专利名称：一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法。
背景技术：
猪Kobu病毒是一种无包膜的正链RNA病毒,隶属于小RNA病毒科Kobu病毒属，目前公认的Kobu病毒属有四个成员，分别为Aichi病毒,牛、猪和羊Kobu病毒。Aichi病毒于1991年从一个急性胃肠炎的日本病人中分离到，而牛的Kobu病毒则于2003从日本的牛群·排泄物中检测到。2007年在匈牙利猪群排泄物中分离到猪的kobu病毒，次年在匈牙利的羊排泄物中分离到羊的Kobu病毒。在正常猪群中，Kobu病毒阳性率较高，匈牙利为65%，日本为45%，而我国正常猪群中检测阳性率为30%，另有报道在泰国对急性腹泻猪群的检测时发现Kobu病毒的阳性率高达99%。自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100%。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5%,而猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86. 6%。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施以及商业化的检测试剂盒问世，因此研制Kobu病毒检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。环介导的等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由T. Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测Kobu病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法，可以高效快速的对猪Kobu病毒进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其包含以下组分RT-LAMP反应试剂该试剂运用无菌双蒸水配制，每个反应加入24 μ LLAMP反应液，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCKpH 8. 8), IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1 % Triton X-100)，IOU AMV 反转率酶，1 SOmmoI 的 MgSO4, 25mmol 的甜菜喊，30mmol 的 dNTP, 4. 5pmol 的引物 Pl，4. 5pmol的引物P2,45pmol的引物P3,45pmol的引物P4,其中各引物序列分别为PlTGCCTTCCGCATTGTTGAG,P2 GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA, P3 CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA,P4 CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)从NCBI数据库Genbank中查找Kobu病毒序列，运用序列比对软件DNAstar进行同源性分析，获得Kobu病毒的保守靶序列；2)根据步骤I)获得的序列运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行引物设计，选取保守序列区作为构建试剂盒所使用引物，引物序列分别为PlTGCCTTCCGCATTGTTGAGP2 GGAAAAGTCAGGGTGTTGGAP3 CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGAP4 CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA ；3)将步骤2)所设计的引物进行合成，运用无菌双蒸水配制LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCKpH 8. 8), IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,1 % Triton X-100)，IOU AMV 反转率酶，150mmol 的 MgSO4, 25mmol 的甜菜喊，30mmol 的 dNTP, 4. 5pmol 的引物 Pl，4. 5pmol 的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4 ；取上述步骤(3)配制的试剂加入I μ L待检测模板混匀后，置65°C反应I小时，反应完成后观察反应管中是否出现混浊以判定扩增结果，为方便观察，可在反应后将反应管置离心机内12000转/分离心I分钟，观察管底有无白色沉淀，如果观察到白色沉淀则判为阳性。本发明的有益效果为闻特异性和闻敏感性，运用四条引物，针对Kobu病毒序列的四个保守区域进行扩增，其特异性和敏感性均比同条件下的PCR和定量PCR高；操作简单，易于判定，扩增反应只需要一个恒温水浴锅即可，而且可以在一个小时内完成扩增反应；结果判定简单，可以运用肉眼判定是否出现混浊以判断是否有特异性的扩增，与普通PCR和定量PCR相比较而言，不需要昂贵的仪器设备，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染。
具体实施例方式Kobu病毒RT-LAMP弓丨物设计与筛选
登录NCBI 网站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/,查找 Genbank 公布的 Kobu 病毒的序列，运用DNAstar进行序列比对后，以猪博卡病毒基因组序列⑶292559为模板，运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行LAMP反应引物设计,从设计的引物序列中选取如下4条引物进行特异性、敏感性的实验并最终确认试剂盒使用的引物组分，PlTGCCTTCCGCATTGTTGAG,P2 GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA,P3 CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA,P4 CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA,
