本发明涉及饲料添加剂
技术领域：
，特别涉及一种海参饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
：海参属于棘皮动物门，海参纲。海参纲是刺皮动物门中最有经济价值的一个纲，种类很多，全球有1100余种。我国海域有100多种，其中可食用的有20余种。海参具有极高的滋补和药用价值，其体内含有52种对人体有益的营养成份，且合理均衡，是一种高蛋白、低糖、低脂肪、无胆固醇的营养保健食品，其主要成份刺参粘多糖和刺参素，有抗辐射、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老的作用。随着人民生活水平的提高和海参在医疗保健中的进一步开发利用，海参的需求量大幅上升，带动了海参养殖业的发展。80年代突破海参人工苗种繁育技术，苗种培育达到规模化水平，海参养殖规模迅猛发展，养殖规模不断扩大。但是，目前在海参养殖过程中存在着诸多不足和难题，如稚参的病害死亡问题、生长缓慢问题、高营养饲料的缺乏等。随着刺参养殖规模的不断增大，刺参病害也日益显著，预防不当会给刺参养殖业带来较大的损失，解决刺参病害已经成为一个迫在眉睫的课题。一些海参养殖户为防治病虫害，在养殖海参的水池内加入抗生素；为促进海参快速生长，在饲料中添加生长激素等；这势必会带来细菌耐药性、药物残留和环境污染等问题。海参养殖业做为我国海水养殖业的第四次浪潮，来势迅猛，发展前景良好。在突破育苗技术后，海参配合饲料及专用添加剂的开发应用成为海参养殖业大发展的技术瓶颈。尤其是海参天然物饲料添加剂的开发和实际应用成功实例还很少见。近年来，人类呼唤健康，渴望回归自然，迫切需要绿色食品的呼声越来越高，这当中自然也包括绿色畜产品和水产品，而这些绿色水产品是需要绿色饲料及添加剂来实现的，因此，无污染、无残留、无抗药性、无毒副作用的营养保健绿色饲料添加剂成为当今及未来研究含非药物绿色饲料添加剂取代抗生素促生长剂的主要潮流。许多天然物兼有营养性和药物性的双重作用，既能够促进糖代谢、促进蛋白质和酶的合成，又能增强机体抗体效价、刺激性腺发育，具有抑菌杀菌、调节机体免疫功能以及非特异性抗菌作用。天然物饲料添加剂较之抗生素、化学合成类饲料添加剂有几个明显优势它不但能直接杀菌、抗菌，而且能够调节机体免疫机能；几乎无有害残留且其中一些物质具有促摄食助消化的作用。因此开发应用海参天然物调节型饲料添加剂成为促进海参育苗、池塘养、殖工厂化养殖大发展的必然趋势。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于，提供一种海参饲料添加剂及其制备方法，可显著促进海参的生长，提高免疫力及抗病毒能力。食用本发明添加剂后的海参抗病力强，生长速度快，极大增加了养殖户的经济效益，具有配方简单、科学、合理，绿色无残留，实用性强，无毒副作用，效果显著的优点。为了实现上述发明目的，本发明提供了一种海参饲料添加剂，所述添加剂包括以下组分：大鲵油、蝉蜕、桑椹、蚕沙、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、松花粉、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七、黑芝麻、油菜花粉和醋蛋液。所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.4-0.6份、蝉蜕14-20份、桑椹20-30份、蚕沙10-14份、佛手瓜14-22份、芦笋20-25份、百合10-15份、茭白16-21份、铁钉菜40-55份、石莼45-50份、松花粉8-12份、甘草8-12份、跳八丈0.3-0.6份、芸薹子0.4-0.7份、钮子七0.2-0.5份、黑芝麻20-25份、油菜花粉10-15份和醋蛋液15-20份。所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.4份、蝉蜕20份、桑椹25份、蚕沙14份、佛手瓜18份、芦笋25份、百合13份、茭白21份、铁钉菜40份、石莼50份、松花粉9份、甘草11份、跳八丈0.6份、芸薹子0.7份、钮子七0.2份、黑芝麻20份、油菜花粉10份和醋蛋液18份。所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.6份、蝉蜕14份、桑椹30份、蚕沙10份、佛手瓜22份、芦笋20份、百合15份、茭白16份、铁钉菜48份、石莼45份、松花粉8份、甘草8份、跳八丈0.3份、芸薹子0.5份、钮子七0.4份、黑芝麻22份、油菜花粉15份和醋蛋液20份。所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.5份、蝉蜕16份、桑椹20份、蚕沙12份、佛手瓜14份、芦笋23份、百合10份、茭白17份、铁钉菜55份、石莼47份、松花粉12份、甘草12份、跳八丈0.4份、芸薹子0.4份、钮子七0.5份、黑芝麻25份、油菜花粉13份和醋蛋液15份。