专利名称：一种猪链球菌2型胶体金快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种猪链球菌2型特异性抗 体检测试纸条及其应用。
背景技术：
猪链球菌(Streptococcus suis)可引起猪的脑膜炎，关节炎以及败
血症等疾病，并可致青年猪猝死。该菌亦可引起人类的感染，导致脑 膜炎等严重疾患，是一种重要的人兽共患病的病原体。猪链球菌共分
为35个血清型，其中猪链球菌2型呈全球分布，且临床分离的比例 最高。在猪链球菌2型中，存在强毒、弱毒以及无毒3种不同毒力 的菌株。强毒株与无毒株的最大差别是前者呈MRP+,而后者呈 MRP- 。 MRP+的猪链球菌往往可引起严重的临床症状,MRP-的菌 株则不致任何症状，可见MRP是该菌重要的毒力因子。
流行特点链球菌广泛分布于自然界。人和多种动物都有易感性， 猪的易感性较高。各种年龄的猪都可发病，但败血症型和脑炎型多见 于仔猪，化脓性淋巴结炎型多见于中猪。病猪、临床康复猪和健康猪 均可带菌，当它们互相接触时，可通过口、鼻、皮肤伤口而传染。一 般呈地方性流行，本病传入之后，往往在猪群中陆续地出现。
临床症状自然感染的潜伏期在ld左右。最急性型突然发病， 体温升高到41-42°C，在数小时内死亡。死亡率高达50%以上。上 述症状如治疗不当可转为亚急性或慢性型，病程长迭十多天，表现为 体温时高时低，食欲不振，关节显肿大，跛行严重，消痩，治疗护理 得当可逐渐康复，否则，恶化转死。另外，还有一种单纯的慢性感染， 表现在颈部或其它部位多处长，脓胞，淋巴结肿胀，多个关节发炎， 肿痛出现跋行，若是关节炎治疗不当可导致关节变形.影响出口和种 用，或回生长迟缓降低饲料报酬。
实验室检查根据不同的病型采取相应的检查方法，如脓肿、化
脓灶、肝、脾、关节囊液、脑脊髓液及脑组织等，制成涂片，用碱性 美蓝染色液和革兰氏染色液染色。显微镜检查。见到单个、成对、短 链或呈长链的球菌，革兰氏染色呈紫色(阳性)，可以确认为本病。也 可进行细菌分离培养鉴定。
然而，这些检测方法只能做简单的病检，不能确定猪链球菌的类 型，可信度低。此外，检测时需要显微镜等实验条件，不便于猪场或 其它环境检测。
猪链球菌2型抗原的诊断主要是涂片镜检，取病猪血液、肝、脾、 淋巴结涂片染色镜检，发现单个、3-4个、4-5个短链或7-8个长链的革
兰氏阳性球菌；马丁肉汤培养，将病料接种肉汤培养基中培养48h发 现呈混浊并有大量白色絮状沉淀，培养物镜检，发现同样有革兰氏阳 性球菌；生化检测将分离物做生化反应，与葡萄糖、麦芽糖、乳糖、 果糖、蔗糖培养基均不产酸，而木糖、卫矛醇、山梨醇和菊糖培养基 不发酸。但操作繁瑣复杂，时间长。
快速检测中，多应用乳胶凝集试验。Davies用荧光抗体技术， Serhir曾用双抗体夹心ELISA方法检测病猪样品中的猪链球菌2型抗 原，该方法灵敏度和特异性达98-100%。
随着免疫技术的不断发展，先后出现了指紋图谱、核酸扩增法 (PCR)但均存在需要昂贵的仪器、操作复杂、时间长、需专业人员 等问题。
胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纟己 90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技 术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体 金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析 诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可 以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且
由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
然而，目前还有没有一种方便、快捷，能够特异性检测猪链球菌 2型的特异性检测方法。
发明内容
发明的目的在于提供一种使用方便、快捷，用于检测猪链球菌2 型特异性抗体的试纸条，用于猪链球菌2型感染的辅助诊断。 本发明的另 一 目的在于提供上述试纸条的制备方法。 本发明检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具 有包被猪链球菌2型特异性抗原MRP的检测带和包被抗猪链球菌2 型特异性抗原的多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体 金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP。
其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。 其中，猪链球菌2型特异性抗原MRP的包被量优选为3-4mg/ml， 其可通过原核表达制备获得。
本发明还提供一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步
骤
1 )制备猪链球菌2型特异性抗原MRP和抗猪链球菌2型特异性 抗原的多克隆抗体；
2)将步骤1)制备的抗原及抗体包被到反应膜上分别形成检测 线和质控线，备用；
3 )将胶体金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP包被到结合物 垫上；
4)将2)和3)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水
垫和反应支持物组装成试纸卡。
本发明还公开了所述试纸条在检测猪链球菌抗体中的应用。 本发明的技术方案是:采用纯化的猪链球菌2型特异性抗原MRP
和抗猪链球菌2型特异性抗原的多克隆抗体分别固相于硝酸纤维膜
上(NC膜)，结合胶体金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP，应 用膜层析双抗原夹心法的原理检测标本中的猪链球菌2型特异性抗 体。
