专利名称：：一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用，属于生物检测领域。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起，以高热，发病率和死亡率高，成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，仔猪呼吸异常为特征，是一种接触传染性疾病。仔猪发病率可达100%,死亡率在50%左右；母猪流产、死胎等可达30%以上，对养猪业危害较大。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局(1996)已将本病例为B类传染病。近几年，由于PRRSV不断变异，毒力更强的新型PRRSV毒株严重危害着养猪业。2006年入夏以来，我国南方一些猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，运用分子生物学方法诊断与鉴定，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株为主要病原之一。PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。病毒检测方法1.血清学试验血清学方法是目前广泛应用于实验室的诊断方法。目前国内外已经建立了4种检测PRRS抗体的方法免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)IPMA是广泛用于该病诊断的一种方法，敏感性和特异性都比较好，可用于PRRSV的抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。目前该方法在欧美等国家已经广泛用于PRRSV感染的研究中。试验主要在PAM、CL2621及MARC-145培养物上进行。IPMA能在感染后6天血清中检测到PRRSV抗体，具有较高的特异性。间接荧光抗体试验(IFA)免疫荧光抗体染色技术是应用异硫氰酸荧光素标记，建立了免疫荧光抗体染色技术用于直接检测仔猪肺组织中的抗原。有的直接釆集小猪的肺泡巨噬细胞进行直接培养，用病毒特异性荧光抗体进行诊断。血清中和试验(SN)SN检测PRRS抗体虽然特异性好，但PRRS的SN抗体比IFA抗体在血清中出现的晚，对急性感染的敏感性较差，因此SN不适宜于早期诊断，而且细胞培养工作量大、技术性强，目前仅限于实验室研究应用。作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)ELISA灵敏度高，特异性好，制好的诊断膜片常温下保存时间长，携带寄送方便，操作简便，快速(3h内即可完成)，不需特殊实验条件，反应板可重复使用多次，结果客观，肉眼易于判断。目前英国已把间接ELISA作为监测诊断的常规手段。童光志等利用杆状病毒表达的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白建立了ELISA诊断方法。目前已有商品化ELISA试剂盒问世，经济方便，适合于大批样品的检2分子生物学诊断技术利用RT-PCR,核酸探针，序列测定和原位杂交等方法对PRRS进行分子诊断和分型，从分子水平揭示抗原变异的基础和毒株演化过程。RT-PCR扩增病毒基因组的通用引物分别针对欧美毒株的特异性引物进行分型鉴定。嵌套性RT-PCR中同时使用通用引物和特异性引物在一次PCR反应中即可进行分型诊断。利用反转录扩增所得的cDNA片段进行放射性同位索或光敏生物紊或地高辛标记后制备DNA探针，通过Nerthem杂交捡测PRRSV培养物或病料中提取的RNA，也是一种简便、稳定的诊断方法。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。IPMA、IFA和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。以上方法存在着各种不同的缺陷，如技术条件要求高、设备比较昂贵等。PRRSV基因组结构及其编码的蛋白已被人们进一步的认识和了解，而在病毒基因组所编码的蛋白中，由ORF7编码的核衣壳蛋白(N)高度保守，即使是在体内传代也很少引起ORF7的核苷酸序列变异。另外，N蛋白激发的免疫反应最强，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的，猪感染PRRSV后，一周后即可检出N蛋白抗体，且N蛋白抗体维持时间较长。因此，N蛋白是PRRS新型诊断抗原的首选蛋白。核衣壳蛋白(N)所具有的特性引起人们的普遍重视，并且各国学者围绕这一蛋白开展了许多研究，证明该蛋白在本病诊断中发挥着重要作用，也为本课题的研究提供了重要依据。胶体金免疫层析法(ImmunochromatographyAssay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。针对猪蓝耳病的流行现状和防治要求，对于猪蓝耳病的诊断，不但要求高的特异性和敏感性，还需要快速、简便、易于基层医疗和卫生单位使用。
发明内容本发明的目的是提供一种用方便、快捷，用于检测猪蓝耳病毒抗体的试纸条，检测猪全血、血浆或血清标本中猪蓝耳病毒抗体，用于猪蓝耳病的辅助诊断。本发明的另一目的是提供一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法。本发明的再一目的是提供一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其包含同时包被猪蓝耳病毒N蛋白和抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体两个条带的硝酸纤维膜；及含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜。其中，所述猪蓝耳病毒N蛋白通过原核表达制备获得。所述硝酸纤维膜中猪蓝耳病毒N蛋白的浓度为3.5±0.1mg/ml，所述猪蓝耳病毒N蛋白多克隆抗体的浓度为2.0±0.1mg/ml。所述玻璃纤维膜中胶体标记的猪蓝耳病毒N蛋白的pH值为8.08.4,胶体金和猪蓝耳病毒N蛋白的配比为以36吗蛋白/ml胶体金。本发明所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。反应支持物优选PVC板；吸水垫优选滤油纸；金标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。