一种区分樱桃果实颜色的分子方法
【专利摘要】一种区分樱桃果实颜色的分子方法，该方法包括：A.取不同樱桃叶片，提取基因组DNA；B.采用PCR方法扩增基因LGS；C.电泳检测，在0.8％琼脂糖胶(EB)上电泳，紫外灯下观察扩增的DNA片段；D.对有条带的样品进行PCR产物测序；E.区分结果：没有扩增到LGS基因，该品种为黄色；能够扩增到完整LGS基因的为紫红色品种；能够扩增到LGS基因，但在1214bp位置上有一个碱基A发生缺失的，则为黄底红晕品种。该方法通过一个基因检测可以区分黄色、黄底红晕、紫红色樱桃三类品种，为樱桃育种服务，尤其为童期樱桃的快速选择提供技术支持。
【专利说明】-种区分樱桃果实颜色的分子方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种区分樱桃果实颜色的方法，特别涉及一种区分樱桃果实颜色的分 子方法。
【背景技术】
[0002] 果实颜色是果实重要的外观品质，花青素是决定大多数果实颜色，也是果实成熟 的标志。花青素又称花色素，是植物产生的次生代谢物质。花青素是一种水溶性色素，存 在于植物中的特定组织和细胞中，如植物细胞的液泡内，花青素由外部和内部因素共同调 控（Procissi 等，Light-dependent spatial and temporal expression of regulatory genes in developing maize seeds. The Plant Cell, 1997,9 :1547-1557 ;Cominelli E等， Expression analysis of anthocyanin regulatory genes in response to different light qualities in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology,2008,165 ： 886-894)。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层，也是植物果实中的主 要呈色物质（Allan 等，MYB transcription factors that colour our fruit. Trends in Plant Science，2008,13:99-102)。花青素对植物的生殖来说非常重要，由于鲜艳的 花色可吸引昆虫授粉，鲜艳的果实也利于种子传播等（Jimenez-Garcia等，Vazquez-Cruz M A. Functional properties and quality characteristics of bioactive compounds in berries !biochemistry, biotechnology,and genomics. Food Research Internation, 2013http://dx. doi. org/10. 1016/i. foodres. 2012. 11. 004) 〇 花青素也是果实成熟的标 记（Allan 等，MYB transcription factors that colour our fruit. Trends in Plant Science, 2008,13 :99-102 ;Jaakola,New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruits. Trends in Plant Science, 2013,18 :477-483)〇
[0003] 果实的颜色是自然选择和人工选择的结果（Chagn6等，An ancient duplication of apple MYB transcription factors is responsible for novel red fruit-flesh phenotypes. Plant Physiology, 2013,161 :225-239)。遗传决定了果实中的花青素种类，同 时环境如光照、温度等影响花青素的积累。
[0004] 樱桃（Primus avium)是一种重要的果树，童期较长。另外，樱桃果实发育期又很 短，从开花到果实成熟只需要1个多月。樱桃果皮颜色很丰富，有黄色、黄底红晕、紫红色 等，在果实颜色的研究上基因（突变）是果实积累不同颜色的内在因素，基因如何区分不同 果实颜色的樱桃关于这方面的研究还未见有相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种区分樱桃果实颜色的分子方法，通 过一个基因检测可以区分黄色、黄底红晕、紫红色樱桃三类品种，为樱桃育种服务，尤其为 童期樱桃的快速选择提供技术支持。
[0006] 为实现上述目的，本发明包括如下技术方案：
[0007] -种区分樱桃果实颜色的分子方法，包括如下步骤：
[0008] A.取不同樱桃叶片，提取基因组DNA ;
[0009] B.采用PCR方法扩增基因 LGS ;
[0010] C.电泳检测，在0.8%琼脂糖胶（EB)上电泳，紫外灯下观察扩增的DNA片段；
