适配体磁富集和rca双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用的制作方法

适配体磁富集和rca双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用的制作方法
【专利摘要】适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用。本发明公开了一种用于白血病细胞检测的探针组及其应用。本发明所提供的用于白血病细胞检测的探针组由如下a)和b)组成：a)磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列1所示的单链DNA分子；b)检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列3所示的单链DNA分子；所述检测探针是由所述磷酸标记的锁式探针环化后与所述靶序列结合而成。实验证明，本发明实现了高特异性和高灵敏的检测，能从200万个正常人外周血细胞中检测出100个白血病细胞，灵敏度达到两万分之一。
【专利说明】适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料的临床医学应用领域，涉及一种适配体磁富集和RCA双信号 放大检测肿瘤细胞方法及应用，特别涉及一种用于检测白血病细胞的基于磁富集和RCA双 信号放大的探针组及其应用。

【背景技术】
[0002] 白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分 化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官， 同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和 骨骼疼痛。
[0003] 白血病是我国的高发肿瘤之一，其分型诊断需要联合形态学、免疫表型、细胞遗传 学和分子生物学等各种手段。由于细胞形态的多样性，单纯依靠形态学检查很难准确分型； 也未发现白血病细胞特异性单克隆抗体，白血病作为一种高度异质性疾病，抗原表达有时 较紊乱，跨系列表达较为常见，部分白血病相关抗原在治疗过程中或复发时会丢失或发生 系列转换；利用细胞遗传学（染色体核型和显带）与分子生物学的检查方法，使诊断的客观 性和准确率明显提高，但只有40%的急性淋巴细胞白血病（ALL)有染色体的异常，而且各 种临床亚型并没有对应特异性染色体异常，另外、这些检查耗时、成本高，使之普及性有一 定难度。


【发明内容】

[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于白血病细胞检测的探针组。
[0005] 本发明所提供的用于白血病细胞检测的探针组，具体由如下（a)和（b)组成：
[0006] (a)磁珠捕获探针；
[0007] 所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针（适配体）组成；所述 捕获探针为序列表中序列1所不的单链DNA分子；
[0008] (b)检测探针或所述检测探针的前体；
[0009] 所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表 中序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3 所不的单链DNA分子；
[0010] 所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。
[0011] 所述检测探针具体可按照包括如下步骤的方法由所述检测探针的前体制备得到 的：将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针按照摩尔比为1 : (2-4)(如1 :3)的比例混 合，95°C孵育 5-10min (如 IOmin)后，加入 DNA 连接酶 15-20°C (如 16°C)孵育 10_16h (如 12h)，得到所述检测探针。
[0012] 更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述检测探针的制备方法如下：（1)将所 述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针均用结合缓冲液（溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 ·6Η20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/ L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖4. 5g/L)配成5 μ M浓度，然后将所得靶序列溶液、磷酸标记的锁式 探针溶液和无菌水按照体积比为1 :3 :6的比例混合，95°C加热10分钟，缓慢冷却至25°C ; ⑵向步骤⑴的体系中加入E. coli DNA连接酶，至其终浓度为0.04υ/μ1，16?孵育12h。