一种所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤1)制备猪蓝耳病毒N蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体；2)硝酸纤维膜的制备将猪蓝耳病毒N蛋白稀释成3.5±0.1mg/ml，将猪蓝耳病毒N蛋白多克隆抗体的浓度稀释成2.0±O.lmg/ml,喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37"C中干燥2小时，备用；3)玻璃纤维膜的制备将胶体金调整pH值为8.08.4，胶体金和猪蓝耳病毒N蛋白的配比为以36(ag/ml胶体金，经稳定剂(含0.05%BSA，pH8.0,O.OlMTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65pl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。本发明所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条在检测猪蓝耳病毒中的应用。本发明釆用纯化的猪蓝耳病毒N蛋白和抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白，应用膜层析双抗原夹心法的原理检测标本中的猪蓝耳病毒抗体。本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的猪蓝耳病毒抗原，达到快速筛检病猪，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪蓝耳病毒的感染诊断起到辅助作用。图1A为本发明所述猪蓝耳病毒抗体检测试纸条的正面示意图；图1B为本发明所述猪蓝耳病毒抗体检测试纸条的侧面示意图。其中1吸水垫；2硝酸纤维膜(T:猪蓝耳病毒N蛋白的条带；C:包被抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体的质控条带)；3含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜；4金标抗体保护膜；5反应支持物。图2为检测试纸条检测结果示意图。从左至右依次为T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1猪蓝耳病毒N蛋白的克隆及表达(1)目的基因的获得猪蓝耳病病毒基因组由北京畜牧兽医研究所提供。pET-32a(+)表达载体及PMD-18T向Novagen公司购买。根据pET-32a(+)表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶BamHI、XhoI酶切位点的引物上游为5'CGGATCCATGCCAAATAACAACG3'下游为5，GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT3'扩增出目的片断N,扩增条件94。C变性3min，94'C45s,56'C复性90s，72。C延伸90s,进行30个循环，最后72。C延伸10min。(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16。C过夜连接后，转化到DH5a感受态细胞中，挑取单克隆37。C过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆，送测序。(3)N基因融合表达载体的构建用限制性内切酶BamHI、XhoI分别酶切T/N和pET-32a(+),1%琼脂糖电泳切胶回收N基因目的片段和pET-32a(+)双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16。C过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养810小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1%琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒送出测序。(4)pET32a-N基因融合蛋白的诱导表达筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照h100的比例接种至1000mlLB液体培养基中，37'C摇床培养。N基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm0.5)，IPTG浓度0.4mmol/L，37。C诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。(5)pET32a-N融合蛋白的纯化、鉴定将(4)中1000ml菌液12000r/m、4'C离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有HIS标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，Western-blot鉴定融合蛋白的免疫活性。实施例2:猪蓝耳病毒N蛋白多克隆抗体制备(1)动物免疫选择l2kg的新西兰白兔，用猪蓝耳病毒N蛋白于背部皮下多点注射，免疫剂量为0.5lmg/kg。共免疫35次。(2)免疫效价检测包被猪蓝耳病毒N蛋白酶标板，每孔4jag。按间接ELISA法检测免疫血清的效价。血清效价达到l:20000以上，可釆集血清。(3)抗体提纯及检定釆用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白一条带。活性采用ELISA检定，效价大于l:16000。实施例3:猪蓝耳病毒抗体检测试剂条的研制(参见图l)(1)胶体金-抗原结合物的制备经实验确定，猪蓝耳病毒N蛋白与胶体金最佳结合pH值为8.4，胶体金和猪蓝耳病毒N蛋白的配比为36昭/ml胶体金。经稳定剂(0.5%BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，标记胶体金抗原稀释至OD2.0，按每平方厘米65pl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。(2)包被抗原及抗体于硝酸纤维膜将猪蓝耳病毒N蛋白用0.01MPBS稀释成3.5士0.1mg/ml。将抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体用0.01MPBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将二者以lpl/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。