[0011] D.对有条带的样品进彳丁 PCR广物测序；
[0012] E.区分结果：没有扩增到LGS基因，该品种为黄色；能够扩增到完整LGS基因的为 紫红色品种；能够扩增到LGS基因，但在1214bp位置上有一个碱基A发生缺失的为黄底红 晕品种。
[0013] 如上所述的区分樱桃果实颜色的分子方法，优选地，所述步骤B采用PCR方法扩增 基因 LGS的具体方法如下：
[0014] 上游引物为 ATGGAGGGTATAACTTGGGTGTGAGAA ;
[0015] 下游引物为 TAGTCCTTCTGAACATTGGTACACTGTC ;
[0016] PCR 反应体系：基因组 DNA 模板 3. 5 μ L (20ng-100ng)，10PCR 缓冲液 2. 5 μ L， MgCl22. 5μ L，dNTPSl μ L(2. 5mM)，上游引物 1 μ L(IOpM)，下游引物 1 μ L(IOpM)，Taq 酶 0· 2 μ L (2U)，加水补足至20 μ L ;
[0017] PCR 反应程序：94°C 5min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)35 个循环，72°C lOmin。
[0018] 果实颜色为黄底红晕的樱桃的LGS基因，该基因在LGS基因1214bp位置上有一个 碱基A发生缺失，其基因序列如序列表中SEQID NO. 4所示，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO. 6所示。
[0019] 本发明的有益效果在于：使用本发明的方法，在樱桃生长的童期，取一片叶子就可 以的区分黄色果实樱桃、黄底红晕樱桃以及红紫色樱桃。该方法操作简便、易于推广，非常 有利于进行樱桃辅助育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为成熟时樱桃大龙，雷尼和拉宾斯果皮和果肉的颜色。
[0021] 图2为提取的樱桃大龙，雷尼和拉宾斯的基因组DNA。
[0022] 图3为PCR扩增产物的凝胶检测结果，大龙没有扩增该基因，雷尼和拉宾斯扩增到 该基因。
[0023] 图4为樱桃雷尼和拉宾斯基因组LGS基因序列以及比对结果。
[0024] 图5为26份樱桃PCR扩增LGS基因的电泳结果。M为DNA Marker，1-26分别为 Royal Ann、Chelan、Critalina、Sam、B. TAR、佳红、红南阳、彩霞、先锋、红蜜、Linda、Sonata、 BlackYork、巨红、伯兰特、Santina、早大果、早丹、Vega、Black Gold、S-106、彩虹、133、大 龙，雷尼和拉宾斯。
[0025] 图6为樱桃LGS基因关键序列的测序结果。
[0026] 图7为樱桃LGS基因关键序列的比对结果。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0028] 实施例1用本发明的方法检测大龙，雷尼和拉宾斯的颜色
[0029] 选取大龙，雷尼和拉宾斯叶片作为实验材料。大龙成熟果皮颜色为黄色，果肉黄 色；雷尼成熟果皮为黄底红晕，果肉浅黄色；拉宾斯成熟果皮颜色为紫红色，果肉红色（见 图1)。具体操作如下：
[0030] 使用Biomiga的Plant gDNA kit提取樱桃大龙，雷尼和拉宾斯三种材料的基因组 DNA，方法参考试剂盒，在0.8%琼脂糖胶（EB)上电泳，紫外灯下观察提取的基因组DNA(见 图2)。
[0031] 采用PCR方法扩增基因 LGS，PCR反应体系：分别对大龙，雷尼和拉宾斯三种材料进 行扩增。
[0032] 上游引物为 ATGGAGGGTATAACTTGGGTGTGAGAA (序列表 NO. 1);
[0033] 下游引物为 TAGTCCTTCTGAACATTGGTACACTGTC(序列表 NO. 2);
[0034] 基因组 DNA 模板 3. 5 μ L(20ng-100ng)，10PCR 缓冲液 2. 5 μ L，MgCl22. 5 μ L，dNTPS 1 μ L (2. 5mM)，上游引物 1 μ L (IOpM)，下游引物 1 μ L (IOpM)，Taq 酶 0. 2 μ L (2U)，加水补足至 20 μ L ;PCR 反应程序：94°C 5min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s) 35 个循环，72°C IOmin ;
[0035] 樱桃大龙，雷尼和拉宾斯的扩增产物在0.8%琼脂糖胶（EB)上电泳，紫外灯下观 察扩增的DNA片段，发现黄色的大龙没有扩增到这个基因，而黄底红晕的雷尼和紫红色的 拉宾斯可以扩增到约1600bp的片断（见图3);
[0036] 对以上PCR产物送交生工公司测序，测序结果和比对结果如图4,发现雷尼材料在 1214bp位置上有一个碱基A缺失（箭头所指）。