为了更好地实现发明目的本发明还提供一种海参饲料添加剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)取大鲵体内的脂肪组织，切碎，清洗干净，加入脂肪组织质量5-7倍的去离子水，武火煮沸后，改文火煮5-6h，把所得到的油液过滤、去渣、离心，取上清油液，得到大鲵油；(2)取鸡蛋若干个，加入鸡蛋质量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，启封将鸡蛋清与鸡蛋黄与醋搅匀，继续密封2天后，过滤取滤液得到醋蛋液；(3)将蝉蜕粉碎，将蚕沙粉碎，按所述质量份数取大鲵油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蝉蜕和蚕沙,混合均匀后放置15-18h得混合物一；(4)按所述质量份数比例取桑椹、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七混合，加入相对于混合物10～12倍的醇体积浓度为90％～95％的乙醇，加热至沸腾回流3～5小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.05～0.08Mpa下减压浓缩至40～50℃时相对密度为1.00～1.04的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度150～165℃、出风温度80～85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取按比例取所述质量份松花粉、油菜花粉与步骤(3)得到的混合物一，步骤(4)得到的干膏粉混合均匀得到海参饲料添加剂。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的添加剂可以显著提高海参的免疫力，促进海参的生长速度。而且通过试验发现添加了本发明的添加剂后喂养的海参肉质更加鲜美。本发明具有配方简单、科学、合理，绿色无残留，实用性强，无毒副作用，效果显著的优点。具体实施方式本发明提供一种海参饲料添加剂及其制备方法，所述添加剂包括以下组分：大鲵油、蝉蜕、桑椹、蚕沙、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、松花粉、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七、黑芝麻、油菜花粉和醋蛋液。松花粉：松花粉，中药名。为松科植物马尾松、油松或同属数种植物的干燥花粉。春季花刚开时，采摘花穗，晒干，收集花粉，除去杂质。蝉蜕：别名蝉退、蝉衣、虫蜕、蝉壳、蚱蟟皮、知了皮，金牛儿。本品为蝉科昆虫黑蚱的幼虫羽化时脱落的皮壳。甘，寒。归肺、肝经。散风除热，利咽，透疹，退翳，解痉。用于风热感冒，咽痛，音哑，麻疹不透，风疹瘙痒，目赤翳障，惊风抽搐，破伤风。桑椹：本品为桑科植物桑的干燥果穗。甘、酸，寒。归心、肝、肾经。补血滋阴，生津润燥。用于眩晕耳鸣，心悸失眠，须发早白，津伤口渴，内热消渴，血虚便秘。蚕沙：别名原蚕屎、晚蚕沙、蚕砂、原蚕沙、马鸣肝、晚蚕矢、二蚕沙、蚕屎。味甘；辛；性温。归肝；脾；胃经。祛风除湿；和胃化浊；活血通经。主风湿痹痛；肢体不遂；风疹瘙痒；吐泻转筋；闭经；崩漏。佛手瓜：佛手瓜(学名：Sechiumedule)，又名隼人瓜、安南瓜、寿瓜、丰收瓜、洋瓜、合手瓜、捧瓜等，是一种葫芦科佛手瓜属植物。原产于墨西哥、中美洲和西印度群岛，1915年传入中国，在中国江南一带都有种植，以云南、浙江、福建、广东、台湾最多。佛手瓜清脆，含有丰富营养。每千克鲜瓜中含蛋白质5克、脂肪1克、纤维素30克、碳水化合物77克，还含有维生素C220毫克，核黄素0.1毫克，含钙500毫克、磷320毫克、铁40毫克。佛手瓜既可做菜，又能当水果生吃。芦笋：芦笋(学名：Asparagusofficinalis)又名石刁柏，为天门冬科天门冬属(芦笋属)多年生草本植物石刁柏.的可食用部分。别名石刁柏、龙须菜，青芦笋。凉，甘、苦。润肺镇咳，祛痰杀虫。百合：别名白百合(《日华子本草》)，蒜脑薯(《纲目》)。为百合科植物百合、细叶百合、麝香百合及其同属多种植物鳞茎的鳞叶。甘微苦，平。入心、肺经。润肺止咳，清心安神。治肺费久嗽，咳唾痰血；热病后余热来清，虚烦惊悸，神志恍惚；脚气浮肿。茭白：又名高瓜、菰笋、菰手、茭笋，高笋。是禾本科菰属多年生宿根草本植物。茭白：甘，凉。茭白：清热除烦。石莼：石莼UlvalactucaL.属于绿藻门，石莼目，石莼科，石莼属。亦称海白菜、海青菜、海莴苣、绿菜、青苔菜、纶布，属常见海藻。片状，近似卵形的叶片体由两层细胞构成，高10—40厘米，鲜绿色，基部以固着器固着于岩石上，生活于海岸潮间带，生长在海湾内中、低潮带的岩石上，东海、南海分布多、黄海、渤海稀少。主治下水，利小便；治风秘不通，五膈气，小腹结气，可煮汤饮用。铁钉菜:别名铁线草、剪刀菜、铁菜、摇鼓铃。为铁钉菜及叶状铁钉菜的藻体。咸；寒。归肝经。软坚散结；解毒；驱蛔。主颈淋巴结肿；甲状腺肿；喉炎；蛔虫病。甘草：甘，平。归心、肺、脾、胃经。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。跳八丈：别名藤子杜仲、银丝杜仲、软皮树、橡胶藤、臭匙羹藤。萝藦科匙羹藤属植物华宁藤，以根入药。味辛、涩，性微温。舒筋活血，安胎止痛。用于跌打损伤，风湿骨痛，腰痛，胎动不安，肾炎，闭经，痛经。芸薹子：别名油菜子。为十字花科植物油菜的种子。辛；甘；平。肝；肾经。活血化瘀；消肿散结；润肠通便。钮子七：别名珠子参、大叶三七、竹节人参、扣子七、疙瘩七、盘七。五加科人参属植物大叶三七，以根状茎入药。秋季采集，洗净晒干。味苦、微甘，性温。祛瘀生新，止痛止血。用于跌打损伤，风湿关节痛，胃痛；外用治外伤出血。黑芝麻：别名芝麻、油麻、巨胜。