抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用的制作方法

抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用，具体为干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因，还公开了干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的制备表达载体和载体的制备方法，通过干扰LCYB、LCYE、MYB12和MYB111基因表达抑制黄色色素类胡萝卜素和黄酮醇，而异位表达TT8基因能够促进红色番茄红素和花青素苷积累，从而使花瓣呈红色，成功制备了花瓣显红色的芸薹属植物，丰富了芸薹属植物的花色。
【专利说明】抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青素苷在制备花 瓣呈红色芸薹属植物中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及抑制黄色色素积累同时积累番茄红素和花青 素苷在制备花瓣呈红色芸薹属植物中的应用。

【背景技术】
[0002] 油菜是重要的油料作物，栽培历史悠久、经济价值高、用途广泛、适应性强，是我国 的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物种分类学上，油菜由芸薹属的三个物种 构成，分别为甘蓝型油菜（Brassica napus，2η = 38, AACC)、白菜型油菜（Brassica rapa ssp. oleifera syn. B. campestris，2n = 20, AA)、芥菜型油菜（Brassica juncea，2n = 36， AABB)。甘蓝型油菜油菜是由白菜（Brassica rapa)与甘蓝（Brassica oleracea，2n = 18, CC)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，虽然栽培历史仅有几百年， 但由于其生长势强，丰产性高，已占世界及我国油菜种植面积90%的以上。白菜型油菜是 芸薹属最早被驯化的物种之一，原产于我国西北地区的大白菜演化而来，世界范围内有广 泛的分布面积和悠久的栽培历史。芥菜型油菜是由白菜与黑芥（Brassica nigra，2n = 16, BB)天然杂交后再自然加倍形成的双二倍体复合种，中国是其原始起源与分化中心，种 植范围遍布世界。
[0003] 随着经济水平的持续发展和社会现代化程度的不断提升，大众对生活品味的追求 也与日俱增，不仅传统的名山大川式的旅游越来越火，田园休闲观光产业的发展也很迅速。 油菜大面积生产上形成金黄色花的海洋，是越来越重要的田园生态旅游资源。油菜花观赏 的时间为每年的十二月底到来年夏季。每个地方因为种植的时间略有不同，花期会有一点 差异。在我国已形成几十个知名油菜花观赏地区，油菜花开时，竞相怒放、流金溢彩、绵延数 十里，好似金浪滔滔的海洋。
[0004] 自然界花丼颜色虽然种类繁多，但除芥蓝（B. oleracea var. alboglabra)的花瓣 是乳白色以外，芸薹属植物的花瓣普遍为黄色系列，商业油菜品种全是黄色花瓣，过于单 调。随着油菜花色田园生态观光产业的迅猛发展，迫切需要多姿多彩的花色性状，使之还可 以开出红色、蓝色等，在不影响油菜菜籽的出油率和其他传统用途之外，增加其赏花价值， 助推生态观光旅游。此外，特定的花色还是油菜育种界渴望的选择标记性状，而且花色的非 黄色化还有助于减少露尾甲等虫害。因此，需要解析油菜花色性状的分子机理，并开展新花 色的分子育种。
[0005] 萝卜（Raphanus sativus)属于萝卜属，近年来的分子证据表明萝卜与白菜、甘蓝、 甘蓝型油菜的距离甚至远小于黑芥与它们的距离，意思是说萝卜与芸薹属核心物种的距离 小于芸薹属内部的种间距离。但另一方面，萝卜能开出红色系的花色，而芸薹属和众多近缘 属（如白芥属）则只能开出黄色系的花。这是一个奇怪的现象，因此开展芸薹属与萝卜花 色性状的比较研宄，不仅是这些生物花色性状基础研宄的需要，也可为油菜等芸薹属植物 花色性状的遗传改良提供指导。
[0006] 重要观花植物的花色分子机理和分子育种已取得显著进展，为研宄其它植物花色 机理和开展分子育种提供了重要参考。花色主要由类黄酮（flavonoids)和类胡萝卜素 (carotenoids)两大类色素决定。
