一种高效表达磷脂酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效表达磷脂酶的方法，属于酶工程【技术领域】。本发明将SEQ ID NO.1所示的编码磷脂酶A1基因以毕赤酵母为宿主进行重组表达，在3L罐上诱导120h后酶活达力可到6000U/ml，可用于磷脂酶的工业化生产。所述磷脂酶A1可用于粮油脱胶，降低磷含量。
【专利说明】一种高效表达磷脂酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效表达磷脂酶的方法，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶A1属于水解酶，可专一水解天然磷脂Sn-1位酰基，得到Sn-2酰基溶血磷 脂和游离脂肪酸。磷脂酶A1已被应用于食品、医药、饲料和皮革等领域，尤其是在粮油脱胶 方面的应用前景广阔。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量， 几乎不产生废水，是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方 法。
[0003] 最早将磷脂酶A1应用于油脂脱胶工业的是德国Lurgi公司，此酶来源于猪的胰 脏，称为"EnzyMax process",但是这种酶具有诸多缺点，如必须以興离子为激活剂，应用时 需向反应体系中添加一定量的钙离子；且该酶来源有限，价格比较昂贵。随着研究的继续深 入，人们逐渐将微生物来源的磷脂酶应用于油脂脱胶。微生物来源的磷脂酶相继在德国、美 国等较大油脂公司得到了生产与应用，均获得了较好的效果。目前已实现工业化生产的磷 脂酶A1产品仅有丹麦诺维信公司的"Lecitase Novo"和"LecitaseUltra"。磷脂酶A1应 用于脱胶方面会有更大的发展前景。
[0004] 国内关于磷脂酶A1的研究主要集中于直接筛选野生菌，通过发酵优化提高表达 水平，或将原核来源的磷脂酶A1基因在大肠杆菌表达系统进行表达。司武阳等从富油土壤 中初步筛选出生产磷脂酶A1的菌株，并从碳源、氮源、复合碳源、金属离子等几个方面对菌 株产酶的发酵条件进行了优化，最高酶活达到18. 68U/mL。付建红等从新疆天山一号冰川冻 土中筛选到一株产低温碱性磷脂酶A1的菌株，经摇瓶优化，磷脂酶A1活力最高达17. 5U/ mL。王金梅等采用以磷脂为唯一碳源的限制性培养基，从富油土样中筛选得到一株磷脂酶 活性较高的菌株，利用该菌株生产的磷脂酶进行豆油脱胶研究，使得脱胶油中磷脂的去除 率高达75. 6%。国外用于食品级磷脂酶生产的安全菌株主要包括米曲霉和黑曲霉等，1988 年，Michael Givskova等从液化沙雷氏菌（Serratialiquefaciens)基因组中克隆获得磷 脂酶A1基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli)中进行异源表达，其酶活不到lU/mL。1997 年，KAGrant等将大肠弯曲杆菌（Campylobacter coli)来源的磷脂酶A基因在大肠杆菌宿 主表达，胞内酶活达到70U/mg。2000年，M Hartmann等使用随机化学突变、单细胞融合以 及基因杂交技术，筛选出4株嗜热四膜虫属（Tetrahymena thermophila)突变株，其磷脂酶 A1酶活最高达到35. 2 ±2. 6U/mL。最后延晋雷等克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基 因，并在大肠杆菌中表达，重组菌胞外磷脂酶A1酶活达到128. 7U/mL。目前国内外上罐的最 高酶活为3500U/mL。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种编码磷脂酶A1的基因，其碱基序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 重组表达所述编码磷脂酶A1的基因，能够得到高活力的磷脂酶。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种高效表达所述磷脂酶A1的方法，是 将SEQ ID NO. 1所示的基因序列与毕赤酵母表达载体连接，然后将重组表达载体转化入毕 赤酵母中，发酵培养重组菌获得磷脂酶A1。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，将SEQ ID NO. 1所示的基因序列与毕赤酵母表达载 体PPIC9K或pPICZ a连接，获得重组质粒，然后将重组表达质粒转化入毕赤酵母中，发酵培 养重组菌获得磷脂酶A1。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，接入装液量30-40%发酵罐，以氨 水控制pH值为5-6,培养温度28-30°C，溶氧维持在30%左右，当甘油耗尽、溶氧迅速上升， 开始流加甘油补料液，当菌体浓度达到〇D_ = 95-105时，停止补料；保持基质匮乏状态约 lh后，开始诱导阶段，设置诱导温度28-30°C，添加0. 3-0. 5 %甲醇，待重组菌适应甲醇，溶 氧开始下降后，维持甲醇浓度〇. 3-0. 5%，诱导磷脂酶A1表达。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，接入装液量〇. 