脂麻科植物脂麻的成熟种子。性平，味甘。归肝经、肾经、大肠经。补肝肾、益精血、润肠燥。以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1添加剂1一种海参饲料添加剂，所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.4克、蝉蜕20克、桑椹25克、蚕沙14克、佛手瓜18克、芦笋25克、百合13克、茭白21克、铁钉菜40克、石莼50克、松花粉9克、甘草11克、跳八丈0.6克、芸薹子0.7克、钮子七0.2克、黑芝麻20克、油菜花粉10克和醋蛋液18克。所述制备方法包括以下步骤：(1)取大鲵体内的脂肪组织，切碎，清洗干净，加入脂肪组织质量6倍的去离子水，武火煮沸后，后改文火煮6h，把所得到的油液过滤、去渣、离心，取上清油液，得到大鲵油；(2)取鸡蛋若干个，加入鸡蛋质量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，启封将鸡蛋清与鸡蛋黄与醋搅匀，继续密封2天后，过滤取滤液得到醋蛋液；(3)将蝉蜕粉碎，将蚕沙粉碎，按所述质量份数取大鲵油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蝉蜕和蚕沙,混合均匀后放置18h得混合物一；(4)按所述质量份数比例取桑椹、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七混合，加入相对于混合物11倍的醇体积浓度为95％的乙醇，加热至沸腾回流4小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.06Mpa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.04的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度150℃、出风温度82℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述质量份松花粉、油菜花粉与步骤(3)得到的混合物一，步骤(4)得到的干膏粉混合均匀得到海参饲料添加剂。实施例2添加剂2一种海参饲料添加剂，所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.6克、蝉蜕14克、桑椹30克、蚕沙10克、佛手瓜22克、芦笋20克、百合15克、茭白16克、铁钉菜48克、石莼45克、松花粉8克、甘草8克、跳八丈0.3克、芸薹子0.5克、钮子七0.4克、黑芝麻22克、油菜花粉15克和醋蛋液20克。所述制备方法包括以下步骤：(1)取大鲵体内的脂肪组织，切碎，清洗干净，加入脂肪组织质量7倍的去离子水，武火煮沸后，后改文火煮5h，把所得到的油液过滤、去渣、离心，取上清油液，得到大鲵油；(2)取鸡蛋若干个，加入鸡蛋质量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，启封将鸡蛋清与鸡蛋黄与醋搅匀，继续密封2天后，过滤取滤液得到醋蛋液；(3)将蝉蜕粉碎，将蚕沙粉碎，按所述质量份数取大鲵油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蝉蜕和蚕沙,混合均匀后放置17h得混合物一；(4)按所述质量份数比例取桑椹、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七混合，加入相对于混合物12倍的醇体积浓度为90％的乙醇，加热至沸腾回流5小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.05Mpa下减压浓缩至40℃时相对密度为1.00的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度165℃、出风温度80℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述质量份松花粉、油菜花粉与步骤(3)得到的混合物一，步骤(4)得到的干膏粉混合均匀得到海参饲料添加剂。实施例3添加剂3一种海参饲料添加剂，所述添加剂包括以下重量份的组分：大鲵油0.5克、蝉蜕16克、桑椹20克、蚕沙12克、佛手瓜14克、芦笋23克、百合10克、茭白17克、铁钉菜55克、石莼47克、松花粉12克、甘草12克、跳八丈0.4克、芸薹子0.4克、钮子七0.5克、黑芝麻25克、油菜花粉13克和醋蛋液15克。所述制备方法包括以下步骤：(1)取大鲵体内的脂肪组织，切碎，清洗干净，加入脂肪组织质量5的去离子水，武火煮沸后，后改文火煮6h，把所得到的油液过滤、去渣、离心，取上清油液，得到大鲵油；(2)取鸡蛋若干个，加入鸡蛋质量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，启封将鸡蛋清与鸡蛋黄与醋搅匀，继续密封2天后，过滤取滤液得到醋蛋液；(3)将蝉蜕粉碎，将蚕沙粉碎，按所述质量份数取大鲵油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蝉蜕和蚕沙,混合均匀后放置15h得混合物一；(4)按所述质量份数比例取桑椹、佛手瓜、芦笋、百合、茭白、铁钉菜、石莼、甘草、跳八丈、芸薹子、钮子七混合，加入相对于混合物10倍的醇体积浓度为95％的乙醇，加热至沸腾回流3小时，过滤，收集滤液，随后在真空度0.08Mpa下减压浓缩至45℃时相对密度为1.02的膏体，喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度160℃、出风温度85℃，随后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述质量份松花粉、油菜花粉与步骤(3)得到的混合物一，步骤(4)得到的干膏粉混合均匀得到海参饲料添加剂。