[0007] 类黄酮是最见的花色素，贡献黄色、橙色、红色到紫色的一系列色系。类黄酮 为水溶性物质，具有一个C15骨架，按结构主要分为9类：查尔酮（chalcones)、橙酮 (aurones)、异黄酮（isofIavonoids)、黄酮（fIavones)、黄酮醇（fIavonols)、黄烧双 醇（flavandiols)、花色苷（anthocyanins)、缩合单宁（condensed tannins,即原花青 素，proanthocyanins)和親酐（phlobaphenes)，它们中对植物着色贡献最大的是花色苷、 黄酮醇、查尔酮和橙酮。花色苷是最大的一类类黄酮物质，为花朵或其它组织贡献品红、红 色、紫色、蓝色等色调，积累于细胞的液泡或色素细胞中，天竺葵素（pelargonidin)、矢车菊 素（cyanidin)、飞燕草素（delphinidin)是最常见的三类花色苷；而黄色色调则由查尔酮、 橙酮、黄酮醇、黄酮提供。
[0008] 矮牵牛、玉米、金鱼草、拟南芥等植物中的类黄酮生物合成途径已被充分解析。它 是公共体丙烷生物合成途径下游的一个重要分支途径，苯丙烷途径通过其它分支途径合成 木质素、芪类、香豆素、植保素等多种次生物质。类黄酮途径的第一步是由查酮合酶（CHS) 催化1分子P-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA缩合形成浅黄色的4, 2'，4'，6' -四羟基 查尔酮。花色苷配基如天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素等是以查尔酮为底物，经羟化、还原、 氧化、侧基修饰等几步酶的催化反应而形成，依次涉及CHI (查尔酮异构酶）、F3H(黄烷酮 3-羟化酶）、F3' H(类黄酮3' -羟化酶）、F3' 5' H(类黄酮3'，5' -羟化酶）、DFR/FNR(二 氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶）、ANS (花青素合成酶）等。由F3' H和F3' 5' H 决定的花青素（anthocyanidins)的B-环上的轻基越多，则颜色越偏向蓝色。通常情况下， 查尔酮和花青素被进一步修饰，如糖基化（糖基转移酶，GT)、甲基化（甲基转移酶，MT)、酰 基化（酰基转移酶，AT)，然后转运（谷胱甘肽S-转移酶，GST)到液泡中贮存。在黄色金鱼 草花的液泡中，查尔酮4' -0-葡萄糖苷被金鱼草素合成酶（AS)转变成亮黄色的金鱼草素 (6-0-葡萄糖苷）。艳桐草等植物的橙色至红色花朵中，黄烷酮经过几步反应而合成3-脱 氧花色苷。此外，黄酮和黄酮醇也对花色起一定贡献，它们为无色或浅黄色，可通过所谓共 色作用来促进蓝色花色苷的形成和稳定。黄酮和黄酮醇分别是以黄烷酮和二氢黄酮醇为底 物，在黄酮合酶（FNS)和黄酮醇合酶（FLS)的催化下合成的。除花青素外，黄酮醇、查尔酮 等其它类黄酮物质也可能涉及糖基化等修饰。
[0009] 模式生物的研宄表明，类黄酮途径结构基因的表达是被一个由R2R3-MYB (有PAP、 PFG、TT2 等）、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH，有 TT8、GL3、EGL3 等） 和WD4〇重复（WDR，有TTGl等）形成的转录因子复合物所调控的，该三元复合物调控了观花 植物金鱼草、矮牵牛、牵牛花、非洲菊和龙胆花的花瓣中花色苷着色的过程，调控行为受器 官、组织等体内信号和光、紫外线等外部信号所影响。拟南芥的研宄表明，黄色调的黄酮醇 (苷）生物合成途径的表达则由PFG基因特异调控，其中成员MYB11、MYB12、MYB111在器官 特异性上发生明显分工。
[0010] 类胡萝卜素（carotenoids)是脂溶性的红色、橙色和黄色色素，嵌合在叶绿体和 有色体的膜中。类胡萝卜素是C40-四萜类化合物，由C5-异戊二烯基础单元合成而来，植 物、真菌、藻类和细菌均可合成，动物虽不能合成，但可从食物中摄入并用作色素和维生素 A 的前体物。类胡萝卜素为许多花色贡献了黄色色系，并单独或与花色苷一道为玫瑰、菊花 等一些植物的花瓣贡献了橙/红、黄褐色和褐色色调。迄今，植物类胡萝卜素生物合成途径 的几乎全部关键酶基因已被克隆和鉴定，整个途径起始于质体中的C5的异戊二烯焦磷酸 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)单元，据认为该途径的有关酶之间形成复合物并结合 于质体膜上，4分子IPP缩合为1分子C20的香叶基香叶基焦磷酸（GGPP)，在八氢番茄红素 合酶（PSY)的催化下2分子GGPP头对头地偶合成C40的无色的八氢番茄红素，它是第一个 类胡萝卜素。