[0013] 所述磁珠捕获探针具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：将经生物素标记的 所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探针。
[0014] 在本发明中，所述生物素具体标记于所述捕获探针的3'端。
[0015] 所述方法中，进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标 记的所述磁珠的配比为75pmol :lmg。
[0016] 进一步，所述孵育具体为20-30°C (如25°C )80-150rpm(如IOOrpm)震荡孵育 10-30(如15min)。所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶 质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 · 6H20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
[0017] 更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述磁珠捕获探针的制备方法包括如下 步骤：分别取浓度为500nM(以DNA计量）的经生物素标记的所述捕获探针的溶液（溶剂 为所述结合缓冲液）和浓度为l〇mg/ml (以磁珠计量）的经链霉亲和素标记的所述磁珠 溶液（溶剂为所述结合缓冲液），按照体积比3:2的配比混合，20-30°C (如25°C )80? 150rpm(如IOOrpm)震荡孵育10-30min(如15min)，即获得所述磁珠捕获探针。
[0018] 含有所述探针组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0019] 所述试剂盒中还含有分子信标；所述分子信标为由一端带有荧光基团，另一端带 有淬灭基团，核苷酸序列为序列表中序列4所示单链DAN分子形成的颈环结构。
[0020] 在本发明中，所述分子信标的5'端标记有荧光基团FITC，3'端标记有淬灭基团 DABCYL。
[0021] 所述探针组，或所述试剂盒，在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0022] (a)制备用于白血病细胞检测的试剂盒；
[0023] (b)制备用于白血病病情监测的试剂盒。
[0024] 在本发明中，所述白血病细胞检测为从待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋 巴细胞中检测白血病细胞。
[0025] 在所述应用中，进行所述白血病病情监测时，采用的待测样本可为待测者的外周 全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞。
[0026] 所述待测者可为白血病患者、健康的正常人、或患有其他疾病（如地中海贫血、骨 髓异常增多症、或缺铁性贫血）的非白血病患者。
[0027] 在本发明中，所述白血病具体为急性淋巴细胞白血病（ALL)，如急性T淋巴细胞白 血病（T-ALL)。
[0028] 前文所述检测探针或所述检测探针的前体也属于本发明的保护范围。
[0029] 本发明采用磁富集和滚环扩增（rolling circle amplification,RCA)双重信号放 大方式形成了一种高特异性和高灵敏的肿瘤细胞检测方法。磁珠捕获探针能从大量对照细 胞中将微量的靶细胞富集，并从中分离出来，相对于离心分离技术，操作简便，不易丢失细 胞，有效减少了因细胞丢失而造成的信号降低；本发明还对反应时间等进行了优化，整个实 验是在优化范围内最好的条件下进行的；为了提高适配体探针检测的灵敏性，本发明将检 测探针检测信号经RCA信号放大。本发明还采用了分子信标做信号报告分子，该分子信标 的环状部分能与RCA产物的重复序列完全互补。只有发生了 RCA反应，RCA的长链产物有部 分序列与分子信标杂交，使分子信标自身杂交打开，突光信号才能得以恢复。分子信标的使 用明显降低了背景荧光，提高了检测的灵敏度。另外，本发明在均相中进行，相比界面反应 来说，细胞与适配体之间有更多的接触机会，保证了反应更加快速和完全。由于以上原因， 本发明实现了高特异性和高灵敏的检测，能从200万个正常人外周血细胞中检测出100个 白血病细胞，灵敏度达到两万分之一。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1为联合磁珠捕获探针和检测探针的RCA反应信号放大电泳检测结果及荧光仪 检测结果。A为电泳成像结果；B为荧光仪检测结果。
[0031] 图2为荧光显微镜观察细胞上RCA扩增的情况。左侧图片为光学显微镜下观察， 右侧为荧光显微镜下观察。A、B :为RCA反应后0分钟；C、D :为RCA反应后10分钟；E、F :为RCA反应后30分钟；G、H :为RCA反应后60分钟；I、J :为RCA反应后90分钟；K、L为RCA 反应后120分钟。
[0032] 图3为流式细胞所检测细胞上RCA扩增的情况。A为流式细胞仪检测CEM细胞上 RCA扩增效果；为流式细胞仪检测Ramos细胞上适配体RCA扩增效果；C为CEM和Ramos几 何平均荧光强度比较柱状图。
[0033] 图4为FITC标记的捕获探针与联合磁珠捕获探针和检测探针检测CEM细胞RCA 信号放大效果比较图。