安全性试验1、急性毒性试验(1)试验动物、饲料及饲养清洁级昆明种小白鼠，体重18-22g，20只，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。Ⅱ级动物房，人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。(2)试验试剂羧甲基纤维素(分析纯)，用蒸馏水配制成0.5％悬浮液待用。(3)试验方法试验方法选用最大耐受量法。取20只体重为18-22g健康的清洁级昆明种小白鼠，雌雄各10只。试验前禁食16h(隔夜)，不禁水。取5g本发明实施例1中的添加剂1，用0.4％羧甲基纤维素稀释至18mL。分上、下午间隔4h二次经口灌胃，第二次灌胃后2h进食，总灌胃剂量为10g·(kg·bw)-1。连续观察14d，记录中毒表现及死亡情况。2、致突变性试验2.1试验菌株TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠伤寒沙门氏菌。由黑龙江省疾病控制中心提供。2.2试验动物及试剂(1)Ames试验：营养肉汤培养基的配制：牛肉膏2.4g，蛋白胨5.0g，氯化钠2.4g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.2g，蒸馏水500mL。加热溶解将上述试剂，调pH至7.4，分装、灭菌(0.103MPa，20min)，普通冰箱保存备用(不超过半年)。磷酸盐贮备液配制：磷酸氢钠氨(NaNH4HPO4·4H2O)17.4g，柠檬酸(C6H8O7·H2O)10.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4)50.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g。硫酸镁待其他试剂完全溶解后再缓缓放入，使其继续溶解(否则会析出沉淀)。1.5％琼脂培养基配制：琼脂Agar6.0g，滴入蒸馏水至400mL，上述试剂融化后0.102MPa灭菌25min。底层培养基配制：灭菌琼脂培养基(80℃)400mL，磷酸盐贮备液7mL，40％葡萄糖溶液20mL，在容器中依次加入上述试剂，充分混匀，待温度降至80℃左右时倒平皿，每皿25mL，37℃培养过夜的同时除去水分，然后检查有无污染。顶层琼脂配制：琼脂3.0g，氯化钠2.5g，滴入蒸馏水至500Ml。0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液配制：D-生物素D-Biotin(分子量244)30.4mg，L-组氨酸L-Histidine(分子量155)19.3mg，滴入蒸馏水至250mL10％S-9混合液的配制：磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH7.4)6mL，氯化钾溶液(1.65mol/L)0.2mL，氯化镁溶液(0.4mol/L)0.2mL，葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液(0.05mol/L)1.0mL，辅酶-Ⅱ溶液(0.0025mol/L)1.5mL，肝S-9液1.0mL混匀，临用时配制，置水浴中待用。肝S-9液由黑龙江省疾病控制中心提供。标准诱变剂分别为敌克松、叠氮钠、2-乙酰氨基芴、1、8-二羟蒽醌，由黑龙江省疾病控制中心提供。(2)微核试验50只清洁级昆明种小白鼠，体重25-30g，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。小牛血清：小牛血清虑菌后放入恒温水浴中，56℃灭活1h。灭活后将其储存于4℃冰箱中保存备用。吉姆萨(Giemsa)染液：称取Giemsa3.8g，加入375ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后，再加入125ml甘油。置于37℃恒温箱48h震摇数次。过滤，静置两周后用。吉姆萨(Giemsa)应用液：取一份Giemsa染液与6份磷酸盐缓冲液混合而成。临用时配制。1/15moL/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制：磷酸二氢钾(KH2PO4)4.50g，磷酸二氢钠(Na2HPO4·12H2O)11.78g，滴入蒸馏水至1000mL，全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。(3)精子畸形试验50只清洁级昆明种雄性小白鼠，体重25-35g。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由广州大台农饲料有限公司提供。