同时检测四种猪rna病毒的rt-pcr引物组及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了同时检测四种猪RNA病毒的RT-PCR引物组及试剂盒，属于猪RNA病毒的多重RT-PCR检测领域。本发明首先根据GenBank公开的猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的部分已知序列设计多对引物，从中筛选出特异性强、敏感性高的引物组。在此基础上，本发明提供了一种同时检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR试剂盒。本发明多重RT-PCR检测试剂盒对PRRSV、TGEV、PEDV和CSFV能实现一次性同步检测，特异性好，敏感性高，检测程序简便，成本低。
【专利说明】同时检测四种猪RNA病毒的RT-PCR引物组及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测猪RNA病毒的RT-PCR引物组，尤其涉及同时检测猪繁殖障碍与呼 吸综合征病毒（PRRSV)、猪瘟病毒（CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)和猪流行性腹泻病 毒（PEDV)的4种RNA病毒的多重RT-PCR引物组，本发明还涉及利用所述RT-PCR引物组建 立的多重RT-PCR检测试剂盒，属于猪RNA病毒的检测领域。
【背景技术】
[0002] 在养猪生产中，多病原混合感染已是普遍现象。猪群发病，常常是两种或多种病原 体共同作用造成的，延误了诊断和防治，导致猪群高发病率和高死亡率，造成巨大的经济损 失（Allan and Ellis, 2000 ;Dorr et al.，2007 ;Ellis et al.，2000 ;Rodriguez-Ar;rioja et al.，1999 ;Segales et al.，2002, 2004)。在存在多病原混合感染的猪场，病猪临床症状 复杂，病理变化不典型，病情严重，现场难以确诊，一般防治措施也难以奏效。
[0003] 对各种病毒的检测可采用传统的诊断方法，包括病毒分离检测方法与血清学诊断 方法。病毒分离检测方法存在操作方法繁琐，诊断时间长以及由于采集样本污染造成的 结果不确定等缺陷；血清学诊断方法因病毒的变异株不断出现，在实际应用中也受到诸多 限制（Izumida et al.，1988 ;Joo and Chu, 1999 ;Kluge et al.，1999 ;Mengeling，1999 ; Prieto and Castro, 2005 ;Takashima et al·，1988)，此外，两种检测方法都存在灵敏度低 的缺点。
[0004] 商品化的PCR试剂盒多为单项PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测一种病毒，对于 混合感染3种病毒的同份猪病料要确诊病原就需要3种试剂盒并且要做3次PCR实验，不 仅费时费力，检测成本也较高。
[0005] 因此，亟待开发一种能够实现对多种猪RNA病毒一次性同步检测且敏感性高的 RT-PCR引物组及多重RT-PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastro-enteritis virus，TGEV)和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的 RT-PCR 引物组，该引物组具有特异性强、敏感性高等优点；
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种同时检测猪繁殖障碍与呼吸综合 征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒， 实现4种猪RNA病毒的一次性同步检测。
[0008] 本发明所要解决的的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明首先公开了同时检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)和猪流行性腹泻病毒（PEDV)的RT-PCR引物组，选自 以下两组引物组中的任意一组：引物组I :由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序 列组成的引物对1，由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列组成的引物对2,由 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列组成的引物对3以及由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组成的引物对4组成；
[0010] 引物组2 :由SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列组成的引物对5,由 SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列组成的引物对6,由SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列组成的引物对7以及由SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的 核苷酸序列组成的引物对8组成。
[0011] 优选的，所述RT-PCR引物组由以下各引物对组成：由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 所示的核苷酸序列组成的引物对1，由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列组成 的引物对2,由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列组成的引物对3以及由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组成的引物对4。
[0012] 本发明根据GenBank公开的PRRSV、TGEV、PEDV和CSFV的部分已知序列，设计了多 对引物。对设计的4种病毒的引物利用DNAstar进行引物二聚体分析，以避免引物之间形 成稳定的引物二聚体，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析，避免它们之间 有较高的同源性或互补性。
[0013] 本发明分别以PRRSV、TGEV、PEDV和CSFV的cDNA基因组为模板，以PRRSV、TGEV、 PEDV和CSFV的混合cDNA基因组为模板，均以引物对1、引物对2、引物对3和引物对4混合 作为引物或者以引物对5、引物对6、引物对7和引物对8混合作为引物，进行PCR扩增。结 果表明，用引物对1、引物对2、引物对3以及引物对4组成的引物组扩增后，多重RT-PCR条 带清晰，距离明显，特异性好；而用引物对5、引物对6、引物对7以及引物对8组成的引物组 扩增，多重RT-PCR未能全部扩增出目的条带。因此，本发明优选由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的引物对1，由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列组成的引物对2,由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列组成的引物对3以及 由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组成的引物对4组成的引物组作为多重 RT-PCR的引物。