9L的3L发酵罐，以 25 %氨水控制pH5,培养温度30°C，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30% 左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加50 %的甘油补料液，当菌 体浓度达到〇D_ = 100时，停止补料，保持基质匮乏状态约lh后，开始诱导阶段，设置诱导 温度28°C，添加0. 5%甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇电极维持甲醇 浓度0. 5%，诱导磷脂酶A1表达。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有硫酸钙〇. 9-1. Og/L，硫酸镁7-8g/ L，氢氧化钾 4-5g/L，硫酸钾 18-20g/L，甘油 30-35g/L，磷酸 25-28ml/L，CuS04 ? 5H20 6-7g/ L, KIO. 08-1. Og/L, MnS04 ? H20 3g/L, Na2Mo03 ? 2H20 0. 2g/L, H3B030. 02g/L, C〇C120. 5g/L, ZnCl220g/L，FeS04 ? 7H20 65-68g/L，生物素 0? 2g/L，H2S045-6g/L。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的组成为：硫酸钙0. 939g/L，硫酸镁 7. 27g/L，氢氧化钾 4. 13g/L，硫酸钾 18. 2g/L，甘油 30g/L，磷酸 26. 7ml/L，CuS04 ? 5H20 6g/L，KI 0? 08g/L，MnS04 ? H20 3g/L，Na2Mo03 ? 2H20 0? 2g/L，H3B030. 02g/L，C〇C120. 5g/L， ZnCl220g/L，FeS04 ? 7H20 65g/L，生物素 0? 2g/L，H2S045. 0g/L。
[0013] 本发明要解决的另一个技术问题是提供磷脂酶A1应用于粮油脱胶，经过酶处理 后，磷含量能够降低到lOppm以下，符合国家食用油食品安全的标准。该酶法脱胶具有高 效、绿色环保等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为重组菌P.pastoris 3L罐中发酵上清液的SDS-PAGE分析，其中12h、24h、 36h、48h、60h、72h、84h、96h为重组菌P. pastoris在3L罐里不同诱导时间的发酵上清液， Maker为蛋白分子量标准。
【具体实施方式】
[0015] 本发明未注明的实验方法如酵母感受态的制备及其电转化，发酵培养基配方见 Invitrogen公司的毕氏酵母操作手册。
[0016] 种子培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L
[0017] 发酵培养基：硫酸钙0. 939g/L，硫酸镁7. 27g/L，氢氧化钾4. 13g/L，硫酸钾 18. 2g/L，甘油 30g/L，磷酸 26. 7ml/L，金属离子 PTM 溶液（g/L) :CuS04 ? 5H20 6, KI 0? 08， MnS04 ? H203, Na2Mo03 ? 2H20 0? 2, H3B030. 02, C〇C120. 5, ZnCl220, FeS04 ? 7H20 65,生物素 0? 2， H2S045. 0。
[0018] 实施例1:磷脂酶A1在毕赤酵母中的克隆表达和发酵过程。
[0019] 将PCR扩增得到的编码磷脂酶A1的DNA片段纯化后和质粒pPIC9K用EcoRI/Notl 酶切，然后连接得到PPIC9K-PLA1，酶切验证质粒片段大小正确后进行基因测序，重组质粒 SacI酶切线性化后转化进毕赤酵母P. pastoris细胞中挑取在MD平板上长出的转化子，点 种于YPD/G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0? 25mg/mL、0. 5mg/mL、 1. 0mg/mL、2. Omg/mL 重组子命名为 P. pastorisKM71/pPIC9K-PLAl。
[0020] 实施例 2:重组 P. pastoris KM71/pPIC9K-PLAl 菌株 3L 罐发酵培养。
[0021] 吸取200iil的甘油管菌液接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中， 30°〇，2001'/1^11培养2411，将上述培养液接入装液量为0.礼的31发酵罐，以25%氨水控 制PH5,培养温度30°C，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30%左右，当溶氧 迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加体积比为50%甘油补料液，当菌体浓度 达到0D_ = 100时，停止补料，保持基质匮乏状态约lh后，开始诱导阶段，设置诱导温度 28"€，添加装液量0.5%体积甲醇，待重组？.口381:〇1^8碰71适应甲醇，溶氧开始下降后，通 过甲醇电极（FC2002,华东理工大学）维持甲醇浓度0. 5%，诱导磷脂酶A1表达，诱导120h 后，蛋白含量为6. 5mg/mL，酶活最高达到6000U/mL。图1为重组菌P.pastoris KM713L罐 里发酵上清液的SDS-PAGE分析。