随后，八氢番茄红素脱饱和酶（TOS)和ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS)向分子 中顺序引入共轭双链，先后形成无色的六氢番茄红素、浅黄色的ζ-胡萝卜素、橙黄色的链 孢红素、红色的番茄红素。随着共轭双链数的增加，吸收波长向长波方向移动。脱饱和过程 中产生的一些顺式构象被类胡萝卜素异构酶（CRTIS0、Ζ-ISO)催化转变为全反式构象。番 茄红素可被番茄红素 β -环化酶（LCYB)或番茄红素 ε -环化酶（LCYE)环化，这是该途径的 一个分支点。除半结球莴苣等植物外，绝大多数植物中LCYE只能给番茄红素加入ε-环， 合成黄色的含有1个β-环和1个ε-环的α-胡萝卜素和其衍生物。β -和α -胡萝卜 素可发生进一步的羟化或环氧化修饰，产生许多新结构。胡萝卜素的加氧产物称为叶黄质， β -环和ε -环的羟化过程分别由β -环羟化酶（CHYB)和ε -环羟化酶（CHYE)完成。PSY、 GGPS和LCYB存在花特异型和果实特异型，显示存在一条有色体特异的类胡萝卜素合成途 径。玉米黄素环氧酶（ZEP)催化玉米黄素发生C5, 6和C5'，6'位的环氧化，形成黄色的花 药黄质和紫黄质，它又可在新黄质合成酶（NSY)的催化下转变成新黄质。9-顺式-紫黄质 和9-顺式-新黄质还可用于合成脱落酸（ABA)。
[0011] 类胡萝卜素合成途径的调控基因克隆还有待加强，但研宄表明该途径的调节主要 发生在转录水平上，受体内和环境因素影响，PSY是重要限速酶调控点，光信号通路参与对 类萝卜素途径的调控，而且类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD)/NCED (9-顺式-环氧类胡萝卜 素双加氧酶）从分解的角度参与重要调节作用。此外，VDE(紫黄质脱环氧化酶）催化紫黄 质和花药黄质转化为玉米黄质。拟南芥AtRAP2. 2对特定组织中的类胡萝卜素积累有弱的 促进作用，但最近研宄表明它的功能主要是调控组织的耐缺氧存活能力。番茄DDBl和DETl 通过对光反应信号途径的负调控而抑制类胡萝卜素途径，而甘蓝OR(Orange)和番茄HSP21 则是通过调控有色体的形成而促进类胡萝卜素的积累。
[0012] 此外，还存在第3类植物色素，即甜菜素（betalains)，是一类存在于液泡中 的水溶性生物碱，可分为红紫色系的甜菜红素（betacyanins)和黄色色系的甜菜黄素 (betaxanthins)，但甜菜素只发现于石竹目的10个科的植物和少数高等真菌中，其它植物 中还没有发现，而且从未发现甜菜素与花色苷并存于同一种植物中。
[0013] 由于多数重要观花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育 种的代谢工程具有重要应用前景。但是包括油菜在内的整个芸薹属中，未见利用分子育种 的代谢工程改造油菜花色的报道。


【发明内容】

[0014] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基因 LCYE、ΜΥΒ12和MYBlll基因表达同时异位表达ΤΤ8基因在制备花瓣 呈红色的芸薹属植物品种中的应用；本发明的目的之二在于提供干扰芸薹属植物花瓣中 β -环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYBlll基因表达同时异位表达TT8 基因的植物表达载体；本发明的目的之三在于提供上述植物表达载体的制备方法；本发明 的目的之四在于提供利用上述植物表达载体制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种的方法。
[0015] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0016] 1、干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因 LCYB、ε-环化酶基因 LCYE、MYB12和 MYBlll基因表达同时异位表达TT8基因在制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种中的应用。
