六对特异识别猪h11位点的多肽及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了六对特异识别猪H11位点的多肽及其编码基因和应用。本发明提供的六对多肽均由多肽甲和多肽乙组成，所述多肽甲和多肽乙均由18个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个重复序列可变的双氨基酸残基；本发明提供的多肽对能在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以解析猪H11基因的功能、构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持，为转基因猪的制备提供了稳定的平台。
【专利说明】六对特异识别猪H11位点的多肽及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及6对（2X3)特异识别猪Hll位点的多肽 及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研宄团队在小鼠的第11号染色体 上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hippll位点，简称Hll位点。Hll位点 位于Eif4enifl与Drgl两个基因的间隙，与Eif4enifl基因的19号外显子和Drgl基因的 9号外显子相邻，大小约5kb。Hll位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉 默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hippll位点定点基因修饰的小鼠与野生型小 鼠生长发育无区别。目前类似的还有R〇sa26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全 身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而Hll位点则不存在类似的困难，由于其位于 两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特 异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hippll这样安全有效的基因修 饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。
[0003] 寻找一种能靶向切割猪Hll位点的技术相当重要。传统的打靶技术效率非常的 低，其主要是依赖细胞内部的同源重组随机交换完成的，效率非常低。
[0004] 近年来发展的主要方法为依托序列特异的核酸酶进行基因的精确修饰。序列特异 的核酸酶主要由一个DNA识别域与一个能非特异性切割DNA的内切酶结构域连接而成。其 主要原理为先由DNA识别域识别并结合到需要改造的DNA片段上，然后由与DNA相连的非 特异性内切酶结构域对DNA进行切割，造成DNA的双链断裂（Double-strand break，DSB)， DSB会激活DNA的自我修复而引起基因的突变从而促进该位点的同源重组。
[0005] 锌指核酸酶技术（Zinc Finger Nuclease，ZFN)就是前一段所述的基因精确修饰 技术，由一个特异性的DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。在ZFN识别结构域中， 一个锌指结构可以特异识别多个（通常是3个）连续的碱基，多个锌指结构能够识别一连 串的碱基。所以，在ZFN的设计过程中，锌指识别结构域的氨基酸序列是重点，特别是设计 如何将多个赖氨酸2-组氨酸2 (Cys2-His2)锌指蛋白串联，以及如何通过改变α螺旋的16 氣基酸残基决定每个梓指蛋白识别的特定二联体喊基。
[0006] ZFN技术在基因靶向修饰方面的可行性使得其广泛应用于个体水平和细胞水平的 基因修饰。首先人们通过利用ZFN技术实现了细胞水平的基因定向修饰。如Sangamo公司 于2005年首次在人类培养细胞系中实现ZFN介导的基因打靶，2007年应用同样的ZFN通过 同源重组基因实现了基因定点插入。最近，人们利用ZFN分别在人的iPS和ES细胞中实现 了基因的靶向突变。
[0007] 相比之下，转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN)有更多优势，它是继锌指核酸酶技术以来的另一种能够对基 因组进行高效定点修饰的新技术。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白（TALEs)能够识 另Ij、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。 将TALEs与FokI核酸内切酶的切割域相连接，形成TALEN，从而可以实现对基因组DNA双链 在特定位点进行修饰。
[0008] 在TALE的中央存在着一个重复区域，这个区域通常是由33-35个氨基酸的数量可 变的重复单元构成。重复序列结构域（Repeat Domain)负责识别特异性的DNA序列。每 个重复序列基本上都是一样的，除了两个可变的氨基酸，即重复序列可变的双氨基酸残基 (Repeat-Variable Diresidues, RVD)。TALE识别DNA的机制在于一个重复序列上的RVD能 够识别DNA靶点上的一个核苷酸，再融合FokI核酸内切酶，组合成TALEN。TALEN是一种异 源二聚体分子（两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域），能够切割 两个相隔较近的序列，从而使得特异性增强。该酶的效率高，毒性小，制备周期短，成本低等 优势越来越明显。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供能够特异识别猪Hll位点的多肽。
[0010] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，首先根据猪Hll位点的基因序列的部 分片段设计了靶点序列，其具体的核苷酸序列如序列表中的序列1所示、如序列表中的序 列2所示、如序列表中的序列3所示、如序列表中的序列4所示和/或如序列表中的序列5 所示。
