猪h11位点的dna片段及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了猪H11位点的DNA片段及其应用。上述的猪H11位点的DNA片段的序列如序列表中的序列1所示，该位点可用于构建猪定点突变库。在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,可为培育优良品系的猪提供前期技术支持。
【专利说明】猪H11位点的DNA片段及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及能被定点插入的猪Hll位点的DNA片段 及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列，将目的基因片段导入宿主细 胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有 基因型得到加强的作用。基因修饰目前已经广泛应用于人类生活的各个领域，例如，在医学 上，可以利用基因修饰的方法抑制某些病毒类宿主细胞内的病毒复制，从而达到治疗的目 的；在农业上，利用基因修饰的方法，人们已经成功地改变了农作物和畜禽的生产特性，从 而达到改良以及传播优良品种的目的。
[0003] 在基因修饰的过程中，通常需要进行目标基因的表达，那么就需要有一个载体去 容纳你要的目标基因。而DNA编码密码子是3个一个。外源目标基因不能随便插入，否则不 能正确表达，还会把原有的顺序弄乱，造成基因重排。插入位点就是可以插入基因的位点， 在它那里插入外源基因，不会改变原有质粒的复制及表达，还能使自身有正常表达的机会。 目前，使用较多的插入位点是R〇s26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱 表达，难以做到组织特异性表达，因此需寻求一种更适宜的插入位点。
[0004] 2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研宄团队在小鼠的第11号染色体 上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hippll位点，简称Hll位点。Hll位点 位于Eif4enifl与Drgl两个基因的间隙，与Eif4enifl基因的19号外显子和Drgl基因的 9号外显子相邻，大小约5kb。Hll位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉 默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hippll位点定点基因修饰的小鼠与野生型小 鼠生长发育无区别。此外，Hll位点由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以 选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪 的基因组中定位hippll这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技 术体系。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术不足提供一个供基因插入的猪Hll位点。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 所述的猪Hll位点的核苷酸序列，如序列表中的序列1所示。
[0008] 进一步的，上述的猪Hll位点的核苷酸序列，如序列表中的序列2所示。
[0009] 可进一步的，上述的猪Hll位点的核苷酸序列，如序列表中的序列3所示。
[0010] 本发明的另一个目的是将上述基因位点用于构建猪定点突变库上。
[0011] 本发明的再一个目的是提供一种含有上述猪Hll位点序列的试剂盒。
[0012] 本发明提供的猪Hll基因位点由于位于两个基因之间，并且不存在启动子，所以 可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的完成目的基因的定点 插入。此外，在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在 猪的基因组中定位Hll这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪Hll 基因进行敲除或修饰，以构建猪Hll基因突变库，为培育优良品系的猪提供前期技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为测序检测分析酶切载体结果图；
[0014] 图2为利用CRISPR/cas9靶向切割系统构建的绿色荧光蛋白定点插入猪Hll位点 后细胞PCR扩增鉴定结果图；以及
[0015] 图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察 图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。
【具体实施方式】
[0016] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0017] 如【背景技术】中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外 源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来了麻烦，为了克服上述缺陷，本发明提供了一 种能定点插入的位点序列，利用该位点可构建该位点的切割系统以及定点插入的打靶载体 系统，该方法操作简单，同时能让外源基因稳定在Hll表达，为转基因搭建了稳定的平台。
[0018] 下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。
[0019] 实施例1CRISPR/Cas9靶向定点切割系统的构建
[0020] 1、根据我们提供的猪Hll位点序列，设计用于基因敲除的多肽靶点，如下：5'-TAC TGAAATGTGACCTACTTTCTTATGTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3'，
[0021] sgRNA 靶位点位置 1 (命名为 Hl 1-sgl) : 5 ' -GTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGG-3 '，相对应 的SgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列为5' -UGAUCUAAACUUCCAGGAAC-3'。
[0022] sgRNA 靶位点位置 2 (命名为 Hl l-sg2) : 5 ' -AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG-3 '，相对应 的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列为5' -AGAGCUGCCCACCCUGAUAU-3'。
[0023] 2、sgRNA表达质粒构建
[0024] 使用唯尚力德公司的cas9/gRNA构建试剂盒（Catalog. No. VK001-01)完成构建， 构建过程如下：
[0025] (1)根据前面所述的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远公司合 成，具体序列见表1 :
[0026] 表1两个sgRNA革巴点引物序列
[0027]
【权利要求】
1. 猪H11位点的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
2. 根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列2所 不〇
3. 根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中的序列 3所示。
4. 权利要求1所述的H11位点在构建猪定点突变库上的应用。
5. 含有权利要求1所述的猪H11位点序列的试剂盒。
【文档编号】C12N15/11GK104498481SQ201410697384
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】李奎, 阮进学, 杨述林, 李和刚, 牟玉莲, 吴添文, 魏景亮, 徐奎, 黄雷, 周荣, 刘楠 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所