[0017] 优选的，所述干扰芸薹属植物花瓣中β -环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基因 LCYE、 ΜΥΒ12和MYBlll基因表达的序列如SEQ ID NO. 2所示，所述ΤΤ8基因的序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0018] 优选的，所述干扰芸薹属植物花瓣中β -环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基因 LCYE、 ΜΥΒ12和MYBlll基因表达的序列由拟南芥花瓣特异启动子PAtAP3介导表达，所述花瓣特异 启动子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位至第1044位所示。
[0019] 最优选的，所述芸薹属植物为甘蓝型油菜（Brassica napus)。
[0020] 2、干扰芸薹属植物花瓣中β-环化酶基因 LCYB、ε-环化酶基因 LCYE、MYB12和 MYBlll基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体，所述植物载体包括由花瓣特异启 动子介导的表达β -环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYBlll基因 RNA干 扰序列的表达框和由组成型启动子介导TT8基因的表达框。
[0021] 优选的，所述花瓣特异启动子介导表达环化酶基因 LCYB、ε-环化酶基因 LCYE、MYB12和MYBlll基因 RNA干扰序列的表达框依次由花瓣特异启动子PAtAP3、SEQ ID NO. 2所示的序列、间隔序列、SEQ ID NO. 2所示的反向互补序列和NOS终止子组成。
[0022] 更优选的，所述由组成型启动子介导TT8基因的表达框依次由CaMV35S启动子， SEQ ID NO. 3所示序列和NOS终止子组成。
[0023] 3、所述植物表达载体的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO. 1所示序列 经AscI和SwaI双酶切后连入经同样酶切的pFGC5941M质粒，得pFGC5941CEPE质粒， 然后将SEQ ID NO. 2所示的序列连入pFGC5941CEPE载体的PAtAP3启动子与间隔序列 之间，形成中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia，再将SEQ ID NO. 2所示序列反向连入中间 载体 pFGC5941CEPE-B4RNAia 的间隔序列与 OCS 终止子之间，得 pFGC5941CEPE-B4RNAi 载体，最后将SEQ ID N0.3所示序列通过NcoI和AscI酶切位点连入经同样酶切的 pFGC5941CEPE-B4RNAi载体，得干扰芸薹属植物花瓣中β -环化酶基因 LCYB、ε -环化酶基 因 LCYE、MYB12和MYBlll基因表达同时异位表达ΤΤ8基因的植物表达载体。
[0024] 优选的，所述间隔序列为甘蓝型油菜PAP2基因第2内含子。
[0025] 4、利用所述植物表达载体制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种的方法，包括如下步 骤：
[0026] a.将权利要求5-7任一项所述植物表达载体转化农杆菌，制得工程菌；
[0027] b.将步骤a所得工程菌转化芸薹属植物无菌苗的下胚轴，共培养后，在Basta除草 剂抗性下诱导分化获得再生苗，筛选阳性苗转基因苗得花瓣呈红色的芸薹属植物品种。
[0028] 本发明的有益效果在于：本发明提供了油菜等芸薹属核心物种及萝卜花色机理， 明确了黄花、白花、红花之间的关键性差异表达基因位点，由此本发明克隆花瓣特异启动子 并改造获得一种适合于花色基因工程的新型植物表达平台载体，然后克隆相关基因或基因 片段，构建获得一种在花瓣中抑制黄色色素并积累番茄红素和花青素苷的植物表达载体， 转化油菜后创造出红色油菜花表型的新型资源材料，这是油菜等芸薹属花色基因工程的首 次成功，也是通过类胡萝卜素途径代谢工程修饰植物花色的首次成功。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0030] 图1为芸薹属和萝卜花瓣的显微观察结果（A :甘蓝型油菜（BnY) ;B :甘蓝型油菜 (BnW) ;C :芥菜型油菜（BjY) ;D :白菜型油菜（BrY) ;E :甘蓝（BoY) ;F :芥蓝（BoW) ;G :萝卜 (RsR))〇
