一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用引物对的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用引物对。本发明公开一种扩增含有g.12774C>T多态性位点的DNA片段的引物对；所述g.12774C>T多态性位点为GenBank Accession Number为NC_010447.4的序列的自5’末端起第12774位；所述GenBank Accession Number为NC_010447.4的序列的更新日为2013年9月29日。本发明公开的方法操作简单、准确度高、可实现自动化检测，将在猪育种中发挥巨大作用。
【专利说明】一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用引物对
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用引物对，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 我国养猪的历史可谓悠久，鉴于大耳文化的熏陶，我国很多地方猪品种多数都具 有一双大耳，尤其以太湖猪为甚。受不同地域耳文化的影响，不同地域对猪耳大小的选择方 向性存在巨大差异，于是就出现了不同猪种猪耳大小和形态的丰富多样性。甚至对于一些 地方猪品种如大耳的二花脸猪、东北民猪和小耳的滇南小耳猪、广东小耳花猪等，耳大小已 经成为了其品种特异性标志之一。
[0003] 猪耳面积性状QTL定位及主效基因研究已经在国内外研究中开展。英国罗斯林研 究所研究人员利用大白猪X梅山猪F2设计资源群体，耳面积性状显著QTL分别被定位于 5 号染色体上 51cM 和 7 号染色体上 70cM 处（Wei WH, de Koning DJ, Penman JC, Finlayson HAj Archibald AL, Haley CS:QTL modulating ear size and erectness in pigs. Anim Genet 2007,38:222-226.)。另外，江西农业大学研究人员利用白色杜洛克X二花脸F2 设计资源群体开展了耳面积性状QTL定位研究，分别将QTL定位于5号染色体上70cM 和 7 号染色体上 58cM 处（Ma J，Qi W，Ren D，Duan Y，Qiao R，Guo Y，Yang Z，Li L，Milan D，Ren J，Huang LA genome scan for quantitative trait loci affecting three ear traits in a White DurocXChinese Erhualian resource population. Anim Genet 2009, 40:463-467.)，且这两个QTL分别可以解释45%和17%的表型变异。其中，在5号 染色体上耳面积性状QTL区间内存在一个WIFl基因，此基因作为Wnt分子的胞外抑制剂 sFRP家族成员之一，通过直接与Wnt分子结合，抑制Wnt分子与受体细胞膜上的Frizzled 受体及辅助受体LRP5/6形成三聚体复合物，从而抑制了 Wnt信号通路信号传导，可影响脂 肪细胞、软骨细胞等的分化和增殖（Kawano Y，Kypta R. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway. J Cell Sci 2003,116:2627-2634·)。美国斯坦福大学医学院和法 国雷恩大学的研究人员，分别对多个具有丰富耳面积多样性的家养狗品种，开展了全基因 组关联研究和全基因组选择信号研究，结果表明WIFl基因可作为将耳面积性状主效候选 基因 （Boyko AR, Quignon Pj Li L，Schoenebeck JJ，Degenhardt JDj Lohmueller KEj Zhao K，Brisbin A，Parker HG, vonHoldt BM，Cargill M，Auton A, Reynolds A，Elkahloun AG, Castelhano M，Mosher DS，Sutter NB, Johnson GSj Novembre Jj Hubisz MJ，Siepel A,Wayne RK，Bustamante CD, Ostrander EA. A simple genetic architecture underlies morphological variation in dogs. PLoS Biol 2010,8:el00045L ；Vaysse A, Ratnakumar A, Derrien Tj Axelsson Ej Rosengren Pielberg Gj Sigurdsson Sj Fall Tj SeppalaEHj Hansen MS,Lawley CT，Karlsson EK ;LUPA Consortium,Bannasch Dj VilaCj Lohi H，Galibert F，Fredholm M， Haggstrom J，Hedhammar A, AndreCj Lindblad-Toh K，Hitte Cj Webster MT. Identification of genomic regions associated with phenotypic variation between dog breeds using selection mapping. PLoS Genet 2011，7: el002316.)。综合上述研究，WIFl基因可作为耳面积性状主效候选基因，具有很高 研究价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用引物对。
[0005] 本发明提供一种扩增含有g. 127740T多态性位点的DNA片段的引物对；
[0006] 所述 g. 127740T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0007] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0008] 上述引物对中，所述引物对由SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示 的DNA分子组成。
[0009] -种鉴定或辅助鉴定猪的耳面积大小的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂 盒包含上述任一所述的引物对。
[0010] 一种鉴定或辅助鉴定猪的耳面积大小的方法也属于本发明的保护范围，该方法 为：纯合CC基因型的猪的耳面积大于杂合CT基因型的猪的耳面积，杂合CT基因型的猪的 耳面积大于纯合TT基因型的猪的耳面积；
[0011] 所述纯合CC基因型的猪为g. 127740T多态性位点的碱基均为C的猪；
[0012] 所述杂合CT基因型的猪为g. 127740T多态性位点的碱基为T和C的猪；
[0013] 所述纯合TT基因型的猪为g. 127740T多态性位点的碱基均为T的猪；