人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。甲醇。1％～2％伊红染色液：称取伊红1～2g，溶于100mL蒸馏水备用。全部试剂除标明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。2.3试验方法2.3.1Ames试验(1)原理：鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在有组氨酸条件下的培养基上可以正常生长，在无组氨酸存在的培养基上不能生长。但若有致突变物存在于无组氨酸的培养基中时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而可以生长于无组氨酸的培养基上，所以可根据菌落形成数量为标准来判断受试物致突性的强弱。一些特殊的受试物需要经过代谢活化系统处理后才能使沙门氏菌突变型回复突变为野生型，代谢活化系统采用S-9混合液(制备方法：利用多氯联苯(Polychlorinatedbiphenyl,PCB)诱导大鼠肝匀浆(S-9))。(2)试验菌株：采用TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株，TA97和TA98可以检测各种移码型诱变剂；TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂；TA102能检测出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂。(3)5个本发明实施例1中的添加剂1剂量分别为5000、1000、200、40和8μg/皿。(4)增菌培训取营养肉汤培养基5ml,加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将冷冻保存的菌株接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡(100次/min)培养10h至对数增长期，每毫升活菌数多于1×109～2×109个，用黑纸包裹培养瓶，以防细菌被光线照射。(5)准备数个底层培养基平皿。(6)将顶层培养基融化并分装于无菌小试管，每管2ml，保温于45℃水浴锅中。(7)将0.1ml的测试菌株新鲜增菌液依次加入保温的顶层培养基中，混匀；然后滴入0.1ml受试物(活化时另加入0.5ml10％S-9混合液)，再混匀，快速倒在底层培养基上，并使其在底层上均匀分布，平放固化，无菌箱中(37℃)培养48h观察结果。(8)另做溶剂对照(即阴性对照，蒸馏水0.1ml/皿)和阳性对照(分别采用叠氮钠1.5μg/皿、敌克松50μg/皿、2-乙酰氨基芴10μg/皿、1,8-二羟蒽醌50μg/皿)。溶剂对照加灭菌蒸馏水；阳性对照不加受试物，只加标准诱变剂；其他方法同上。重复两次。2.3.2微核试验表1微核试验设计(n＝10)剂量组剂量(g·(kg·bw·d)-1)阴性组0.5％羧甲基纤维素低剂量组0.5中剂量组5高剂量组9阳性组0.04按30h给受试物法给药，阳性对照组用环磷酸胺一次腹腔注射0.04g·(kg·bw)-1，其余各组灌胃，2次给药间隔24h，第2次给药后6h处死动物。制片：在第2次给药6h后将小鼠脱颈椎处死，取小鼠脊椎，剔去肌肉，剪开一端的骨椎，用尖嘴钳挤出骨髓滴到小牛血清(0.05mL，置于载玻片上)中。推片：混匀后，推片若干张，静置干燥。固定：用甲醇溶液将干燥的涂片固定5～10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应固定后保存。染色：用1:10的吉姆萨-磷酸缓冲液(pH为6.4)染色固定好的涂片15～30min。用蒸馏水冲洗，干燥后待检。每只小白鼠计数1000个PCE(Poiychromaticerythrocytes，PCE)，微核率以‰表示；另外，在计数PCE时，同时计数RBC(Redbloodcellcount，RBC)数，计算PCE/RBC值。2.3.3精子畸形试验表2精子畸形试验设计(n＝10)每日染毒一次，连续5d，每天记录体重、进食量和摄入添加剂量。阳性对照组采用0.04g·(kg·bw·d)-1环磷酰胺进行腹腔注射，本发明实施例1添加剂1的给药方式为灌胃。试验结束时要求每组至少有5只存活动物。精子采样与镜检：于首次给受试物后第5周(35d)将小鼠用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，摘取两侧附睾，放入小平皿中(盛有约2ml生理盐水)。将附睾以眼科剪剪碎(不能太碎)。将组织碎片用四层擦纸滤去。滤液离心5min(1000～1500r/min)。留存约0.5ml液体，其余上清液弃除，将其与沉淀物摇匀后，在洁净的载玻片上滴1滴进行涂片(一般每只小鼠做4～5张涂片)。涂片在空气中干燥后，采用甲醇溶液固定5min。用2％伊红溶液在其自然干燥后染色1h，用水轻冲，干燥待检。在低倍镜下找到精子重叠较少、背景清晰的部分，用高倍镜顺序检查精子，并计数。凡不完整，轮廓不清，或重叠，或明显属人为剪碎者均不计算。一个精子只计其中较为明显的一种畸形。精子的畸形主要表现在头部，其次在尾部，畸形类型有香蕉形、无定形、无钩、胖头、双头、双尾、尾折叠等。记录异常的精子数和异常类型，并计算畸形类型的精子构成比。每鼠计1000个完整精子，畸形率以‰表示。