[0031] 图2为DFR、TT19、TT8在芸薹属花瓣与萝卜花瓣间的差异表达（BnYPe :甘蓝型油 菜黄花瓣；BnWPe :甘蓝型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黄花瓣；BrYPe :白菜型油菜黄花 瓣；BoYPe :羽衣甘蓝黄花瓣；BoWPe :芥蓝白花瓣；RsRPe :萝卜红紫花瓣）。
[0032] 图3为OR、CXDl在芸薹属花瓣和萝卜花瓣间的差异表达（BnYPe :甘蓝型油菜黄 花瓣；BnWPe :甘蓝型油菜白花瓣；BjYPe :芥菜型油菜黄花瓣；BrYPe :白菜型油菜黄花瓣； BoYPe :羽衣甘蓝黄花瓣；BoWPe :芥蓝白花瓣；RsRPe :萝卜红紫花瓣）。
[0033] 图 4 为 N0S-PAtAP3、B4RNAi 和 BnTT8-lPCR 扩增结果（A :N0S-PAtAP3 ;B :B4RNAi ; C：BnTT8-l)〇
[0034] 图5pFGC5941CEPE和pBLycoRF2载体构建过程中酶切结果（A :AscI和SwaI 双酶切 PFGC5941M ;B :AscI 和 SwaI 双酶切 pMD19-T-N0S-PAtAP3 ;C :SwaI 和 AatI 双酶 切 PFGC5941CEPE ;D :SwaI 和 AatII 双酶切 pMD19-T-B4RNAi ;E :BamHI 和 XbaI 双酶切 pMD19-T-B4RNAi ;F 和 XbaI 双酶切 pFGC5941CEPE-B4RNAia ;G :NcoI 和 AscI 双酶切 pFGC5941CEPE-B4RNAi ;H :NcoI 和 AscI 双酶切 pMD19-T-BnTT8-l)。
[0035] 图6为pBLyc〇RF2转化油菜植株的花瓣颜色（A :对照组；B :转基因油菜）。

【具体实施方式】
[0036] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0037] 本发明实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜黄花瓣和发育中期种子（中双9号品 种）、甘蓝型油菜乳花瓣、白菜型油菜黄花瓣（6Y733品系）、芥菜型油菜黄花瓣（CNG12011 品系）、羽衣甘蓝（B. oleracea var. acephala ftricolor，K10-3品系）黄花瓣、芥蓝变种 白花瓣（R9057品系）、萝卜红花瓣均取自西南大学重庆市油菜工程技术研宄中心歇马基地 的常规试验植株。拟南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia野生型）种子购自国际拟南 芥中心，种植于室内人工气候室。
[0038] 本发明实施例采用的试剂及试剂盒：PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex Taq?II(Tli RNaseH Plus) ROX plus、 DNA Ligation Kit、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物（TaKaRa)生物工程有限公 司；RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；胶回收 试剂盒、小量法质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；限制性内切酶购自立陶 宛MBI Fermentas 公司；MS (Murashige&Skoog medium, including vitamins)培养基为荷兰 Duchefa公司产品；DL_2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购自北京全式金（Transgen) 生物技术有限公司；X -Gluc (5-brom〇-4-chlor〇-3-indolyl-β -D-glucuronic acid)、利福 平（Rif)、链霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨苄青霉素（Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和 酷（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、IPTG、CTAB 等其它生化与分子生物学试 剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；植物激素购自上海稼丰园艺用品等公司。