[0037] 该实验证实了：黄色品种（大龙）没有扩增到LGS基因，紫红色品种（拉宾斯）能 够扩增到完整LGS基因（基因序列见序列表NO. 3,氨基酸序列见序列表NO. 5);黄底红晕品 种（雷尼）能够扩增到LGS基因（基因序列见序列表NO. 4,氨基酸序列见序列表NO. 6)，但 在1214bp位置上有一个碱基A发生缺失。
[0038] 实施例2用本发明的方法检测26份不同颜色的樱桃
[0039] 保持其它条件不变，对26份不同颜色的樱桃进行了盲测，也就是由分子检测结果 推测果实颜色，再以成熟果实颜色证实推测结果。具体操作如下：
[0040] 使用 Biomiga 的 Plant gDNA kit 提取搜桃 Royal Ann、Chelan、Critalina、Sam、 B. TAR、佳红、红南阳、彩霞、先锋、红蜜、Linda、Sonata、BlackYork、巨红、伯兰特、Santina、 早大果、早丹、Vega、Black Gold、S-106、彩虹、133、大龙，雷尼和拉宾斯26份叶片材料的基 因组DNA，方法参考试剂盒。
[0041] 采用PCR方法扩增基因 LGS，PCR反应体系：分别取26份基因组DNA作为模板进行 扩增。
[0042] 上游引物为 ATGGAGGGTATAACTTGGGTGTGAGAA ;
[0043] 下游引物为 TAGTCCTTCTGAACATTGGTACACTGTC ;
[0044] 模板 DNA 3. 5 μ L(20ng-100ng)，10PCR 缓冲液 2. 5 μ L，MgCl22. 5 μ L， dNTPSl μ L(2. 5mM)，上游引物 1 μ L(IOpM)，下游引物 1 μ L(IOpM)，Taq 酶 0· 2 μ L(2U)， 加水补足至 20yL;PCR 反应程序 94°C 5min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)35 个循环， 72°C IOmin ；
[0045] 26份樱桃扩增产物在0. 8%琼脂糖胶（EB)上电泳，紫外灯下观察扩增的DNA片 段。发现没有扩增到这个基因的是黄色樱桃133和大龙，而其余材料均可扩增到约1600bp 的片断（见图5);
[0046] 对以上PCR产物送交生工公司测序，测序结果在1214bp上有一个碱基的差异，发 现Royal Ann、佳红、红南阳、B. TAR、彩霞、红蜜、巨红、彩虹与雷尼材料在相同位置上有一个 碱基A的缺失（箭头所指）（图6和图7)，与比对结果一致（图7)，而这些材料的果实颜色 均为黄底红晕。测序完整的材料 Chelan、Sam、Critalina、先锋、Linda、Sonata、BlackYork、 伯兰特、Santina、早大果、早丹、Vega、Black Gold、S-106,其果实颜色为紫红色，与拉宾斯 一致。
[0047] 以上结果进一步证实本发明方法的可靠性和科学性。用一个基因 LGS可以区分 樱桃，没有扩增到LGS基因，该品种果实为黄色；能够完整扩增到该基因时为紫红色果实樱 桃；能够扩增到该基因，但有一个碱基A发生缺失，则为黄底红晕樱桃。
【权利要求】
1. 一种区分樱桃果实颜色的分子方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： A. 取不同樱桃叶片，提取基因组DNA; B. 采用PCR方法扩增基因LGS ; C. 电泳检测，在0.8%琼脂糖胶（EB)上电泳，紫外灯下观察扩增的DNA片段； D. 对有条带的样品进行PCR产物测序； E. 区分结果：没有扩增到LGS基因，该品种为黄色；能够扩增到完整LGS基因的为紫红 色品种；能够扩增到LGS基因，但在1214bp位置上有一个碱基A发生缺失的为黄底红晕品 种。
2. 如权利要求1所述的区分樱桃果实颜色的分子方法，其特征在于，所述步骤B采用 PCR方法扩增基因LGS的具体方法如下： 上游引物为 ATGGAGGGTATAACTTGGGTGTGAGAA ; 下游引物为 TAGTCCTTCTGAACAITGGTACACTGTC ; PCR 反应体系：基因组 DNA 模板 3. 5 ii L(20ng-100ng)，10PCR 缓冲液 2. 5 ii L， MgCl22. 5 ii L，dNTPSl ii L (2. 5mM)，上游引物 1 ii L (10pM)，下游引物 1 ii L (10pM)，Taq 酶 0? 2 ii L (2U)，加水补足至 20 ii L ; ?〇?反应程序：941：5111111，（941：3〇8,551：3〇8,721：6〇8)35个循环，721：1〇111111。
3. 果实颜色为黄底红晕的樱桃的LGS基因，其特征在于，该基因在LGS基因1214bp位 置上有一个碱基A发生缺失，其基因序列如序列表中SEQID NO. 4所示，其氨基酸序列如序 列表中SEQID NO. 6所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104404165SQ201410818307
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】金万梅, 王晶, 王 华, 张开春, 李茂福, 闫国华, 张晓明 申请人:北京市农林科学院