本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定 性半定量检测样本中可能存在的猪链球菌2型抗体，达到快速筛检病 人和病猪，及时控制疫情的目的。为下一步的分离鉴定创造成了有利 条件，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备， 不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适 合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪链球菌2 型的感染诊断起到辅助作用。
图1:A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面 示意图。其中，1:吸水垫；2:硝酸纤维膜(T:猪链球菌2型特异 性抗原MRP; C:抗猪链球菌2型特异性抗原的多克隆抗体的质控条 带)；3:含有胶体金标记猪链球菌2型特异性抗原MRP的玻璃纤维 膜；4:金标抗体保护膜；5:反应支持物。
图2:检测结果示意图。其中，从左至右依次为T、 C两条线 阳性；C一条线阴性；T、 C两条线阴性，无效。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例1猪链球菌2型特异性抗原MRP的克隆表达
(1) MRP基因的扩增 PCR引物设计
根据MRP核苷酸序列(GenBank登陆号为EF520110),设计一 对引物，引物两端分别添加&c I和III酶切位点和保护性碱 基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型MRP基因开放阅读框(ORF) 298~827bp间529bp的片段。引物序列分别为 上游引物Pl : 5' GTAGAGCTCGAACAGGTAACATCAGA3'; 下游引物P2 : 5' CAGAAGCTTAAGAGTAACGAATGTAGG3'。 PCR扩增
按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。模板 DNA 2pL ,10 xbuffer 10pL ,25mmol/L MgCl2 8|iL ,215 mmol/L dNTPs 8(iL ，引物PI和P2 ( O.lpmol/L )各l^L , ddH20 68pL , T"《酶(5UP(iL) 3pL 。扩增的条件为:94 。C5min ; 94 。C30s ，55 。C30s ，72 。C60s ,30 个循环;72 。C10min。 PCR产物的回收和酶切
PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目 的片段，并以Sac I和历wd m酶切2h , 65 'C15min终止反应。 重组质粒的构建和鉴定
在含有100昭/mL Amp的LB肉汤中接种携带pET^a ( + )空 质粒的DH5a大肠杆菌单菌落，37 。C摇振培养12~16h，以质粒抽 提试剂盒抽提质粒，I和/7/wd III双酶切后，以DNA回收试剂 盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质粒双酶切回收产物 进行连接，并转化感受态的DH5a宿主菌。感受态细菌的制备、转化 均按常规方法进行，利用Amp的抗性和限制性内切酶进行重组菌的 筛选和鉴定，初步鉴定获得了阳性克隆10株。 重组质粒的测序和序列分析
重组质粒的序列测定釆用Sanger双脱氧末端终止法，由宝生物 工程(大连)有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进 行同源性分析，结果表明所获得的阳性克隆与目的序列完全一致。
重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21,利用Amp 抗性筛选重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100昭/mLAmp) ， 37 °C 剧烈摇振培养2 4h,当菌液浓度达」6(K) 0.5-0.6时，加IPTG至终浓 度lmmol/L , 37 。C继续剧烈摇振培养2 4h。 6000r/min离心5min ，沉 淀以pH7.2 1Ommol/L的PBS洗涤3次，加等体积的电泳上样缓冲液 煮沸10min ,SDSPAGE检测。含空pET32a ( + )的大肠杆菌BL21亦 同样经IPTG诱导处理后，SDSPAGE检测表达情况。以超声波破碎诱 导的重组菌，收集上清，以QIAgen镍亲和层析柱进行亲和层析，具 体步骤按使用说明书进行。 重组蛋白免疫检定试验
分别用收集的重组蛋白和猪链球菌2型全菌免疫小鼠，制备免疫血 清。包被MRP酶标板，分别检测MRP与全菌免疫血清和MRP免疫血 清的反应性。结果证实，所表达的蛋白具有良好的免疫原性和免疫反 应性。
实施例2: MRP多克隆抗体的制备
(1) 动物免疫
选择l-2kg的新西兰白兔，用MRP蛋白于背部皮下多点注射，免 疫剂量为lmg/kg。共免疫4次。
(2) 免疫效价检测
包被MRP蛋白的酶标板，每孔4pg。按间接ELISA法检测免疫血 清的效价。血清效价达到l: 20000以上，可釆集血清。
(3) 抗体提纯及检定
釆用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白 一条带。活性釆用ELISA检定，效价大于l: 20000。
实施例3:猪链球菌2型抗体快速检测试纸条的研制(参见图l)
(1)胶体金-MRP结合物的制备
经实验确定，MRP抗原胶体标记的最佳结合pH值为8.0,胶体金 和抗原的配比为50ing/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5%BSA， pH8.0， O.OlMTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65nl的量，取胶体 金-MRP结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥 环境中保存。
(2) 包被抗原于硝酸纤维膜 将MRP用0.01MPBS稀释成3.5mg/ml。将抗MRP的多克隆抗体用