[0039] 本发明实施例采用的主要仪器：Veriti?多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；以及分子生物学和基因工 程的其它设备设施。
[0040] 优选实施例所用PCR引物合成和测序由上海英骏/英潍捷基公司、上海生工、北京 六合华大等公司商业完成。
[0041] 实施例1、芸薹属和萝卜花瓣显色亚细胞器的显微观察
[0042] 分别采取新鲜的甘蓝型油菜黄花瓣（BnY);甘蓝型油菜乳花瓣（BnW);芥菜型油菜 黄花瓣（BjY);白菜型油菜黄花瓣（BrY);羽衣甘蓝黄花瓣（BoY);芥蓝白花瓣（BoW);萝卜 红花瓣（RsR)，放在冰面冷鲜保存运回实验室，然后徒手切片，用低倍镜观察快速筛查，挑选 合格切片进行仔细观察与照相，结果如图1所示。结果显示，芸薹属几个物种的黄花瓣中显 黄色的物质在一个细胞中呈现为众多小颗粒状，不均匀地分布于细胞内，被液泡挤压到贴 壁的位置，说明黄色花瓣中显色细胞器为有色体，其色素为黄色类胡萝卜素。甘蓝型油菜乳 花瓣中也有一些细胞拥有浅黄色有色体，但总体数量少且细胞间不一致，芥蓝白花瓣中几 乎看不到有色体，说明是有色体的减少或消失导致其黄色变浅或消失。萝卜花瓣中紫红色 色素均匀分布于每个细胞的中央位置，越是中央越浓，越偏离中央越淡，说明萝卜花瓣的显 色亚细胞器为液泡，显色物质为花青素苷。
[0043] 实施例2、检测芸薹属和萝卜花瓣色素
[0044] 在盛花期早晨分别取刚开放的甘蓝型油菜黄花瓣（BnY);甘蓝型油菜乳花瓣 (BnW);芥菜型油菜黄花瓣（BjY);白菜型油菜黄花瓣（BrY);羽衣甘蓝黄花瓣（BoY);芥蓝 白花瓣（BoW);萝卜红花瓣（RsR)，立即阴凉保鲜运回实验室，50?60°C烘干，研成粉末后过 60目筛，避光干燥保存。
[0045] 1、石油醚、盐酸和氨水测试结果
[0046] 称取保存的花瓣粉末0. 100g，分别放入编有号码的具塞试管中，分别加入石油醚、 10%盐酸、30%氨水各约10mL，轻轻混匀，过滤，观察颜色变化，结果如下：
[0047] (1)石油醚反应：甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表现出亮黄色，表明类 胡萝卜含量的含量高；羽衣甘蓝表现出浅黄色，说明其含有少量的类胡萝卜素；而芥蓝和 萝卜花表现出无色，表明不含类胡萝卜素。
[0048] (2)盐酸测试：只有萝卜红花瓣表现出粉红色，说明含有花青素苷，而甘蓝型油 菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表现出不同程度的黄色，说明含黄酮（醇）而不含花青素。 芥蓝白和羽衣甘蓝表现近无色，说明不含有花青素，而且黄酮（醇）也很少。
[0049] (3)氨水测试：芸薹属各材料均表现出不同程度的黄色，说明其含有或多或少的 黄酮（醇），而萝卜花表现出的黄绿色，该颜色是由花色苷呈现的蓝色和类黄酮呈现的黄色 混合而成，但所有材料均不表现橙红色或红色，说明不含橙酮。
[0050] 2、类黄酮的显色反应
[0051] 取保存的花瓣粉末0. 100g，用甲醇提取24h，过滤，定容至50mL，各取2mL提取液， 然后进行下列颜色反应，观察颜色变化。
[0052] (1)浓盐酸-镁粉反应：加入少量镁粉，再后加入浓盐酸5滴，轻轻摇匀，静置lh。 结果显示，甘蓝型油菜、芥蓝显示无色，可能含有查尔酮、橙酮；甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥 菜型油菜显示极淡紫红和微紫红，说明不含查尔酮、橙酮和儿茶素，可能含有黄酮、黄酮醇、 二氢黄酮醇、二氢黄酮；萝卜花显现出粉红色，说明含有花青素。
[0053] (2)浓盐酸-锌粉反应：加入少量锌粉，再加入浓盐酸10滴，轻轻摇匀，静置lh。 结果显示，萝卜花呈现粉红色，说明含有花青素苷。其余均无色或者黄色，说明不含花青素 苷。
[0054] (3)醋酸铅反应：加1.0%醋酸铅2mL，轻轻摇匀，静置2h。结果显示，所有芸薹属 材料均出现不同程度的黄色沉淀，说明类黄酮具备酚羟基而且不含查耳酮和橙酮，可能具 有邻二酚羟基或者兼有4-酮基、3-0H或者4-酮基、5-0H结构；萝卜花出现绿色沉淀，说明 含有花青素苷。
[0055] (4)三氯化铁反应：加5. 0%三氯化铁2ml，轻轻摇匀。结果显示，所有材料都出现 黄色，说明色素分子中不含酚羟基。
[0056] (5)三氯化铝反应：加1. 0%三氯化铝甲醇溶液1ml。结果显示，所有材料都呈现 程度不同的黄色，说明含类黄酮物质。