把固定有抗体的硝酸纤维置37t:烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。(3)猪蓝耳病毒抗体检测试剂条的组成反应支持物5为6.5cmx0.4cmPCV板;吸水垫1为2cmx0.4cm的滤油纸；1.8cmx0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗猪蓝耳病毒的多克隆抗体、猪蓝耳病毒N蛋白；含有0.4cmx0.4cm胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜3;金标抗体保护膜4为2.7cmx0.4cm的滤纸纤维；即形成了猪蓝耳病毒抗体快速检测试纸条。(4)猪蓝耳病毒抗体检测试剂条特异性及敏感度实验特异性实验根据猪蓝耳病毒的致病机理及病理表现，本产品与下述病原感染的猪血清进行交叉反应性检测，结果表明，本产品与表中所列病原血清无交叉反应，说明本产品相对于表l中所列病原血清是特异的。表1猪蓝耳病毒抗体检测试剂条对不同病原血清的交叉反应性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>敏感度实验本产品的敏感度实验，釆用阳性猪血清。首先用全病毒ELISA对阳性猪血清的效价进行滴定，然后用生理盐水进行稀释。我们共对IO份阳性猪血清进行了实验，结果表明，本品检测血清敏感度为l:2000(ELISA)效价。如表2所示。表2猪蓝耳病毒抗体检测试剂条对不同血清稀释度的检测<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4检测方法(参见图2)将待检标本100~150ia1加入检测条的样品垫(实施例3试纸条"4"处)上，样品液沿膜向上爬行，1015分钟判读结果。结果如标本中含有猪蓝耳病毒N蛋白抗体，则与试纸条上胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白结合形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的猪蓝耳病毒N蛋白形成红色线条，即在T处形成红色条带，即为阳性结果。无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白继续向上爬行与包被在膜上的N蛋白的多克隆抗体形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110〉北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司<120>—种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用<130〉<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>23<212>廳<213〉人工序列〈400〉1cggatccatgccaaataacaacg23〈210〉2<211>23<212〉DNA<213〉人工序列<400>2gctcgagtcatgctggtgat2权利要求1.一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，其包含同时包被猪蓝耳病毒N蛋白和抗猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体两个条带的硝酸纤维膜(2)；及含有胶体金标记猪蓝耳病毒N蛋白的玻璃纤维膜(3)。2、根据权利要求1所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述猪蓝耳病毒N蛋白通过原核表达制备获得。3、根据权利要求1或2所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维膜中猪蓝耳病毒N蛋白的浓度为3.5±0.1mg/ml，所述猪蓝耳病毒N蛋白多克隆抗体的浓度为2.0±0.1mg/ml。4、根据权利要求1-3任意一项所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中胶体标记的猪蓝耳病毒N蛋白的pH值为8.08.4，胶体金和猪蓝耳病毒N蛋白的配比为36吗/ml胶体金。5、根据权利要求1-4任意一项所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、金标抗体保护膜(4)和吸水垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)。6、一种制备权利要求5所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条的方法，包括如下步骤1)制备猪蓝耳病毒N蛋白和猪蓝耳病毒N蛋白的多克隆抗体；2)硝酸纤维膜的制备将猪蓝耳病毒N蛋白稀释成3.5±O.lmg/ml,将猪蓝耳病毒N蛋白多克隆抗体的浓度稀释成2.0±O.lmg/ml,喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37"中干燥2小时，备用；3)玻璃纤维膜的制备将胶体金调整pH值为8.08.4，胶体金和猪蓝耳病毒N蛋白的配比为36昭/m服体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65pl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。7、权利要求l-6任意一项所述猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条在检测猪蓝耳病毒中的应用。全文摘要本发明提供了一种用于检测猪蓝耳病毒抗体的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被猪蓝耳病毒N蛋白和抗猪蓝耳病毒的N蛋白多克隆抗体，结合胶体金标记的猪蓝耳病毒N蛋白，应用膜层析双抗原夹心法，检测猪血清、血浆或全血标本中猪蓝耳病毒抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪蓝耳病毒的感染诊断起到辅助作用。文档编号G01N33/545GK101363858SQ20081011272公开日2009年2月11日申请日期2008年5月26日优先权日2008年5月26日发明者明刘申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司