10μ1)为：5μISYBRPremixExTaq?(2X)、 0·2μIROXReferenceDye、2pmol上游引物、2pmol下游引物、14ng基因组DNA、7jC补足至 10μ1〇
[0028] 在本发明的一个实施例中，所述方法的步骤A获得的所述数学模型具体为如下公 式I:
[0029] y = 0. 243x+0. 407 公式 I
[0030] 式中，X代表人参年限，y代表所述T/S比值。
[0031] 其中，所述T/S比值即可表示人参相对端粒长度。
[0032] 即本发明所提供的方法，具体包括如下步骤：
[0033] (1)取待测人参位于芦头以下1?2cm处的样品，提取基因组DNA;
[0034] (2)取步骤（1)提取的基因组DNA作为模板，用特异于人参端粒的引物对1 (序列 1和序列2)进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T;用特异于人参 单拷贝基因的引物对2 (序列3和序列4)进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷 贝基因的Ct值，记为S;
[0035] (3)计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因的Ct值之间的比值，即T/S 比值；
[0036] (4)将步骤（3)获得的T/S比值作为y值代入公式I，所得X值即为所述待测人参 的年限；
[0037] y = 0. 243x+0. 407 公式 I
[0038] 式中，X代表人参年限，y代表T/S比值。
[0039] 对于本发明所提供的方法，所述待测人参需为年限在2年以上（如2-6年）的人 参。
[0040] 本发明根据人参端粒5' -TTTAGGG-3'重复序列，设计特异性引物，利用qPCR快 速准确的优点，建立了一种SYBRGreenI染料嵌合的QPCR方法，用于人参相对端粒长度 的快速检测，进而建立数学模型得出人参相对端粒长度与人参年限之间的公式。结果表明 该方法测定的人参年限与实际年限吻合度极高，而且该方法低成本，高通量，相比于传统的 Southern印迹法测量人参端粒长度（TRF值），此技术对DNA的需求量更少，试验周期更短。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为两步qPCR的S形扩增曲线。在上方的曲线集合是表示端粒引物qPCR的扩 增曲线，下方是空白对照，若干曲线是不同的重复。
[0042] 图2为两步qPCR的溶解曲线。A是端粒引物qPCR的溶解曲线，若干曲线是不同重 复。B是单拷贝基因qPCR的溶解曲线，若干曲线是不同重复。
[0043] 图3为用于鉴定人参年限的数学模型。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到
[0046] 台式高速离心机（Eppendorf公司）、Olympms突光显微镜、WFJUnic 7200spectrophotometer、BS2202S型电子天平（Startorius公司）、SIM-F124 型制冰机 (SANYO公司）、4KBTXL-75型真空冷冻干燥机（Virtis公司）；680X凝胶成像分析系统（基 因有限公司）、PAGE凝胶电泳仪、CS101-2A电热干燥箱、SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予 化仪器有限公司）；RetschMM400磨样机、5810R型低温冷冻离心机、7500实时荧光定量PCR 仪（北京欧比特仪器有限公司）。
[0047] UNIQ-10柱式DNA纯化试剂盒（上海生工）、buffer3 :100mMTris-Cl、100mMNaCl、 SYBR?PremixExTaq?II(宝生物工程）。
[0048] 实施例1、利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的建立
[0049] 供试人参：来自两个地区不同年限的人参样品，详见表1。
[0050] 表1两个地区不同年限的人参样品
[0051]
【权利要求】
1. 一种鉴别人参年限的方法，包括如下A和B的步骤： A. 按照包括如下步骤（al)_(a4)的方法获得用于鉴别人参年限的数学模型： (al)取若干已知年限人参位于芦头以下1?2cm处的样品，分别提取基因组DNA ; (a2)以步骤（al)获得的若干已知年限人参的基因组DNA分别作为模板，用特异于人 参端粒的引物对1进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T ;用特异 于人参单拷贝基因的引物对2进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷贝基因的Ct 值，记为S; (a3)针对每个已知年限人参，计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因的Ct 值之间的比值，即T/S比值； (a4)以所述若干已知年限人参的年限数值为横坐标，以对应的所述T/S比值为纵坐 标，制作线性标准曲线，所得线性标准曲线方程即为所述用于鉴别人参年限的数学模型； B. 采用步骤A所得数学模型按照包括如下步骤（bl)-(b2)的方法对待测人参的年限进 打鉴别： (bl)按照步骤（al)_(a3)进行操作，仅采用所述待测人参替代所述若干已知年限人 参，获得所述待测人参的T/S比值； (b2)将步骤（bl)获得的所述待测人参的T/S比值代入步骤A获得的所述数学模型中， 从而获得所述待测人参的年限。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对1为由序列表中序列1和序 列2所示的两条单链DNA组成的引物对。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述人参单拷贝基因为PGK1基因。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述引物对2为由序列表中序列3和序 列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤（al)中，所取的所述样品 的量为干重〇. 1?lg。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤（a2)中，用所述引物对1进 行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度为56°C ;和/或 用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度为58°C。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤（a2)中，用所述引物对1进 行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列1所示的单链DNA分子与作为 下游引物的序列表中序列2所示的单链DNA分子的摩尔比为1:3 ;和/或 用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列3所示 的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列4所示的单链DNA分子的摩尔比为1:1。
8. 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤A获得的所述数学模型为 如下公式I : y = 0? 243x+0. 407 公式 I 式中，x代表人参年限，y代表所述T/S比值。
9. 根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述待测人参为年限在2年以 上的人参。
【文档编号】C12Q1/68GK104357560SQ201410602212
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】黄璐琦, 蒋超, 袁媛, 王尧龙 申请人:中国中医科学院中药研究所