精子畸形率(‰)＝精子畸形总数/检查精子总数×10003、慢性和亚慢性试验3.1试验动物、饲料及饲养3.1.1大鼠30d喂养试验清洁级Wistar大白鼠，体重150-180g，80只，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限公司提供。全价营养生长饲料由北京澳协力饲料有限公司提供。Ⅱ级动物房，人工昼夜节律，温度：24±2℃，湿度：45±5％。3.1.2蛋鸡56d喂养试验32周龄海赛蛋鸡240只，由哈尔滨益农禽业提供。基础饲粮由哈尔滨华达饲料厂提供。蛋鸡饲养在东北农业大学实验实习基地蛋鸡舍。3.2试验试剂普通化学试剂：甲醛、石蜡、乙醇、二甲苯、苏木精、伊红、丙酮、磷酸盐缓冲液等。生化指标测定试剂盒：谷草转氨酶(Glutamic-oxalacetictransaminease，GOT)、谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvictransaminase，GPT)、尿素氮(Ureanitrogen，BUN)、肌酐(Creatinine，CRE)、胆固醇(Cholesterol，CHO)、血糖(Glucose，GLU)、TG、白蛋白(Albumin，ALB)、总蛋白(Totalprotein，TP)测试试剂盒均购自中生北控(生产批号：100731)血细胞分析仪测试试剂：染色剂(STROMATOLYSER-4DSFFS-800A)、血蛋白检测试剂(SULFOLYSERSLS-210A1015)、嗜碱性粒细胞和白细胞检测试剂(STROMATOLYSER-FBR1039)、稀释液(PK-30LG2109)。全部试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。3.3试验方法3.4.1大鼠30d喂养试验表3大鼠30d喂养试验设计(n＝20)组别处理对照组全价饲料低剂量组全价饲料+0.4％本发明实施例1添加剂1中剂量组全价饲料+2％本发明实施例1添加剂1高剂量组全价饲料+10％本发明实施例1添加剂1动物购入隔离喂养1周后供试验用，每组雌雄各半。试验动物自由采食、自由饮水。(1)血液指标：一般性指标：观察大鼠的采食、饮水、发病及死亡等情况，每日早晚两次，体重和饲料每周各称一次，并计算平均增重、采食量、始重、末重及饲料利用率。血液学指标：30d喂养结束后，采血液样品，测定红细胞(Redbloodcellcount，RBC)、白细胞(Whitebloodcellcount，WBC)、血红蛋白(Hemoglobin，HGB)、淋巴细胞数(Lymphocyte，LYM)及白细胞分类。生化指标：30d喂养结束后，采集大鼠血液样品离心取血清，测定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理学检查：尸检：观察并记录各系统器官、组织的肉眼变化，典型病变拍照。脏器系数：心脏、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸或卵巢等组织及体重称重，并计算脏器系数。组织学检查：在上述解剖试验动物以肉眼观察变化的同时，取心脏、肾脏、脾脏、肝脏、胃、睾丸或卵巢等脏器组织1～2块，以甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE(HEmatine，HE)染色，显微镜下观察并记录组织学变化。3.4.2蛋鸡56d喂养试验表4蛋鸡56d喂养试验设计(n＝60)组别处理对照组基础饲粮低剂量组基础饲粮+0.4％本发明实施例1添加剂1中剂量组基础饲粮+2％本发明实施例1添加剂1高剂量组基础饲粮+10％本发明实施例1添加剂1动物购入后在本试验条件下适应7天后再开始试验。试验动物自由采食、自由饮水。(1)血液指标：一般性指标：观察蛋鸡的采食、饮水、发病及死亡等情况，每日早晚两次，对蛋重和饲料每天各称一次，并计算料蛋比、产蛋率。血液学指标：在56天喂养结束后，对蛋鸡进行采血测定RBC、WBC、HGB、LYM。生化指标：在56天喂养结束后，对蛋鸡进行采集血液离心取血清测定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理学检查：尸检：肉眼观察并记录各系统器官、组织的变化，典型病变拍照。脏器系数：称心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胰腺、腺胃、肌胃等组织重及体重。组织学检查：在上述解剖试验动物以肉眼观察变化的同时，取肝脏、脾脏、肾脏、腺胃等脏器组织1～2块以甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察并记录组织学变化。3.4数据处理结果用平均值±标准差表示，采用SPSS17.0进行统计分析。急性毒性试验、大白鼠30d喂养试验和蛋鸡56d喂养试验结果进行单因素方差(one-wayANOVA)分析；Ames试验结果和小鼠骨髓细胞微核试验结果均进行卡方检验；小鼠精子畸形试验结果进行单因素方差分析和Duncan′s法多重比较。P<0.05为差异显著性判断标准，P<0.01为差异极显著判断标准。4、结果与分析4.1急性毒性表5急性毒性由表5可见，试验结束后，所有小鼠在试验期间全部无异常，饮水、采食及粪便均正常，全部存活；两种性别小鼠的体重增重未见显著差异(P>0.05)。