0.01MPBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将二者以1 pl/cm的速度喷于硝酸 纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。
把固定有抗原的硝酸纤维置37'C烤箱中干燥2小时。干燥环境中 保存备用。
(3) 猪链球菌2型抗体检测试剂条组成 反应支持物为6.5cm x 0.4cmPCV板；吸水垫为2cm x 0.4cm的滤
油纸；1.8cmx0.4cm的硝酸纤维膜依次包被抗MRP的多克隆抗体，猪 链球菌2型特异性表达蛋白MRP， 0.4cm x 0.4cm的含有胶体金标记的 MRP的玻璃纤维；金标抗体保护膜(样品垫)为2.7cm x 0.4cm的滤纸 纤维；即形成了猪链球菌2型抗体检测试纸条(胶体金法)。
(4) 猪链球菌2型抗体检测试剂条特异性及敏感度
特异性实验猪链球菌分为多个群，共35个型。本产品特异性针对 2型猪链球菌，因此设计如下特异性质控品30份正常猪血清，猪囊 虫病血清，猪弓形虫血清，猪旋毛虫血清、猪瘟病血清，猪空肠弯曲 菌血清。检测结果表明，猪链球菌2型抗体检测试剂条与上述各种对 照血清均无交叉反应。
敏感度检测用猪链球菌2型凝集血清作为阳性质控品，结果表明， 本品最低检出量为l: 40。
实施例4:检测方法(参见图2)
将待检标本(全血、血清或血浆)100 - 150ul直接滴加入实施例
2试纸条"4，，处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。 结果
如样本中含有猪链球菌抗体，则与试纸条上胶体金标记的猪链球 菌2型特异性抗原形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的 猪链球菌2型特异性抗原结合形成红色线条，即在T处形成红色条 带。
无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记的猪链球菌2型特异性 抗原继续向上爬行与包被在膜上的抗猪链球菌2型特异性抗原的多 克隆抗体，结合形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是 质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。
序列表
<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 <120〉 一种猪链球菌2型胶体金快速检测试纸条 〈130〉
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
gtagagctcg aacaggtaac atcaga 26
〈210〉 2
<211> 27
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 2
cagaagctta agagtaacga atgtagg 2权利要求
1、一种检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被猪链球菌2型特异性抗原MRP的检测带和包被抗猪链球菌2型特异性抗原的多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP。
2、 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的猪链球菌 2型特异性抗原MRP通过原核表达制备获得。
3、 如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，猪链球菌2 型特异性抗原MRP的包被量为3-4mg/ml。
4、 如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述的反应膜为硝酸纤维素膜。
5、 如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述的结合物释放垫为玻璃纤维膜。
6、 一种制备权利要求1~5任一项所述试纸条的方法，包括如下1) 制备猪链球菌2型特异性抗原MRP和其多克隆抗体；2) 将步骤l)制备的抗原及多克隆抗体包被到反应膜上分别形成 检测线和质控线，备用；3 )将胶体金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP包被到结合物 垫上，备用；4)将2)和3)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水 垫和反应支持物组装成试纸卡。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤l)制备猪 链球菌2型特异性抗原MRP的方法是由原核表达，并将表达产物经 亲和层析纯化后获得。
8、 权利要求l-5任一所述试纸条在检测猪链球菌2型中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测猪链球菌2型抗体的快速检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被猪链球菌2型特异性抗原MRP的检测带和包被抗猪链球菌2型特异性抗原的多克隆抗体的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的猪链球菌2型特异性抗原MRP，应用膜层析双抗原夹心法，检测标本中猪链球菌2型的特异性抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对猪链球菌2型的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/569GK101363854SQ200810112720
公开日2009年2月11日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者明 刘 申请人:北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司