[0022] 酶活力测定方法：2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液10mL于100mL 的具塞三角瓶中，再于空白瓶中加入95%乙醇10mL，于55度的水浴中预热5min，然后在各 瓶中加入酶液预定稀释倍数的稀释液200 y L(用缓冲液稀释一般稀释倍数为100倍或者 200倍），立即混匀计时，反应5min，于样品瓶中立即补加95%乙醇10mL终止反应，然后每 个三角瓶各滴加酚酞试剂，一般滴100 U L左右，然后于自动滴定仪下用0. 02MNa0H标准溶 液滴定，观察颜色，确定空白颜色变色临界点为滴定的终点，将样品瓶与空白瓶的颜色变色 后一致，计算标准碱液平均消耗量。磷脂酶酶活力定义为：在特定条件下lmin水解磷脂产 生1微摩尔mol)游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位（U)。其磷脂酶活力 表示为每ml酶液所测得的磷脂酶活力单位，即U/mL。
[0023] 实施例3:重组磷脂酶A1应用于大豆油原油酶促脱胶，按照GB/T 5537-2008测量 磷的含量。
[0024] 取大豆油100g于250mL锥形瓶中，水浴加热至80°C，然后加入45 %柠檬酸 120ii L，接着lOOOrpm匀质lmin，80°C水浴，500rpm搅拌20min，冷却到55°C，待冷却后加 4%氢氧化钠溶液调至？册.0,加入21111超纯水，然后加入1()()111酶液,进行反应,55°(：, 500rpm，搅拌不同的时间进行取样，然后将样品在90°C保温15min，接着离心取上清液油 料，油料中的磷脂经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇到钥酸钠生成磷钥酸钠， 用硫酸联氨还原成钥蓝，用分光光度计在波长650nm，测定钥蓝的吸光度从而测磷含量。
[0025] 初始原油的磷含量为225ppm，对不同的温度时间进行实验，得到的结果如下：力口 酶量为2. 5U/g，取不同时间的油样，测定，结果发现：在温度为55°C，5h后磷含量降低到 lOppm以下，在温度为60°C，分别取不同时间的样，4h后磷含量降低到lOppm以下，符合国家 食用油食品安全的标准。磷脂酶A1在粮油脱胶方面的应用有很大的潜力，可以应用于工业 上。
[0026] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种编码磷脂酶A1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种高效表达所述磷脂酶A1的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO. 1所示的基因序 列与表达载体连接，然后将重组表达载体转化入毕赤酵母中，发酵培养重组菌获得磷脂酶 A1。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pPIC9K或pPICZ a。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将重组菌活化后，接入装液量30-40 %发 酵罐，以氨水控制pH值为5-6,培养温度28-30°C，溶氧维持在30%左右，当甘油耗尽、溶氧 迅速上升，开始流加甘油补料液，当菌体浓度达到〇D_ = 95-105时，停止补料；保持基质匮 乏状态约lh后，开始诱导阶段，设置诱导温度28-30°C，添加0. 3-0. 5%甲醇，待重组菌适应 甲醇，溶氧开始下降后，维持甲醇浓度〇. 3-0. 5%，诱导磷脂酶A1表达。
5. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，将重组菌活化后，接入装液量0. 9L 的3L发酵罐，以25%氨水控制pH5,培养温度30°C，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶 氧维持在30 %左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的甘油已经耗尽，开始流加50%的甘 油补料液，当菌体浓度达到〇D_ = 100时，停止补料，保持基质匮乏状态约lh后，开始诱导 阶段，设置诱导温度28°C，添加0.5%甲醇，待重组菌适应甲醇，溶氧开始下降后，通过甲醇 电极维持甲醇浓度〇. 5%，诱导磷脂酶A1表达。
6. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，发酵培养基含有硫酸钙0. 9-1. 0g/ L，硫酸镁 7-8g/L，氢氧化钾 4-5g/L，硫酸钾 18-20g/L，甘油 30-35g/L，磷酸 25-28ml/L， CuS04*5H20 6-7g/L,KI 0. 08-1. 0g/L,MnS04 *H20 3g/L,Na2Mo03 *2H20 0. 2g/L,H3B03 0. 02g/ L，CoCl2 0? 5g/L，ZnCl2 20g/L，FeS04 ? 7H20 65-68g/L，生物素 0? 2g/L，H2S04 5-6g/L。
7. 携带权利要求1所述基因的转化体。
8. 权利要求1所述基因编码的磷脂酶A1。
9. 权利要求8所述磷脂酶A1在油脂脱胶中的应用。
10. 权利要求7所述转化体在油脂脱胶中的应用。
【文档编号】C12N9/16GK104450756SQ201410816825
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】吴敬, 宿玲恰, 吉得宁 申请人:江南大学