在试验结束后将全部小鼠脱颈处死，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、胃、肾、胸腺等脏器均未出现异常病理变化。结果表明，本发明实施例1添加剂1的LD50>10mg·(kg·bw)-1，属于实际无毒类物质。4.2致突变性4.2.1Ames试验由表6、7、8、9可见，与阴性对照组相比，在加与不加S-9情况下两次Ames试验阳性对照组回复突变菌落数极显著增高(P<0.01)，本发明实施例1添加剂1各剂量组回复突变菌落数无显著差异(P>0.05)，无剂量反应关系，即此剂量下本发明实施例1添加剂1对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阴性。表6本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第一次试验，-S9)注：同列中*表示差异极显著(P<0.01)。表7、8、9同表7本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第一次试验，+S9)表8本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第二次试验，-S9)表9本发明实施例1添加剂1对回复突变菌落数的影响(第二次试验，+S9)4.2.2小鼠骨髓细胞微核试验表10小鼠骨髓细胞微核试验(n＝10)注：同列中肩标*者表示差异极显著(P<0.01)由表10可见，与阴性对照组相比，阳性对照组微核率极显著提高(P<0.01)，雌、雄小鼠本发明实施例1添加剂1各组微核率均无显著差异(P>0.05)，说明在此剂量下本发明实施例1添加剂1对小鼠骨髓细胞微核率无显著影响，即本试验结果为阴性。此外，除阳性对照组外，本发明实施例1添加剂1各组与阴性对照组相比PCE/RBC无显著差异(P>0.05)，说明此剂量下本发明实施例1添加剂1对试验动物未见细胞毒性作用。4.2.3小鼠精子畸形试验由表11可见，各组小鼠均有一定数量的畸形精子出现，与阴性对照组相比，阳性对照组精子畸形率极显著提高(P<0.01)，本发明实施例1添加剂1各组差异均不显著(P>0.05)，无剂量反应关系，说明在此剂量下本发明实施例1添加剂1对小鼠精子畸形发生率没有影响。表11小鼠精子畸形试验(n＝10)组别精子畸形数(个)精子畸形率(‰)阴性组295.8低剂量组295.8中剂量组408.0高剂量组448.8阳性组513*102.6*注：同列中肩标*者表示差异极显著(P<0.01)4.3慢性和亚慢性4.3.1大鼠30d喂养试验4.3.1.1一般性指标表12大鼠30d喂养试验体重增重、进食量、食物利用率(n＝10)由表12可见，本发明实施例1添加剂1喂饲大鼠30d后体重增重、总进食量以及食物利用率与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。4.3.1.2血液学指标表13大鼠30d喂养试验血液学指标(1)(n＝10)表14大鼠30d喂养试验血液学指标(2)(n＝10)由表13和14可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后雌雄大鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白以及白细胞分类计数差异均不显著(P>0.05)。4.3.1.3血液生化指标表15大鼠30d喂养试验血液生化指标(1)(n＝10)表16大鼠30d喂养试验血液生化指标(2)(n＝10)由表15和16可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后雌雄大鼠的9项血液生化指标差异均不显著(P>0.05)。4.3.1.4病理学检查(1)大体观察试验结束后解剖各组大鼠进行肉眼尸检。各组大鼠气管、心脏、胸主动脉、肝、肾、肾上腺、脾、胃、盲肠、结肠、直肠、胰腺、部分肠系膜淋巴结、乳腺、十二指肠、空肠、前列腺、睾丸、附睾精囊或卵巢、子宫、阴道、坐骨神经、膀胱、皮肤等组织均未见明显异常。表17大鼠30d喂养试验脏器体重比(1)(n＝10)表18大鼠30d喂养试验脏器体重比(2)(n＝10)由表17、18可见，本发明实施例1添加剂1饲喂大鼠30d后与对照组雌雄大鼠的脏器体重比相比差异均不显著(P>0.05)。(2)脏器组织病理检查试验结束后对所有大鼠心脏、肝脏、脾、肾、胃、睾丸或卵巢进行HE染色。显微镜下观察，各剂量组与对照组相比未见任何明显异常4.3.2蛋鸡56d喂养试验4.3.2.1一般性指标由表19可见，与对照组相比，蛋鸡经56d本发明实施例1添加剂1饲喂后日采食量、平均蛋重差异均不显著(P>0.05)；平均产蛋率显著提高，料蛋比显著降低(P<0.05)，表明适当剂量本发明实施例1添加剂1能够提高蛋鸡的生产性能。表19蛋鸡喂养试验一般性指标(n＝60)注：同行中肩上字母不同者表示差异显著(P<0.05)4.3.2.2血液学指标由表20可见，与对照组相比，蛋鸡经56d本发明实施例1添加剂1饲喂后白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞比容、红细胞平均体积、平均红细胞血色素、红细胞平均蛋白浓度、血小板差异均不显著(P>0.05)。