[0057] (6)浓硫酸反应：加 I. 5mL浓H2SO4，轻轻摇匀，再置沸水浴5min。所有芸薹属材料 均呈现不同程度的黄色，说明含黄酮（醇），沸水中5min颜色不改变，说明不含查尔酮、橙 酮，可能不含二氢黄酮，可能含异黄酮和二氢异黄酮。萝卜花出现橙黄色，说明含有花青素。
[0058] (7)四氢硼钠反应：加四氢硼钠8mg，再加1. 0%盐酸2mL，轻轻摇勾，静置此。所 有芸薹属材料均呈现程度不同的黄色，说明不含二氢黄酮和二氢黄酮醇。萝卜花呈现极淡 粉红色，说明含有二氢黄酮和/或二氢黄酮醇。
[0059] (8)碱性试剂反应：加5% Na2C033ml，轻轻摇勾，密闭静置30min，通空气lOmin。所 有材料均呈现程度不同的黄色，通空气后颜色不变，说明不含二氢黄酮醇。
[0060] (9)氨性氯化铯反应：取甲醇10ml，加氨水定容至25ml，成为被氨水饱和的甲醇溶 液。向样品液中加入〇. 〇lmol/L氯化锁甲醇液10滴，再加被氨水饱和的甲醇液10滴，用手 轻轻摇匀，静置lh。萝卜花呈现出沉淀，说明有3'，4' -二羟基取代。
[0061] (10)硼酸反应：加1.0%硼酸10滴，再加2.0% H3B033ml，芥蓝白花瓣呈现出无色， 说明芥蓝白花瓣类黄酮可能不含c 5-oh。
[0062] 3、花瓣色素成分的紫外-可见光谱分析
[0063] (1)叶绿素：称取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用体积分数为 90%的丙酮：乙醇（4:1，V/V)提取24h，过滤，定容至25ml，采用紫外-可见分光光度计在 200?700nm范围内扫描。结果表明，所有样品在662nm和644nm处均无吸收峰，说明均不 含叶绿素。
[0064] (2)类胡萝卜素：称取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚： 丙酮（1:1，V/V)提取24h，过滤，定容至25ml，采用紫外-可见分光光度计在200?700nm 范围内扫描。结果表明，甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘蓝在440和470nm 左右都有吸收峰，说明含有类胡萝卜素，定量分析测定的含量分别为6. 824、6. 712、5. 548、 I. 248mg/g。而芥蓝和萝卜花瓣则没有特征吸收峰，说明不含有类胡萝卜素。
[0065] (3)类黄酮：称取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入盐酸化甲醇 (pH = 3) 2ml置于4 °C冰箱中提取24h，过滤，定容至25ml，用紫外-可见分光光度计在 220?600nm范围内扫描。结果表明，甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘蓝、芥 蓝、萝卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，说明他们都含有类黄酮化合物，定量分 析测定的含量分别为 483、7· 651、7· 001、L 391、L 003、8· 373mg/g。
[0066] (4)花青素苷：称取保存的花瓣0. 100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取 24h，过滤，定容至50ml，用紫外-可见分光光度计在200?700nm范围内扫描。结果表 明，萝卜花瓣色素在532nm左右有较明显的花色苷特征吸收峰，是花色苷带I吸收峰，在 260-270nm区域内以一个不太强带II的峰，定量分析测定的含量为237. 27mg/100g。所有 芸薹属样本均无花色苷吸收峰，即不含花色苷。
[0067] 实施例3、芸薹属和萝卜花瓣色素生物合成途径的分子鉴定
[0068] (1)芸薹属和萝卜花瓣类黄酮途径基因的表达特征
[0069] 为研宄芸薹属和萝卜花瓣色素出现差异的分子机理，设计芸薹属和萝卜类黄酮途 径基因的RT-PCR检测引物，并以5SrRNA作为内参，具体如表1所示：
[0070] 表1、类黄酮途径RT-PCR检测引物
[0071]

【权利要求】
