一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，本发明以牛乳清为原料，采用双水相萃取技术，使牛乳清中的乳过氧化物酶全部富集到盐相，盐相溶液经超滤膜去除小的杂蛋白，进一步纯化乳过氧化物酶，通过透析袋脱盐处理，然后冷冻干燥，从而制备出高活性的可用于天然食品添加剂的乳过氧化物酶产品。采用本发明的方法可以直接制得具有天然抗菌活性的乳过氧化物酶，可以将其作为天然防腐剂直接加入到食品或牙膏等日常用品中。
【专利说明】一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提取乳过氧化物酶的方法，特别涉及一种采用超滤法辅助双水相 萃取技术提取乳过氧化物酶的方法。本发明属于乳过氧化物酶的提取制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 乳过氧化物酶（LP)是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，在有过氧化氢存 在的条件下，乳过氧化物酶能够催化硫氰酸盐形成抗菌介质，LP的生物学意义是参与自 然宿主抵御对微生物的入侵，对动物哺乳期的乳腺和新生婴儿的肠道病原微生物起到保 护作用，LP是由一个包含612个氨基酸的单一多肽链组成，分子量约为85kDa，等电点为 8. 0-8. 5,在牛乳中的含量为10-30mg/mL，在文献中已经证明了 LP是食品中存在的天然防 腐剂并且是安全的。
[0003] 乳过氧化物酶体系在食品行业中应用最广泛的是乳制品，在过去几十年里，国内 外学者报道了从原料乳中提取LP的方法，有色谱技术、膜色谱等。色谱技术主要包括离子 交换、分子筛、免疫亲和色谱等，膜色谱应用较多的是离子交换吸附膜。虽然传统这些色谱 法提取LP纯度较高，但是仍有很多缺点，例如耗时较长，回收率较低及成本昂贵，并不适宜 大量生产乳过氧化物酶。想要高效率的从牛乳清中提取LP并不是一个简单的任务，因为乳 清中存在大量的杂蛋白，给分离带来了困难，因此迫切的需要一个效率高、成本低、开发潜 力大的从乳清中分离LP的方法。
[0004] 与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术所使用的分离设备简单、条件温和、 操作简单，且其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白 质、酶、核酸等生物产品的分离和纯化，以及药物有效成分的提取，并逐步向工业化生产迈 进。双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质 在两相间的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种 力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响作用，使其在上相和下相中的浓度不 同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配 系数，从而达到分离纯化之目的。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间， 易于扩大生产的优点，并且对环境无害。国内研究报道了利用双水相法提取脂肪酶、糖化 酶、淀粉酶等工艺方法，但是目前还没有应用双水相法提取乳过氧化物酶的报道。本发明 利用双水相技术并结合超滤方法，建立了快速、高效率、低成本的乳过氧化物酶分离提取技 术，能够满足工业化大规模生产的要求。
[0005] 超滤膜分离技术具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、分离效果好、操作简 便、无副作用、无二次污染、分离产物易于回收等优点，已被广泛应用于工业生产中的产品 分离、纯化等。将膜分离技术应用于乳过氧化物酶纯化处理，为充分开发利用乳过氧化物酶 提供了一种行之有效的方法。因此本发明采用超滤膜分离技术，进一步纯化双水相萃取得 到乳过氧化物酶，为工业化生产乳过氧化物酶提供了科学依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高回收 率和高纯化倍数的，且可用于食品工业的乳过氧化物酶的提取方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 以牛乳清为原料，以双水相萃取技术为提取手段，确定双水相萃取技术中最佳盐 相和聚合物的选择以及其各自最佳用量、体系pH的工艺条件，并用超滤技术进行进一步纯 化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清一双水相提取乳过氧化酶一收集富集 乳过氧化物酶的盐相溶液一盐相溶液使用超滤分离一离心后收集截留溶液一透析脱盐一 冷冻干燥一乳过氧化物酶粗产品。
[0009] 具体的，本发明的一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方 法，其特征包含以下步骤：
[0010] (1)双水相萃取乳过氧化物酶：
[0011] 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，直接向乳清中连 续添加聚乙二醇（PEG)和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至聚乙二醇和盐完全溶解于 乳清中，其中聚乙二醇的分子量为6000Da，盐为MgS0 4,聚乙二醇的终浓度为12-16% (w/w) 和MgS04的终浓度为10% -14% (w/w)，使用NaOH调节体系pH至8. 0-9. 0,静止，待两相完 全分离，收集体系的下相，即盐相部分；
[0012] ⑵超滤：
[0013] 将收集的盐相溶液，使用HC1调节pH至6.5-7. 5,用超滤膜进行超滤分离，以除去 杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；
[0014] (3)脱盐处理：
[0015] 将步骤（2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；
[0016] (4)干燥：
[0017] 将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
[0018] 在本发明中，优选的，步骤（1)中PEG 6000的终浓度为16% (w/w)。
[0019] 在本发明中，优选的，步骤（1)中MgS04的终浓度为10% (w/w)。
[0020] 在本发明中，优选的，步骤（1)中使用NaOH调节体系pH至8. 5。
[0021] 在本发明中，优选的，步骤（2)中使用分子量30_50kDa的超滤膜进行超滤分离，以 除去部分分子量小于30_50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶 的目的。更优选的，步骤（2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为30kDa。
[0022] 在本发明中，优选的，步骤⑶中将步骤⑵收集的截留溶液装入分子量为 2-14kDa的透析袋内进行脱盐，每隔l-2h更换一次去离子水，透析6-8h即可。
[0023] 采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过氧化物酶 酶活回收率和纯化倍数分别达到130-150%和3. 20-3. 70倍。