[0014] 引物对的特异性检测结果表明，分别以PPV和PRV基因组DNA，分别以PRRSV、 TGEV、PEDV、CSFV和BVDV的cDNA为模板进行扩增，CSFV引物对（由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列组成的引物对2)只有以CSFV的cDNA为模板，扩增出485bp目 的条带，未见其他特异性条带；PRRSV引物对（由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷 酸序列组成的引物对1)只有以PRRSV的cDNA为模板，扩增出796bp目的条带，未见其他特 异性条带；TGEV引物对（由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列组成的引物对 3)只有以TGEV的cDNA为模板，扩增出516bp目的条带，未见其他特异性条带；PEDV引物对 (由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组成的引物对4)只有以PEDV的cDNA 为模板，扩增出213bp目的条带，未见其他特异性条带；以上结果说明CSFV引物对、PRRSV 引物对、TGEV引物对和PEDV引物对的特异性高。
[0015] 敏感性试验结果表明，应用本发明RT-PCR引物组，当CSFV、PRRSV、TGEV和PEDV 4 种病毒的混合cDNA含量大于3ng即可获得有效扩增。说明本发明RT-PCR引物组敏感性高。
[0016] 本发明所述RT-PCR引物组能够应用于制备诊断猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、 猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂。
[0017] 本发明进一步公开了一种猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃 肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，dNTPs混 合溶液，检测引物组，rTaq DNA聚合酶和灭菌去离子水；其中所述检测引物组为引物对1、 引物对2、引物对3和引物对4组成的RT-PCR引物组或者为引物对5、引物对6、引物对7和 引物对8组成的RT-PCR引物组。
[0018] 优选的，所述检测引物组为由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组 成的引物对1，由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列组成的引物对2,由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列组成的引物对3以及由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组成的引物对4组成的RT-PCR引物组。
[0019] 本发明还公开了一种应用所建立的多重RT-PCR检测试剂盒检测宿主是否感染猪 繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒或猪流行性腹泻病毒中的任 意一种或多种的多重RT-PCR方法，包括以下步骤：
[0020] (1)提取待检测样品中病毒总RNA ; (2)以提取的病毒总RNA为模板，反转录合成 cDNA ; (3)以合成的cDNA为模板，以所述引物对1、引物对2、引物对3和引物对4组成的 RT-PCR引物组为扩增引物建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3)如果从待检测的样品中 仅扩增出796bp的条带，则待检测样品仅感染猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；如果从待检 测的样品中仅扩增出485bp的条带，则待检测样品仅感染猪瘟病毒；如果从待检测的样品 中仅扩增出516bp的条带，则待检测样品仅感染猪传染性胃肠炎病毒；如果从待检测的样 品中仅扩增出213bp的条带，则待检测样品感染猪流行性腹泻病毒；如果从待检测的样品 中同时扩增出796bp、485bp、516bp和213bp的条带，则待检测样品同时感染猪繁殖障碍与 呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒。
[0021] 其中，所述PCR扩增体系为：反应体系总体积为25yL，其中，10XPCR缓冲液 2.5 4 1^，2.5臟〇1/1(1阶132.5 4 1^1(^111〇1/^1^上下游引物各14 1^。0嫩模板1.(^1^5以 μ L rTaq DNA聚合酶0. 5 μ L，余量为灭菌去离子水。
[0022] 其反应程序为：95°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35 个循环；72°C终延伸7min。
[0023] 本发明所述多重RT-PCR方法中，所述宿主优选为猪。
[0024] 应用本发明建立的多重RT-PCR方法对临床样本进行检测，结果表明，从腹泻样本 中检测到RNA病毒TGEV与PEDV各2例，而之前报道的PCR方法（Hirohito Ogawa, Osamu Taira. Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections. Journal of Virological Methods, 160,（2009)210-214.)未检测到。说明本发明的多重RT-PCR方法针对临床样本的 检测具有较高的敏感性，与之前报道的方法比较，具有明显的优势。
[0025] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0026] 本发明公开的检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病 毒和猪流行性腹泻病毒的RT-PCR引物组扩增得到的多重RT-PCR条带清晰，距离明显，特异 性高；本发明公开的猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流 行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，能实现对PRRSV、TGEV、PEDV和CSFV4种病毒的一 次性同步检测，敏感性高，检测程序简便，成本低。
[0027] 本发明所渉及到的术语定义
[0028] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0029] 术语"引物"意指一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作 为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。
