本发明涉及免疫检测领域，具体为多重抗体免疫磁珠富集检测ctcs的方法。
背景技术：
检测循环肿瘤细胞有助于早期发现患者体内的肿瘤、监测患者术后体内是否出现肿瘤复发或转移、评估预后进而选择合适的治疗策略，尽早帮助患者治疗。近年来，检测循环肿瘤细胞的方法集中在免疫细胞疗法、逆转录聚合酶链反应、流式细胞术、免疫磁珠富集检测法等，但这些方法都存在不同方面的检测缺陷：
1、免疫细胞疗法：
免疫细胞疗法的原理是将特异性抗体用显色剂标记，之后通过在组织细胞原位进行抗原抗体反应以及细胞进行化学呈色，对相应的目的抗原定位、定性以及定量检测分析的技术方法。免疫细胞疗法的缺点是：检测到的细胞数量很少，灵敏度仅为105-106。因为免疫细胞化学检测循环血液中的肿瘤细胞时，每个载玻片上可检测的细胞样品量仅为5×105个细胞。但是检测肿瘤细胞的理想方法应该能够检测来自2.5×108外周血有核细胞的单个肿瘤细胞。那么，从2.5×108个有核血细胞中筛选肿瘤细胞需要制备和分析约500个载玻片，因此免疫细胞化学检测率低，难以从外周血中的大量单核细胞中检测到非常少量的循环肿瘤细胞，简单的免疫细胞疗法不能用于肿瘤患者循环肿瘤细胞的临床检测。
2、逆转录聚合酶链反应：
逆转录聚合酶链反应是在逆转录酶的作用下合成与标记的mrna互补的cdna，然后以cdna为模板pcr周期扩增，进而制备大量的所需要的cdna片段，大大提高了灵敏度。逆转录聚合酶链反应检测方法的缺点是：由于目的mrna的非特异性表达、标本和pcr产物的污染，pcr扩增条件的不正确控制以及非特异性细胞的非法转录水平低，逆转录聚合酶链反应方法的检测结果具有高假阳性率。同时，逆转录聚合酶链反应的测试过程复杂，测试耗时较长。因此，逆转录聚合酶链反应在循环肿瘤细胞的检测中可能缺乏某些特异性，这限制了其临床诊断使用价值。
3、流式细胞术：
流式细胞术是一项应用激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型技术。流式细胞术检测循环肿瘤细胞的缺点是使用流式细胞术检测循环肿瘤细胞的价值在很大程度上取决于可以分析的细胞数量。通过流式细胞术检测的靶细胞的灵敏度仅为1/104，而外周血中的肿瘤细胞的数量通常小于1/106。
技术实现要素：
针对现有技术上出现的灵敏度低、检测率低、测试过程复杂、测试耗时较长、假阳率高等问题，本发明利用多重抗体免疫磁珠结合流式细胞术的方法检测循环肿瘤细胞可以大大改善这一系列检测缺陷。
本发明提供如下技术方案：一种多重抗体免疫磁珠富集检测ctcs的方法，包括如下步骤：
s1.抗体与磁珠偶联：
1)抗体偶联前，在4度下，经过三次透析，过夜，储存在pbs中，将浓度调整到7μmol/l、14μmol/l、21μmol/l、28μmol/l；
2)纳米免疫磁珠的制备：
取4份300μl浓度为2mg/ml活化的羧基磁珠，分别加入40ul1μmol的hla-g抗体、2μmolck8/18抗体、2μmolepcam抗体、2μmolher-2抗体，混合在1ml的离心管中，于室温下混合3h，用1mlpbs缓冲液做清洗液清洗三次，加入300μl0.25mol/l甘氨酸混合25min，封闭剩余的醛基；再用1mlpbs缓冲液做清洗液清洗三次；加入含有质量百分比2.5％bsa的pbs溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，再用1ml清洗液(pbs缓冲液)清洗三次，加入300μlpbs缓冲液漩涡震荡，即得到1：2:2:2比例混合的多重抗体免疫磁珠；
s2.制备循环肿瘤细胞样品：
1)实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞，100μl，加入1.5ml离心管中，将肿瘤细胞于外周血中制成人工样本，每种细胞为三管；
2)取5μl上述制备好的各种肿瘤细胞与5ml健康人血液混合，每种细胞制备三管；
3)取适量免疫磁珠，加入100ul生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，pbs清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于pbs溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；
4)将适量纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，pbs清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于pbs中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用fict,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记epcam鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。
作为优选，所述纳米免疫磁珠的制备的反应条件为：反应介质为0.01mpbs，ph＝7.4，温度为室温，反应时间为3h，抗体和磁珠质量比为200μg：1000μg。