[0011] 进一步的，本发明提供了六对特异识别猪Hll位点的多肽，该多肽均由多肽甲和 多肽乙组成，所述多肽甲和多肽乙均由18个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单 元中具有两个重复序列可变的双氨基酸残基；
[0012] 进一步的，上述多肽对的具体地序列如下：
[0013] 1)多肽甲的序列具体如序列表中的序列6所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列7所示；
[0014] 2)多肽甲的序列具体如序列表中的序列8所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列7所示；
[0015] 3)多肽甲的序列具体如序列表中的序列9所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列7所示；
[0016] 4)多肽甲的序列具体如序列表中的序列6所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列10所示；
[0017] 5)多肽甲的序列具体如序列表中的序列8所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列10所示；
[0018] 6)多肽甲的序列具体如序列表中的序列9所示，多肽乙的序列具体如序列表中的 序列10所示；
[0019] 本发明的另一个目的是提供了编码上述多肽对的DNA分子。
[0020] 进一步得，上述DNA分子包括编码多肽甲的DNA分子甲和编码多肽乙的DNA分子 乙。
[0021] 进一步得，上述DNA分子的核苷酸序列如下：
[0022] 1)编码序列表中序列6所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列11 所示，编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示；
[0023] 2)编码序列表中序列8所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列13 所示，编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示；
[0024] 3)编码序列表中序列9所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列14 所示，编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示；
[0025] 4)编码序列表中序列6所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列11 所示，编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示；
[0026] 5)编码序列表中序列8所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列13 所示，编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示；
[0027] 6)编码序列表中序列9所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列14 所示，编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示；
[0028] 7)将1)?6)中所述的编码多肽的DNA分子的核苷酸序列经一个或几个碱基的取 代和/或缺失和/或添加且具有与1)?6)中的核苷酸序列具有同样编码功能的核苷酸序 列。
[0029] 本发明的另一个目的是提供所述多肽在特异识别和靶向修饰猪Hll基因中的应 用。所述的猪Hll基因，其核苷酸序列是如序列表中的序列16所示。
[0030] 本发明的再一个目的是提供上述多肽在构建猪Hll基因突变库中的应用。所述的 猪Hll基因，其核苷酸序列如序列表中的序列16所示。
[0031] 本发明提供的六对特异识别猪Hll基因的多肽，并提供了该多肽对的编码基因。 本发明将上述多肽对用于对猪Hll位点的识别，可以使细胞中的目的基因被特异切割，在 细胞自身修复系统的作用下，可以得到目的基因的突变库。本发明提供的多肽对能在细胞 或个体水平上对猪Hll基因进行敲除或修饰，以解析猪Hll基因的功能、构建猪Hll基因突 变库，为培育优良品系的猪提供前期技术支持，为转基因猪的制备提供了稳定的平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1是载体L15骨架图；
[0033] 图2是载体RlO骨架图；
[0034] 图3是载体R12骨架图；
[0035] 图4为TALEN系统切割的位点结构示意图；以及
[0036] 图5为6对多肽酶切结果电泳图。
【具体实施方式】
[0037] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0038] 实施例I TALEN的构建
[0039] 1、目标序列的构建
[0040] 本发明首先根据猪Hll位点的基因序列（具体序列如序列表中的序列16所示）， 根据PAM序列选择用于基因敲除的多肽靶点，如下：5' -TACTGAAATGTGACCTACTTTCTTATGTTC CTGGAAGTTTAGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3，
[0041] 2、TALEN 位点设计
[0042] 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因，因为FokI需形成2聚体 方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔14-18碱基）的靶序列 (一般十几个碱基）分别进行TAL识别模块构建。
[0043] 根据该靶点设计TALEN系统切割的位点，示意图见图4,具体序列如下：
[0044] Ll :5' -TTCTTATGTTCCTGGAAG-3' T 载体：L15，该载体的结构为： cmv-sp6-NLS-TAL-T-IRES-pur〇-pA，该载体的骨架图见图 1 ;