[0014] 所述 g. 127740T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0015] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0016] 上述方法中，所述纯合CC基因型、杂合CT基因型或纯合TT基因型的判定方法如 下：以猪的基因组DNA为模板，以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果 PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型，如 果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基为T和C，则所述猪的基因型为杂合CT基因 型，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基均为T，则所述猪的基因型为纯合TT基 因型。
[0017] 一种选育耳面积大的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合CC基因型 的猪进行选育；
[0018] 所述纯合CC基因型的猪为g. 127740T多态性位点的碱基均为C的猪；
[0019] 所述 g. 127740T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0020] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0021] 上述方法中，所述纯合CC基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上 述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位 的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型。
[0022] -种选育耳面积小的猪的方法也属于本发明的保护范围，是选择纯合TT基因型 的猪进行选育；
[0023] 所述纯合TT基因型的猪为g. 127740T多态性位点的碱基均为T的猪；
[0024] 所述 g. 127740T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0025] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0026] 上述方法中，所述纯合TT基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以上 述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位 的碱基均为T，则所述猪的基因型为纯合TT基因型。
[0027] 上述任一所述的引物对、上述试剂盒和/或上述任一所述的方法在猪的选育中的 应用也属于本发明的保护范围。
[0028] 本发明的实验证明，本发明使用基因测序方法检测g. 12774CXT，只需进行PCR 反应，测序即可判别个体的基因型，基因型判型非常准确，检测费用不高，具有很高的育 种实践应用价值。用本发明的方法对猪耳面积性状进行选择，可使猪平均耳面积增大约 78. 89cm2,从而获得大耳面积猪。
[0029] 应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实 际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪耳 面积。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测，在猪 的育种工作中发挥巨大作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为TT基因型个体和CC基因型个体WIFl基因 g. 12774CXT多态性位点附近序 列的测序结果。
【具体实施方式】
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 大民杂交猪（Sus scrofa)，由大白猪和民猪杂交获得，该猪购自中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所昌平畜禽实验基地。
[0034] 下述实施例中的GenBank Accession Number为NC_010447. 4的序列均是指更新 日为 2013 年 9 月 29 日的 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列。
[0035] 实施例1、鉴定猪耳面积大小
[0036] 一、猪WIFl基因 g. 12774CXT多态性位点的确定
[0037](一）以两头大民杂交猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。
[0038] (二）引物的设计与合成
[0039] 根据猪 WIFl 基因基因组 DNA 序列（GenBank Accession Number NC_010447. 4)信 息，设计并合成如下引物：
[0040] U(上游引物）：5, -CCTTTTCTGTGATGTCTACTCC-3'（SEQ ID No. I);
[0041] D (下游引物）：5, -CAACGCTTATGTGCCCTA-3'（SEQ ID No. 2)。
[0042] (三）PCR 扩增
[0043] 分别以步骤（一）得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板，以U和D为引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。
[0044] PCR扩增体系：基因组DNA 200ng，10 X PCR扩增缓冲液5 μ I，dNTPs终浓度为 10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0. 75U，Mg2+2. 5mmol/L，用CldH2O补足体系至 50 μ 1。
[0045] PCR扩增程序：95°C预变性 5min ;95°C变性 20s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35 个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0046] (四）测序及序列分析
[0047] 将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列（如SEQ ID No. 3所示）和产物2 的序列（如SEQ ID No. 4所示）。SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4只存在一个碱基的差异，均为 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4中自5'末端起第243位，该处的碱基为C或T，该位点附近的反 向互补序列如图1所示（其中箭头所示为该多态性位点），该位点位于GenBank Accession Number为NC_010447. 4的自5'末端起第12774位，因此将该位点命名为g. 127740T。