[0034] 图5为联合磁珠捕获探针和检测探针对CEM细胞特异性的捕获图。A为空白磁珠； B为捕获探针对Ramos细胞的捕获；C为捕获探针对293-T细胞的捕获；D为捕获探针对CEM 细胞的捕获。
[0035] 图6为联合磁珠捕获探针和检测探针对CEM细胞特异性检测荧光显微镜结果图。 左侧图片为明场图，右侧图片为荧光成像图。A、B为空白磁珠；C、D为Ramos细胞；E、F为 293T细胞；G、H为CEM细胞。
[0036] 图7为联合磁珠捕获探针和检测探针对CEM细胞特异性检测荧光光谱图。
[0037] 图8为联合磁珠捕获探针和检测探针对CEM细胞系与T-ALL患者淋巴细胞捕获结 果比较显微镜成像图。A为CEM细胞系捕获前；B为CEM细胞系捕获后；C为T-ALL患者外 周血淋巴细胞捕获前；D为T-ALL患者外周血淋巴细胞捕获后。
[0038] 图9为联合磁珠捕获探针和检测探针检测白血病微残留小病变结果（RQ-PCR仪检 测结果）。图中，线条1表示〇个CEM细胞；线条2表示50个CEM细胞；线条3-6分别表示 100、500、1000、2000 个 CEM 细胞。
[0039] 图10为联合磁珠捕获探针和检测探针对白血病患者外周全血细胞的检测结果。A 为外周全血检测结果荧光光谱图；B为健康正常人与ALL患者外周全血检测结果差异性比 较图。
[0040] 图11为ALL患者治疗前后不同时间点外周血检测结果（RQ-PCR仪检测结果）。

【具体实施方式】
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] CEM细胞（人T淋巴细胞白血病细胞）：购自上海丰寿生物科技有限公司，货号：Cell-3720。
[0044] Ramos细胞（人B淋巴瘤细胞）：购自上海拜力生物科技有限公司，货号：RAM0S。
[0045] 293T细胞（Sv40转化的人胚肾上皮细胞）：购自上海拜力生物科技有限公司，货 号：293T。
[0046] 实施例1、用于白血病细胞检测的探针组的制备
[0047] 一、磁珠捕获探针的制备
[0048](一）经生物素标记的捕获探针的制备
[0049] 所述生物素标记的捕获探针为生物素标记的单链DNA分子，为中国大连宝生物公 司产品，该探针所用的单链DNA序列如下所示：
[0050] 5 ' -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAA-3 '（序列 1)，其中生物 素标记分子在核酸链的3'端。
[0051] (二）经链霉亲和素标记的磁珠
[0052] 所述链霉亲和素标记的磁珠为Invitrogen公司生产的Dynabeads链霉亲和素磁 珠 Μ280,该磁珠的具体参数如下：如磁珠平均直径2. 8μπι、表面积：4-8m2/g、密度：1. 4g/ cm3、磁珠含量：10mg/ml、等电点：pH 5.0、低电荷：-10mV(pH 7)、CV值〈3%、铁含量（铁氧 体）：12% (17% )。
[0053] (三）磁珠捕获探针的制备
[0054] 1、将步骤（一）中获得的经生物素标记的捕获探针用结合缓冲液配制成浓度为 500nM(以DNA计量）的溶液。其中，结合缓冲液的组成如下（以IL溶液为例）：NaCl 8g， KCl 0· 2g，CaCl2O. 14g，Na2HPO4 · H2O 0· lg，MgCl2 · 6H20 I. 42g，NaHCO3O. 35g，KH2PO4O. 2g，葡 萄糖4. 5g;余量为水。
[0055] 2、取200 μ I步骤（二）获得的经链霉亲和素标记的磁珠（浓度为10mg/ml，以磁 珠的量计算），用结合缓冲液（配方同上）洗涤2次后，再将磁珠悬浮于200 μ 1的结合缓冲 液中。
[0056] 3、取300 μ 1步骤1获得的浓度为500ηΜ(以DNA计量）的经生物素标记的捕获探 针溶液与200 μ 1经步骤2处理的链霉亲和素标记的磁珠充分混匀后，于25°C IOOrpm震荡 孵育15分钟，置磁力架上，磁分离后，弃上清，所得沉淀用结合缓冲液（配方同上）重悬。
[0057] 4、用50 μ 1的结合缓冲液（配方同上）清洗两次，最后用200 μ 1结合缓冲液（配 方同上）重悬已固定有DNA的磁珠至10mg/ml (以磁珠计）。
[0058] 二、检测探针的制备
[0059] 1、设计并合成靶序列和磷酸标记的锁式探针
[0060] 靶序列为：
[0061] 5 J -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAA TGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC- 3'（序列 2);
[0062] 磷酸标记的锁式探针为（5' -3'）：
[0063] P03-TAGCACGGACATATATGATGGTACCGCAGACTAAGCCACCGTGATCACT ACTAAGTGGAAGAAA TGTAACTGTTTCCTTC (序列 3)。
[0064] 2、靶序列和磷酸标记的锁式探针均用结合缓冲液（配方同上）配成5μΜ浓度，将 靶序列溶液、磷酸标记的锁式探针溶液和无菌水按照体积比为1 :3 :6的比例混合，95°C加 热10分钟，缓慢冷却至25°C。此步骤的目的是让靶序列和锁式探针结合。