[0024] 通过上述提取方法可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制得天然 的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加入到食品和牙膏等 曰用品中。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为SDS-PAGE电泳图谱分析；
[0026] 注：泳道1为标准物质Marker图谱，泳道2为乳清，泳道3为双水相提取后的乳过 氧化物酶，泳道4为经过50kDa分子量超滤后的乳过氧化物酶；图谱左侧的一列数字代表 Marker的分子量（单位：kD);
[0027] 图2为PEG分子量对LP分离效果的影响；
[0028] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0029] 图3为盐相对LP的酶活回收率和纯化倍数影响；
[0030] 1硫酸镁，2硫酸铵，3磷酸钠，4磷酸钾，5柠檬酸钠，6柠檬酸铵；
[0031] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈〇. 05);
[0032] 图4为PEG6000含量对LP分离效果的影响；
[0033] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0034] 图5为MgS04含量对LP分离效果的影响；
[0035] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0036] 图6为pH对LP分离效果的影响。
[0037] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039] 实施例1乳过氧化物酶的提取
[0040] (1)双水相萃取乳过氧化物酶：
[0041] 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向容器中加入适 量的乳清，直接向乳清中连续添加PEG和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至PEG和盐完 全溶解于乳清中，形成双水相体系。其中PEG分子量为6000Da，盐为MgS0 4, PEG的终浓度 为16% (w/w)，MgS04的终浓度为10% (w/w)，使用lmol/L NaOH调节体系pH至8. 5,静止 约30min，待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分。
[0042] (2)超滤：将收集的盐相溶液体系使用lmol/L HC1调节pH至7左右，取适量盐相 溶液置于分子量30kDa的超滤膜，进行超滤分离，除去部分分子量小于30kDa的杂蛋白，收 集超滤膜所得的截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；
[0043] (3)脱盐处理：将上述截留溶液装入分子量10kDa透析袋内进行脱盐，每隔l_2h 更换一次去离子水，透析6-8h ;
[0044] (4)干燥：将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
[0045] 结果骀证:
[0046] 1、SDS-PAGE电泳图谱分析：
[0047] 蛋白标准品、牛乳清和双水相提的乳过氧化物酶的SDS-PAGE图谱见图1，由图1可 以看出牛乳清所在泳道处有很多条带，即含有多种蛋白质成分；乳清经过双水相萃取后电 泳条带减少，同时双水相萃取结合超滤分离后的电泳条带也明显减少，所获得的条带接近 报道的LP分子量为85kDa左右，这表明本发明的一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取 乳过氧化物酶的方法是分离乳过氧化物酶的有效方法。
[0048] 2、乳过氧化酶的酶活测定
[0049] 取3mL浓度为lmmol/L的ABTS(溶于0. lmol/L pH 6. 0的磷酸盐缓冲溶液）至反应 试管中，然后加入〇. lmL的浓度为3. 2mmol/L的H202，再加入适当稀释的反应酶液0. lmL(用 0. lmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液稀释），充分混合后，开始计时，反应2min后立即测定 吸光度值，在波长为412nm处，以ABTS和适当稀释酶液的混合液为空白对照组（在室温条 件下）。LP的酶活力单位是U/mL，公式为：
【权利要求】
1. 一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，其特征包含以下步 骤： (1) 双水相萃取乳过氧化物酶： 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，直接向乳清中连续添 加聚乙二醇（PEG)和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至聚乙二醇和盐完全溶解于乳 清中，其中聚乙二醇的分子量为6000Da，盐为MgS04，聚乙二醇的终浓度为12-16% (w/w)， MgS04的终浓度为10% -14% (w/w)，使用NaOH调节体系pH至8. 0-9. 0,静止，待两相完全 分离，收集体系的下相，即盐相部分； (2) 超滤： 将收集的盐相溶液，使用HC1调节pH至6. 5-7. 5,用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋 白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的； (3) 脱盐处理： 将步骤（2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐； (4) 干燥： 将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑴中PEG 6000的终浓度为16% (w/ w)。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中MgS04的终浓度为10% (w/w)。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中使用NaOH调节体系pH至8. 5。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)中使用分子量30-50kDa的超滤膜进 行超滤分离，以除去部分分子量小于30-50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯 化乳过氧化物酶的目的。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为 30kDa〇
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中将步骤（2)收集的截留溶液装入 分子量为2-14kDa的透析袋内进行脱盐，每隔l-2h更换一次去离子水，透析6-8h即可。
8. 如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于步骤（2)中浓缩纯化乳过氧化物酶 产品，其回收率为130-150%。
9. 如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于步骤（2)中浓缩纯化乳过氧化物酶 产品，其纯化倍数为3. 20-3. 70。
【文档编号】C12N9/08GK104450639SQ201410675881
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】姜瞻梅, 许晓曦, 刘丽丽, 车红霞, 付红岩 申请人:东北农业大学