1. 干扰芸薹属植物花瓣中￠-环化酶基因 LCYB、e-环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111 基因表达同时异位表达TT8基因在制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干扰芸薹属植物花瓣中0 _环化酶 基因 LCYB、e -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111基因表达的序列如SEQ ID NO. 2所示，所 述TT8基因的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述干扰芸薹属植物花瓣中0 _环化酶 基因 LCYB、e -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111基因表达的序列由拟南芥花瓣特异启动 子PAtAP3介导表达，所述花瓣特异启动子PAtAP3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1第267位 至第1044位所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述芸薹属植物为甘蓝型油菜 (Brassica napus)〇
5. 干扰芸薹属植物花瓣中￠-环化酶基因 LCYB、e-环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111 基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物载体包括由花瓣 特异启动子介导的表达0-环化酶基因 LCYB、e-环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111基因 RNA干扰序列的表达框和由组成型启动子介导TT8基因的表达框。
6. 根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于：所述花瓣特异启动子介导表达 0 -环化酶基因 LCYB、e -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111基因 RNA干扰序列的表达框 依次由花瓣特异启动子PAtAP3、SEQ ID NO. 2所示的序列、间隔序列、SEQ ID NO. 2所示的 反向互补序列和NOS终止子组成。
7. 根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于：所述由组成型启动子介导TT8 基因的表达框依次由CaMV35S启动子，SEQ ID NO. 3所示序列和N0S终止子组成。
8. 权利要求5-7任一项所述植物表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤：将SEQ ID NO. 1所示序列经AscI和Swal双酶切后连入经同样酶切的pFGC5941M质 粒，得PFGC5941CEPE质粒，然后将SEQ ID NO. 2所示的序列连入pFGC5941CEPE载体的 PAtAP3启动子与间隔序列之间，形成中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia，再将SEQ ID NO. 2 所示序列反向连入中间载体pFGC5941CEPE-B4RNAia的间隔序列与0CS终止子之间，得 pFGC5941CEPE-B4RNAi载体，最后将SEQ ID NO. 3所示序列通过Ncol和AscI酶切位点连入 经同样酶切的pFGC5941CEPE-B4RNAi载体，得干扰芸薹属植物花瓣中0 -环化酶基因 LCYB、 e -环化酶基因 LCYE、MYB12和MYB111基因表达同时异位表达TT8基因的植物表达载体。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述间隔序列为甘蓝型油菜PAP2基 因第2内含子。
10. 利用权利要求5-7任一项所述植物表达载体制备花瓣呈红色的芸薹属植物品种的 方法，其特征在于，包括如下步骤： a. 将权利要求5-7任一项所述植物表达载体转化农杆菌，制得工程菌； b. 将步骤a所得工程菌转化芸薹属植物无菌苗的下胚轴，共培养后，在Basta除草剂抗 性下诱导分化获得再生苗，筛选阳性苗转基因苗得花瓣呈红色的芸薹属植物品种。
【文档编号】C12N15/82GK104480128SQ201410668840
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】柴友荣, 刘雪, 董博, 廖霏霏, 林呐, 殷家明, 周清源, 唐章林, 王倩 申请人:西南大学