[0065] 3、向步骤2的体系（20μ1)中加入4.5μ1大肠杆菌连接酶反应溶液（含 IOXligase Buffer 2μ1，10XBSA 2μ1，Ε· coli DNA 连接酶 0·5μ1(浓度为 2U/μ 1)， 16°C过夜孵育（12h)。此步骤的目的是让锁式探针连接成环。
[0066] 实施例2、用于白血病细胞检测的探针组的应用实例
[0067] -、细胞的捕获和突光信号的检测
[0068] I、RCA反应随反应时间信号放大情况检测
[0069] A.待检细胞：CEM细胞（人T淋巴细胞白血病细胞）。
[0070] (1)取4μ 1浓度为10mg/ml (以磁珠计）的实施例1步骤一获得的磁珠捕获探针 和4μ 1浓度为500nM(以DNA计量）的实施例1步骤二获得的检测探针混勻，加入待检细 胞25 °C孵育25分钟。
[0071] (2)用结合缓冲液（配方同上）洗涤2次，将细胞悬浮于30. 1μ 1的结合缓冲 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反应液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信标 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反应30min后进行琼脂糖凝胶电泳检测及突光仪检测，反应的第 Omin、10min、30min、60min、90min和120min分别进行突光显微镜观察。
[0072] 其中，分子信标的核苷酸序列为：5' -TC TAC GG CAC TAC TAA GTG GAA GCC GTA GA-3'（序列 4)。
[0073] 分子信标的5'端标记有荧光基团FITC，3'端标记有淬灭基团DABCYL。
[0074] 琼脂糖凝胶电泳检测及荧光仪的检测结果如图1所示，图1中的A可以看到在琼 脂糖凝胶的出孔处可见明亮的条带，表明形成了分子量很大的RCA产物；图1中的B可以看 到RCA产物和分子信标杂交后可产生大量的突光信号。
[0075] 荧光显微镜观察结果如图2所示，可以看到，细胞上荧光强度随着滚环放大反应 时间的增加而增强，表明联合磁珠捕获探针和检测探针可以在细胞上进行RCA扩增，且随 着时间的延长，产物逐渐增多。当滚环放大反应时间维持60分钟左右时，可以观察到细胞 荧光，120分钟时荧光最强。
[0076] B.待检细胞：CEM细胞（人T淋巴细胞白血病细胞）和Ramos细胞（人B淋巴瘤 细胞）。
[0077] (1)参照A中⑴进行。
[0078] (2)参照 A 中（2)进行，反应的第 Omin、10min、30min、60min、90min 和 120min 分别 采用流式细胞仪对荧光信号进行检测。
[0079] 实验同时设置采用FITC标记的捕获探针（FITC-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATA CTGTACGGTTAGAAAAAA)替代探针组和分子信标的对照。具体如下：取4μ 1浓度为500nM(以 DNA计量）的FITC标记的捕获探针，加入待检细胞25°C孵育25分钟。用结合缓冲液（配 方同上）洗涤2次，将细胞悬浮于32. 1μ 1的结合缓冲液（配方同上）中，加入7· 9μ 1 Phi29DNA 聚合混合反应液（10XPhi 29DNA polymerase Buffer 4μ I ;100XBSA 0·4μ I ; 2. 5mM dNTP 3μ I ;Phi29DNA polymerase 0· 5μ I)，30°C 反应 I. 5 小时后采用流式细胞仪对 荧光信号进行检测。
[0080] 实验同时设置以空白磁珠替代磁珠捕获探针的空白对照。
[0081] 实验组中，CEM细胞和Ramos细胞随着反应时间的进行，流式细胞所检测到的荧光 信号具体如图3所示。可以看到随着时间的延长，CEM细胞荧光强度逐渐增强（图3中A)， 而Ramos细胞荧光强度变化不大（图3中B);随着时间延长，实验组CEM细胞FITC-A Gea Mean成倍增加，RCA扩增120分钟时，几何平均荧光强度增至空白对照的近40倍，对照组 Ramos细胞无明显增加（图3中C)。以上结果表明CEM细胞的荧光强度明显强于Ramos细 胞，联合磁珠捕获探针和检测探针能有效的用于靶细胞的特异性检测。
[0082] 另外，与FITC标记的捕获探针和CEM细胞结合相比，捕获探针经滚环扩增1. 5小 时后的样品（即本发明探针组处理样品）曲线明显右移（图4)。表明联合磁珠捕获探针和 检测探针检测信号经RCA后信号明显放大。
[0083] 2、联合磁珠捕获探针和检测探针对捕获白血病细胞的特异性分析
[0084] 待检细胞：CEM细胞（人T淋巴细胞白血病细胞）、Ramos细胞（人B淋巴瘤细胞） 和293T细胞（Sv40转化的人胚肾上皮细胞）。
[0085] (1)参照步骤IA中（1)进行。
[0086] (2)参照步骤IA中（2)进行，反应25min后采用光镜和荧光显微镜对各细胞的捕 获情况进行观察，并采用荧光仪对各组的荧光信号强度进行检测。
[0087] 实验同时设置以空白磁珠替代磁珠捕获探针的对照。
[0088] 光镜观察结果如图5所示，可以看到CEM细胞周围可见磁珠，而其他的细胞未被捕 获或者细胞周围未见磁珠，表明捕获探针只捕获CEM细胞。