[0030] 术语"聚合酶链式反应"，简称PCR，意指一种分子生物学技术，用于放大扩增特定 的DNA片段，PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左 右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5' -3'）的方向合成互补链。
[0031] 术语"多重RT-PCR"意指将一条RNA链逆转录成为互补DNA，然后再以此为模板， 在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为4种病毒的多重RT-PCR电泳图；其中，1为PRRSV、TGEV、CSFV和PEDV 4种 病毒的混合cDNA为模板得到的扩增片段；2为PEDV的cDNA为模板得到的扩增片段；3为 TGEV的cDNA为模板得到的扩增片段；4为CSFV的cDNA为模板得到的扩增片段；5为PRRSV 的cDNA为模板得到的扩增片段；M为Trans 2K DNA Marker ;
[0033] 图2为4种病毒的多重RT-PCR电泳图；其中，1为对照水；2为PRRSV、TGEV、CSFV、 PEDV4种病毒的混合cDNA基因组为模板得到的扩增片段；3为PRRSV的cDNA基因组为模板 得到的扩增片段；4为CSFV的cDNA基因组为模板得到的扩增片段；5为PEDV的cDNA基因 组为模板得到的扩增片段；6为TGEV的cDNA基因组为模板得到的扩增片段；7为M. Trans 2K DNA Marker ；
[0034] 图3为4对引物的特异性电泳图谱；其中，A为CSFV引物对的特异性电泳图；B为 PRRSV引物对的特异性电泳图；C为TGEV引物对的特异性电泳图；D为PEDV引物对的特异 性电泳图；
[0035] 图4为多重RT-PCR的敏感性试验电泳图；其中，1为3X KT3Iig PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；2 为 3X l(T2ng PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；3 为 3X KT1Iig PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；4 为 3X 10〇ng PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；5 为 3X IO1Iig PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；6 为 3X 102ng PRRSV、TGEV、PEDV 和 CSFV 混合 cDNA 为模板；M 为 Trans 2K DNA Marker。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0037] 1、菌株
[0038] 猪伪狂犬病毒（Bartha K61株）、猪细小病毒（京株）、猪繁殖障碍与呼吸综合征 病毒（Hun4F112株）、猪瘟病毒（石门株）、猪传染性胃肠炎病毒（华毒株）和猪流行性腹 泻病毒（CV777株）、牛病毒性腹泻病毒（AV69株）均由哈药集团生物疫苗有限公司保存。
[0039] 实施例1多重RT-PCR方法的建立 [0040] 1、实验方法
[0041] I. IPCR引物设计
[0042] 根据 GenBank 公开的 PRRSV (Genbank 号 NC 001961)、TGEV (Genbank 号 NC 002306)、PEDV (Genbank 号 NC 003436)、和 CSFV (GenBank 号 EU497410)的部分已知序列，设 计了多对引物见表1和表2。对设计出来的4种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分 析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进 行分析，避免它们之间有较高的同源性或互补性，表1和表2两组引物通过特异性试验进而 确定4种病毒的多重PCR引物。
[0043] 表1多重RT-PCR的引物设计
[0044]
【权利要求】
1?同时检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)、猪癌病毒（Classical swine fever virus)、猪传染性胃肠炎病毒 (Porcine transmissible gastro-enteritis virus)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)的RT-PCR引物组，其特征在于，选自引物组1或引物组2中的 任意一组引物： 弓丨物组1 :由SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的引物对1，由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列组成的引物对2,由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6 所示的核苷酸序列组成的引物对3和由SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列组 成的引物对4组成； 引物组2 :由SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列组成的引物对5,由SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列组成的引物对6,由SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列组成的引物对7和由SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的核苷 酸序列组成的引物对8组成的引物组。
2. 权利要求1所述RT-PCR引物组在制备诊断猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病 毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂或材料中的应用。
3. -种同时检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪 流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括：10 X PCR缓冲液，dNTPs混合溶液，检测引 物组，rTaq DNA聚合酶和灭菌去离子水；其特征在于：所述检测引物组为权利要求1所述的 RT-PCR引物组。
【文档编号】C12Q1/68GK104328223SQ201410697381
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】丁国杰, 李彦伟, 涂映霞, 梁宛楠, 刘鑫莹, 张凤强, 杨朋欣, 王彬, 李来旭, 魏宏宇 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司