[0048] 在 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列自 5'末端第 12774 位的喊 基（或步骤（三）得到的PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基）均为C的个体，该个 体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合CC基因型，在GenBank Accession Number 为NC_010447. 4的序列自5'末端第12774位的碱基（或步骤（三）得到的PCR扩增产物 自5'末端起第243位的碱基）均为T的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命 名为纯合TT基因型，在GenBank Accession Number为NC_010447. 4的序列自5'末端第 12774位的碱基（或步骤（三）得到的PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基）为T和 C的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合CT基因型。
[0049] 二、猪WIFl基因 g. 127740T多态性位点与猪耳面积性状的关联性分析
[0050] 为确定g. 127740T多态性位点与猪耳面积性状是否相关，以307头大民杂交猪为 实验材料，进行如下试验：
[0051] (一）提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中（三）的方法进行 PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中（四）的方法确定每头猪的基因型是纯合CC、 杂合CT还是纯合TT。
[0052] (二）测量各基因型猪的耳面积大小。
[0053] (三）根据猪的基因型以及猪耳面积得到如下结论：纯合CC基因型的猪的猪耳面 积大于杂合CT基因型的猪的猪耳面积，杂合CT基因型的猪的猪耳面积大于纯合TT基因型 的猪的猪耳面积。
[0054] (四）用硫酸纸描出猪耳轮廓，使用Photoshop软件计算出猪耳面积性状，对 g. 12774CXT位点与猪耳面积性状以最小二乘法开展关联分析。所用模型如下：
[0055] Y = S+P+B+G+e
[0056] 其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为胎次效应，B为屠宰批次效应，G为基因 型效应，e为残差效应。
[0057] 结果如表1所示。
[0058] 表1猪的基因型与耳面积的关联性分析
[0059]
【权利要求】
1. 一种扩增含有g. 12774C>T多态性位点的DNA片段的引物对； 所述 g. 12774C>T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29 曰。
2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQ ID No. 1所示的DNA 分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
3. -种鉴定或辅助鉴定猪的耳面积大小的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述 的引物对。
4. 一种鉴定或辅助鉴定猪的耳面积大小的方法，该方法为：纯合CC基因型的猪的耳面 积大于杂合CT基因型的猪的耳面积，杂合CT基因型的猪的耳面积大于纯合TT基因型的猪 的耳面积； 所述纯合CC基因型的猪为g. 12774C>T多态性位点的碱基均为C的猪； 所述杂合CT基因型的猪为g. 12774C>T多态性位点的碱基为T和C的猪； 所述纯合TT基因型的猪为g. 12774C>T多态性位点的碱基均为T的猪； 所述 g. 12774C>T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29 曰。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述纯合CC基因型、杂合CT基因型或纯 合TT基因型的判定方法如下：以猪的基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物为引物 进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基均为C， 则所述猪的基因型为纯合CC基因型，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基为T 和C，则所述猪的基因型为杂合CT基因型，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基 均为T，则所述猪的基因型为纯合TT基因型。
6. -种选育耳面积大的猪的方法，是选择纯合CC基因型的猪进行选育； 所述纯合CC基因型的猪为g. 12774C>T多态性位点的碱基均为C的猪； 所述 g. 12774C>T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29 曰。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述纯合CC基因型的判定方法如下：以 猪的基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基 因型。
8. -种选育耳面积小的猪的方法，是选择纯合TT基因型的猪进行选育； 所述纯合TT基因型的猪为g. 12774C>T多态性位点的碱基均为T的猪； 所述 g. 12774C>T 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447.4 的序列的更新日为 2013年 9 月 29 曰。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯合TT基因型的判定方法如下：以 猪的基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物，如果PCR扩增产物自5'末端起第243位的碱基均为T，则所述猪的基因型为纯合TT基 因型。
10. 权利要求1或2所述的引物对、权利要求3所述的试剂盒和/或权利要求4-9任一 所述的方法在猪的选育中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104404149SQ201410697378
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】王立贤, 张龙超, 王立刚, 颜华, 梁晶 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所