[0089] 荧光显微镜观察结果如图6所示，可以看到，空白磁珠、Ramos和293T细胞样品均 未见明显荧光，而CEM细胞样品中可见磁珠及细胞均有荧光信号。表明联合磁珠捕获探针 和检测探针可以实现CEM细胞特异性检测。
[0090] 荧光光谱图如图7所示，可以看到，CEM细胞样品的荧光信号明显强于293T细胞 和Ramos细胞。表明联合磁珠捕获探针和检测探针可以实现CEM细胞特异性检测。
[0091] 二、联合磁珠捕获探针和检测探针对白血病患者淋巴细胞的检测
[0092] 待测样本：取自临床确认为健康正常人的外周全血，以及取自临床确诊为T-ALL 患者的外周全血。
[0093] 向待测的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血样本），混匀，使血液抗凝。 然后按照如下步骤进行操作：
[0094] (1)淋巴细胞的获取：用pH 7. 2的PBS将Iml的抗凝血按照体积比1 :1进行稀 释；吸取Iml淋巴细胞分离液（Solarbio公司产品，其产品目录号为P8610)置于刻度离心 管中。将稀释的全血沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液上面；在18°C?20°C下，用水平离心 机以2000r/min离心20min，收集PBMC，用PBS液洗涤细胞3次，每次1600rpm，离心10分 钟。用结合缓冲液（配方同上）重悬细胞，混匀，计数后加入完全1640培养基，移至6孔培 养板中培养30?45min，收集悬浮细胞即为淋巴细胞。
[0095] (2)分别取IX IO6淋巴细胞，置于96孔板中。
[0096] (3)取4 μ 1浓度为lOmg/ml (以磁珠计）的实施例1步骤一获得的磁珠捕获探针 和4μ 1浓度为500nM(以DNA计量）的实施例1步骤二获得的检测探针混勻，加入待检细 胞25 °C孵育25分钟。
[0097] (4)用结合缓冲液（配方同上）洗涤2次，将细胞悬浮于30. 1μ 1的结合缓冲 液（配方同上）中，加入9.9ylPhi29DNA聚合混合反应液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信标 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反应120min，然后用突光显微镜进行观察。
[0098] 实验同时设置以GEM细胞替代白血病患者淋巴细胞的对照。
[0099] 结果如图8所示，可以看到，联合磁珠捕获探针和检测探针对GEM细胞和白血病患 者淋巴细胞的捕获相似。表明可以利用CEM细胞建立微小残留病变模型。
[0100] 三、微小残留病变模型的建立和微小病变的检测
[0101] 1、微小残留病变模型的建立
[0102] 将50、100、500、1000、2000个CEM细胞分别与临床确认为健康正常人的淋巴细胞 混合建立微小病变模型，使细胞总数达200万个，得到微小残留病变模型。
[0103] 2、微小病变的检测
[0104] 待检细胞：微小残留病变模型细胞。
[0105] (1)参照步骤一 IA中（1)进行。
[0106] ⑵参照步骤一 IA中⑵进行，反应25min后，采用RQ-PCR仪对各组的荧光信号 强度进行检测。
[0107] 实验同时设置添加了 0个CEM细胞（即200万个细胞均为健康正常人的淋巴细 胞）的正常人组。
[0108] 结果如图9所示，可见100个CEM细胞以上的微小残留病变模型的荧光强度均明 显高于正常人对照，检测灵敏度达2X10'实验重复三次得到同样的结果。
[0109] 四、联合磁珠捕获探针和检测探针对白血病患者外周全血细胞的检测
[0110] 待测样本：取自临床确认为健康正常人的外周全血，以及取自临床确诊为T-ALL 患者的外周全血。
[0111] 向待测的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血样本），混匀，使血液抗凝。 然后按照如下步骤进行操作：
[0112] (1)分别取健康正常人和T-ALL患者经过抗凝处理的外周全血100 μ 1，IOOOrpm离 心5分钟，弃上清，从离心管底部吸弃大部分的红细胞，加入2ml的结合缓冲液中（配方同 上）洗涤3次，最终将细胞悬浮于100 μ 1的结合缓冲液中（配方同上），待用。
[0113] (2)取4μ 1浓度为10mg/ml (以磁珠计）的实施例1步骤一获得的磁珠捕获探 针，加入到20 μ 1步骤（1)最终获得的细胞悬浮液中，25°C孵育25分钟。缓慢加入100? 200 μ 1的结合缓冲液（配方同上）洗涤2-3次，加入2 μ 1浓度为500nM (以DNA计量）的 实施例1步骤二获得的检测探针，25 °C孵育25分钟。
[0114] (3)用结合缓冲液（配方同上）洗涤2次，将细胞悬浮于30. 1μ 1的结合缓冲 液（配方同上）中加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反应液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信标 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反应2小时后采用突光仪对各组的突光信号进行检测。
[0115] 结果如图10所示，可以看到，经联合磁珠捕获探针和检测探针检测，ALL患者全血 的荧光强度明显较正常人增强（图10中A)，且差异有统计学意义，P < 0. 01 (图10中B)。 表明联合磁珠捕获探针和检测探针检测技术可以特异性检测白血病细胞。