运用正交实验进行各组分的优化，确立以上所述引物在LAMP试剂盒中使用的比 例及其反应浓度，每个反应体系中各引物的反应浓度为4. 5pmol的引物Pl，4. 5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4。试剂盒的组装(以50个反应为例)本发明所述试剂盒仅由LAMP反应液构成，该反应液由灭菌双蒸水配制，其中规格为50个反应的试剂盒中含有I. 2ml LAMP反应液，每个反应用量为24 μ L，该24 μ L反应液中各组分及浓度如下=IOU的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl (pH8. 8)，IOOmM KCl，IOOmM(NH4) 2S04,1 % Triton X-100)，IOU AMV 反转率酶，150mmol 的MgSO4, 25mmol 的甜菜喊，30mmol 的 dNTP, 4. 5pmol 的引物 Ρ1，4· 5pmol 的引物 P2,45pmol 的引物P3，45pmoI的引物P4，然后组装成试剂盒。Kobu病毒RT-LAMP试剂盒的使用按照常规方法提取RNA，然后取I μ L所提取的RNA样品，加入到O. 2ml薄壁PCR反应管中，随后加入24yL RT-LAMP反应液，轻微混匀，置水浴锅中，65 °C反应45-60分钟。反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心I分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。试剂盒的敏感性实验按照常规RNA提取方法，提取Kobu阳性病料总RNA，进行10倍系列稀释，选取10卜7等7个稀释度，用该发明制备的试剂盒进行敏感性实验，对反应结果运用凝胶电泳和肉眼观察沉淀等方法进行验证。电泳结果显示，随着模板浓度的降低，其电泳结果差异不显著，离心观察沉淀量亦无显著差异。IO1倍 IO5倍稀释均可检测到KobU病毒核酸。试剂盒的特异性实验验证分别运用常规DNA和RNA提取方法提取猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等病毒的DNA或者RNA，以灭菌双蒸水作为阴性对照，Kobu病毒RNA作为阳性对照，运用试剂盒进行检测。检测结果发现Kobu病毒呈阳性，其它均成阴性。该结果表明，本发明制备的检测Kobu病毒的试剂盒具有特异性。
权利要求
1.一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于其包含运用无菌双蒸水配制的RT-LAMP反应液，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液，IOU AMV反转率酶，150mmol的MgSO4, 25mmol的甜菜碱，3Ommo I 的 dNTP，4. 5pmo I 的引物 PI，4. 5pmo I 的引物 P2，45pmo I 的引物 P3，以及 45pmo I 的引物P4，其中各引物序列分别为Pl TGCCTTCCGCATTGTTGAG,P2 GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA,P3 CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA,P4 CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。
2.根据权利要求I所述的用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述聚合酶缓冲液由以下组分制成pH 8. 8的200mM Tris-HCl, IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4,，以及 1% Triton X-IOO0
3.一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)从NCBI数据库Genbank中查找Kobu病毒序列,运用序列比对软件DNAstar进行同源性分析，获得Kobu病毒的保守靶序列； 2)根据步骤I)获得的序列运用PrimerExploreV4在线引物设计软件进行引物设计，选取保守序列区作为构建试剂盒所使用引物； 3)将步骤2)所设计的引物进行合成，运用无菌双蒸水配制LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24 μ L包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2. 5μ L的聚合酶缓冲液，IOUAMV 反转率酶，1 SOmmoI 的 MgSO4, 25mmol 的甜菜喊，30mmol 的 dNTP, 4. 5pmol 的引物 Pl，.4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，以及45pmol的引物P4，其中各引物序列分别为PlTGCCTTCCGCATTGTTGAG,P2 GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA,P3 CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA,P4 CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。
4.根据权利要求I所述的用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于，所述聚合酶缓冲液由以下组分制成pH 8. 8的200mMTris-HCl，100mM KCl,IOOmM(NH4)2SO4,，以及 1% Triton X-IOO0
全文摘要
本发明涉及一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含运用无菌双蒸水配制的RT-LAMP反应液，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，10UAMV反转率酶，150mmol的MgSO4，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，以及45pmol的引物P4。本发明的有益效果为本发明可以高效快速的对猪Kobu病毒进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。
文档编号C12Q1/70GK102912034SQ201110223260
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者李帅伟, 于宾宾 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司