作为又一优选，所述肿瘤细胞为乳腺癌症(mcf-7)，食道癌(ec109)，非小细胞肺癌(a549)，子宫颈癌(hela)，胃癌(nci-n87)、结肠癌(ht29)。
综上所述，本发明的优点：本发明的有益效果：
1.多重抗体免疫磁珠是指将羧基磁珠分别与hla-g抗体、ck8/18抗体、epcam抗体、her-2抗体偶联得到hla-g免疫磁珠、ck8/18免疫磁珠、epcam免疫磁珠以及her-2免疫磁珠，多重抗体免疫磁珠利用了免疫磁珠分选法，其在羧基磁珠表面偶联包被抗体进行抗原抗体的特异性反应，形成羧基磁珠-抗原-抗体复合物，该复合物因为在强大的磁场下，由于磁珠的磁性会产生定向移动，将磁珠复合物和未被结合的细胞分开，因此捕获特定的肿瘤细胞，该方法富集能力强，富集时间短，捕获效率高，灵敏度强，结合流式细胞术检测循环肿瘤细胞可是大大改善传统检测循环肿瘤细胞方法上的一系列缺陷。
2、羧基磁性琼脂糖微球以交联琼脂糖为基质，拥有良好的刚性、磁响应性和单分散性，表面修饰有丰富的羧基(-cooh)，能够与含氨基的生物配体，如：蛋白质、抗体、寡聚核苷酸和药物分子等通过共价偶联的方法实现结合，特点是磁性分离速度快；高效，生物配基偶联效率可达85％以上；温和，室温或4℃偶联，偶联体系ph为5～6.5；良好的生物相容性，减少非特异性吸附。
纳米免疫磁珠偶联多重抗体结合流式细胞术富集检测法是对常规检测技术缺陷的很好补充,极大地提高了循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性。。
具体实施方式
实施例1：采用300nm羧基磁珠分别与1μmol的hla-g抗体、2μmolck8/18抗体、2μmolepcam抗体、2μmolher-2抗体偶联，在荧光倒置显微镜下进行计数，统计回收肿瘤细胞占富集前细胞总数的比例,计算免疫磁珠富集血液样品中肿瘤细胞效率。
具体试验步骤如下：
1.抗体与磁珠偶联：
1)抗体偶联前，在4度下，经过三次透析，过夜，储存在pbs中，将浓度调整到7μmol。
2)纳米免疫磁珠的制备：
取活化的羧基磁珠300μl，2mg/ml，分别加入40ul1μmol的hla-g抗体、2μmolck8/18抗体、2μmolepcam抗体、2μmolher-2抗体，混合在1ml的离心管中，于室温下混合3h，用1ml清洗液(pbs缓冲液)清洗三次，加入300μl0.25mol/l甘氨酸混合25min，封闭剩余的醛基；再用1ml清洗液(pbs缓冲液)清洗三次；加入含有质量百分比2.5％bsa的pbs溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，再用1ml清洗液(pbs缓冲液)清洗三次，加入300μlpbs缓冲液漩涡震荡，即得到1：2:2:2比例混合的多重抗体免疫磁珠。反应条件为：反应介质为0.01mpbs(ph＝7.4)；温度为室温；反应时间为3h，抗体和磁珠质量比为200μg：1000μg。
对上述羧基磁珠与多重抗体偶联的磁珠分别对人乳腺癌症(mcf-7)，食道癌(ec109)，非小细胞肺癌(a549)，子宫颈癌(hela)，胃癌(nci-n87)，结肠癌(ht29),进行捕获分离测试，检测捕获效果。
2.制备循环肿瘤细胞样品：
1)实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞，100μl，加入1.5ml离心管中，将肿瘤细胞于外周血中制成人工样本，每种细胞为三管；
2)取5μl上述制备好的各种肿瘤细胞与5ml健康人血液混合，每种细胞制备三管；
3)取适量免疫磁珠，加入100ul生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，pbs清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于pbs溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；
4)将适量纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，pbs清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于pbs中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用fict,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记epcam鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。
试验结果：
(1)富集人工样本肿瘤细胞1，统计结果如表1所示:
(2)富集人工样本肿瘤细胞2,统计结果如表2所示:
表3
(3)富集人工样本肿瘤细胞3,统计结果如表3所示:
(4)富集人工样本肿瘤细胞4,统计结果如表4所示:
试验结论：如表6所示，将各人工样本肿瘤细胞的平均捕获率进行比较，在300nm磁珠与1μmol的hla-g抗体、2μmolck8/18抗体、2μmolepcam抗体、2μmolher-2抗体偶联得到多重抗体免疫磁珠，通过六种肿瘤细胞捕获检测，对乳腺癌的效果最佳，其次非小细胞肺癌，食道癌，胃癌，子宫颈癌和结肠癌。