[0045] L2 :5' -TCTTATGTTCCTGGAAGT-3' T 载体：L15，该载体的结构为： cmv-sp6-NLS-TAL-T-IRES-pur〇-pA，该载体的骨架图见图 1 ;
[0046] L3 :5' -CTTATGTTCCTGGAAGTT-3' T 载体：L15，该载体的结构为： cmv-sp6-NLS-TAL-T-IRES-pur〇-pA，该载体的骨架图见图 1 ;
[0047] Rl :3' -GTAGCCTATAAAACCCAG-5' A 载体：R10，该载体的结构为： cmv-sp6-NLS-TAL-A-pA，该载体的骨架图见图2 ;
[0048] R2 :3' -AGCCTATAAAACCCAGAG-5' C 载体：R12，该载体的结构为： cmv-sp6-NLS-TAL-C-pA，该载体的骨架图见图3 ;
[0049] 3、利用上海斯丹赛生物技术有限公司的FastTALETM TALEN快速构建试剂盒 (Cat. No. 1802-030)对TALEN进行构建，构建的步骤为：
[0050] (一）设计，根据所选择的位点选择合适的模块，设计结果如下：
[0051] 1^1:1'1'(：17六了6170^66六六6 1'载体丄15
[0052] 所选模块：TT1CT2TA3TG4TT5CC6TG7GA8AG 9
[0053] 1^2:1'(：17八丁6170^66八八61'1'载体丄15
[0054] 所选模块：TC1TT2AT3GT4TC5CT6GG7AA8GT 9
[0055] 1^:(：17六了6170^66六六61'1'1'载体丄15
[0056] 所选模块：CT1TA2TG3TT4CC5TG6GA7AG8TT 9
[0057] Rl :GTAGCCTATAAAACCCAG A 载体：RlO
[0058] 所选模块：GT1AG2CC3TA4TA5AA6AC7CC8AG 9
[0059]
[0060] 所选模块：AG1CC2TA3TA4AA5AC6CC7AG8AG 9
[0061] (二）添加模块
[0062] 按照第1步中选择的模块在200ulPCR管中分别依次加入所需模块（共5管），模 块所对应位置如下：
[0063] 表1 :模块1
[0064]
【权利要求】
1. 六对特异识别猪H11位点的多肽，其特征在于，均由多肽甲和多肽乙组成，所述多肽 甲和多肽乙均由18个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有两个重复序列 可变的双氨基酸残基； 其具体地序列如下： 1) 多肽甲的序列具体如序列表中的序列6所示，多肽乙的序列具体如序列表中的序列 7所示； 2) 多肽甲的序列具体如序列表中的序列8所示，多肽乙的序列具体如序列表中的序列 7所示； 3) 多肽甲的序列具体如序列表中的序列9所示，多肽乙的序列具体如序列表中的序列 7所示； 4) 多肽甲的序列具体如序列表中的序列6所示，多肽乙的序列具体如序列表中的序列 10所示； 5) 多狀甲的序列具体如序列表中的序列8所;^，多狀乙的序列具体如序列表中的序列 10所示； 6) 多肽甲的序列具体如序列表中的序列9所示，多肽乙的序列具体如序列表中的序列 10所示。
2. 权利要求1所述的特异识别猪H11位点的多肽，其特征在于，是依据以下靶位点设计 得到的：其具体的序列如序列表中的序列1所示、如序列表中的序列2所示、如序列表中的 序列3所示、如序列表中的序列4所示和/或如序列表中的序列5所示。
3. 编码权利要求1所示的多肽的DNA分子。
4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，包括编码多肽甲的DNA分子甲和编码 多肽乙的DNA分子乙。
5. 权利要求3所述的DNA分子的核苷酸序列。
6. 根据权利要求5所述的DNA分子的核苷酸序列，其特征在于，具体序列如下： 1) 编码序列表中序列6所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列11所 示，编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示； 2) 编码序列表中序列8所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列13所示， 编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示； 3) 编码序列表中序列9所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列14所示， 编码序列表中序列7所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列12所示； 4) 编码序列表中序列6所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列11所示， 编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示； 5) 编码序列表中序列8所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列13所示， 编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示； 6) 编码序列表中序列9所示多肽的DNA分子甲的具体序列如序列表中的序列14所示， 编码序列表中序列10所示多肽的DNA分子乙的具体序列如序列表中的序列15所示； 7) 将1)?6)中所述的编码多肽的DNA分子的核苷酸序列经一个或几个碱基的取代和 /或缺失和/或添加且具有与1)?6)中的核苷酸序列具有同样编码功能的核苷酸序列。
7. 权利要求1所述的六对多肽在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。
8.权利要求1所述的六对多肽在构建猪H11基因突变库中的应用。
【文档编号】C12N15/31GK104497110SQ201410697370
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】杨述林, 阮进学, 李奎, 李和刚, 牟玉莲, 吴添文, 魏景亮, 徐奎, 黄雷, 周荣, 刘楠 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所