[0116] 五、联合磁珠捕获探针和检测探针用于白血病病情监测
[0117] 待测样本：取自临床确诊为T-ALL患者化疗前、化疗开始3天、4天和第13天的外 周全血。
[0118] 向待测的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血样本），混匀，使血液抗凝。 然后按照如下步骤进行操作：
[0119] (1)同步骤四（1)。
[0120] (2)同步骤四（2)。
[0121] (3)用结合缓冲液（配方同上）洗涤2次，将细胞悬浮于30. 1μ 1的结合缓冲 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反应液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信标 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5μ 1)，30°C反应2小时，采用RQ-PCR仪对各组的荧光信号强度进行检测。
[0122] 结果如图11所示，可以看到，随着治疗时间的延长，荧光信号逐渐减弱。表明本发 明的检测技术可以用于白血病病情的动态监测。
【权利要求】
1. 一种用于白血病细胞检测的探针组，由如下（a)和（b)组成：(a) 磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列 表中序列1所不的单链DNA分子；(b) 检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表中序 列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3所示 的单链DNA分子；所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。
2. 根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述检测探针是按照包括如下步骤的 方法由所述检测探针的前体制备得到的：将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针按照摩 尔比为1 :(2-4)的比例混合，95°C孵育5-10min后，加入DNA连接酶15-20°C孵育10_16h， 得到所述检测探针。
3. 根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于：所述磁珠捕获探针按照包括如下 步骤的方法制备得到：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共 同孵育，获得所述磁珠捕获探针。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的探针组，其特征在于：进行所述孵育时，经生物素标 记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠的配比具体为75pmol :lmg ; 所述孵育具体为20-30°C 80-150rpm震荡孵育10-30min ;所述孵育的液体环境具体为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度 如下：NaC18g/L，KC10. 2g/L，CaCl20. 14g/L，Na2HP04 ? H200. lg/L，MgCl2 ? 6H201. 42g/L， NaHC030 . 35g/L，KH2P040. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
5. 含有权利要求1-4中任一所述的探针组的试剂盒。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有分子信标； 所述分子信标为由一端带有荧光基团，另一端带有淬灭基团，核苷酸序列为序列表中序列4所示单链DAN分子形成的颈环结构。
7. 权利要求1-4中任一所述的探针组，或权利要求5或6所述的试剂盒，在如下任一中 的应用： (a) 制备用于白血病细胞检测的试剂盒；(b) 制备用于白血病病情监测的试剂盒。
8. 根据权利要求1-8中任一所述的探针组或试剂盒或应用，其特征在于：所述白血病 细胞检测为从待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞中检测白血病细胞。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：进行所述白血病病情监测时，采用的待测 样本为待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞。
10. 权利要求1中所述的检测探针或所述检测探针的前体。
【文档编号】C12Q1/68GK104388549SQ201410605342
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】赵永祥, 李霞, 卢小玲, 黄勇 申请人:广西医科大学