表20蛋鸡喂养试验血液学指标(n＝60)4.3.2.3血液生化指标表21蛋鸡喂养试验血液生化指标(n＝60)注：同行中肩上标注*者表示差异显著(P<0.05)由表21可见，与对照组相比，高剂量组蛋鸡血液BUN水平显著降低(P<0.05)，其他指标均无显著差异(P>0.05)。4.3.2.4病理学检查(1)大体观察试验结束后，对各组蛋鸡解剖，进行肉眼尸检。各组蛋鸡的主要脏器气管、心脏、肝、肾、肾上腺、脾、胃、盲肠、结肠、直肠、胰腺、部分肠系膜淋巴结、十二指肠、卵巢、子宫、皮肤等经肉眼观察，未见明显异常。表22蛋鸡喂养试验脏器体重比(n＝60)项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组心脏体重比3.59±0.514.12±0.562.39±0.133.64±0.49肝脏体重比23.69±4.2826.18±3.2823.41±3.6827.01±6.01肾体重比6.01±1.037.03±0.116.23±0.487.17±0.27脾体重比1.13±1.120.84±0.321.01±0.120.71±0.72法氏囊体重比1.09±0.490.85±0.180.49±0.300.42±0.12腺胃体重比4.09±0.323.91±0.213.39±0.714.21±0.28肌胃体重比16.14±1.1415.83±1.1514.18±2.2817.55±2.08由表22可见，与对照组相比，本发明实施例1添加剂1各组蛋鸡脏器体重差异均不显著(P>0.05)。(2)脏器组织病理检查蛋鸡肝脏、脾、肾、腺胃经HE染色，在显微镜下观察，各剂量组与对照组相比较均未见任何明显异常。综上实验结果:1.本发明实施例1添加剂1的半数致死量大于10g·(kg·bw)-1，属于实际无毒类物质。2.本试验条件下，本发明实施例1添加剂1没有致突变性。3.本试验条件下，本发明实施例1添加剂1对大鼠和蛋鸡没有慢性和亚慢性毒性，并可提高蛋鸡的生产性能。综上所述，本试验结果提示，本试验条件下，本发明实施例1添加剂1既没有急性毒性、致突变性，也没有慢性或亚慢性毒性，本发明实施例1添加剂1在适当的剂量下完全可以作为一种绿色、天然、安全的功能性饲料添加剂，并应用于畜牧生产中。本发明的实施例2和实施例3的添加剂同样进行了上述试验，同样证明本发明实施例2和实施例3的添加剂既没有急性毒性、致突变性，也没有慢性或亚慢性毒性，在适当的剂量下完全可以作为一种绿色、天然、安全的功能性饲料添加剂，并应用于畜牧生产中。对比试验1、实验用刺参：购自山东省青岛市某养殖场。在青岛市胶南海域实验基地进行海参饲喂实验：实验海水为自然海域潮起落海水，经过滤并在池中持续充气，每天一个循环水量。试验前，于水槽中驯化暂养2周。待刺参摄食、排泄等规律后，挑选500头规格整齐、体质健壮的个体进行实验。实验用水的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、PH、溶解氧等值均在正常范围内。实验用基础饲料：用市场采购饲料。试验采用单因子随机化完全区组设计，设4个处理。每组放置50头海参幼苗。试验前将各基础原料过100目筛后，充分混合后配置成饲料。空白组不添加添加剂；实施例1组添加实施例1的添加剂，添加量为基础饲料的0.07％；实施例2组添加实施例2的添加剂，添加量为基础饲料的0.07％；实施例3组添加实施例3的添加剂，添加量为基础饲料的0.07％。实验用海水经砂滤器过滤，盐度为3.0％左右，pH值为8.0左右，水温保持在18℃左右。每天15:00投喂，投喂的干饲料量为刺参体重的8％左右，视刺参的摄食、体增重及水温变化等情况而及时调整，稍过量投喂。正试期60天。刺参体重和体长的测定试验结束时，对各组刺参计数。试验开始前及每30d测定各水槽刺参体长(BL)及体质量(BM)。体长测量方法是将刺参放在盛有海水的解剖盘中，静置待其身体自然伸展后，测量各刺参体长。将幼参取出，令其体腔内的水尽量排空并用干滤纸或干毛巾快速吸附体表水分至微干，用电子天平称量(测定体重前停喂24小时)。按以下公式计算各试验组刺参的存活率(SR)SR＝Nt*100％/N0；其中，N0实验开始时头数，Nt实验结束头数。表23不同添加剂对刺参质量和存活率的影响处理初始质量g30天终质量g60天终质量g存活率SR％空白1.11±0.041.35±0.09a2.08±0.14a88实施例1组1.09±0.031.75±0.11b2.79±0.13b98实施例2组1.06±0.031.73±0.12b2.76±0.12b98实施例3组1.08±0.021.68±0.14ab2.65±0.13b96注：同列字母相同表示无显著差异(P>0.05)；字母不同，则有显著差异(P<0.05)。表24各组刺参体长的测定注：同列字母相同表示无显著差异(P>0.05)；字母不同，则有显著差异(P<0.05)。试验证明，本发明的添加剂可以有效促进刺参的生长率和成活率。2、抗病能力实验用刺参：购自山东省青岛市某养殖场。在青岛市胶南海域实验基地进行海参饲喂实验：实验海水为自然海域潮起落海水，经过滤并在池中持续充气，每天一个循环水量。试验前，于水槽中驯化暂养2周。待刺参摄食、排泄等规律后，挑选300头规格整齐、体质健壮的个体进行实验。实验用水的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、PH、溶解氧等值均在正常范围内。当养殖池内出现腐皮病现象时，将此养殖池随机选出200头分成四池分开养殖。标记分别为处理1、处理2、处理3、处理4。处理1为空白对照组，不加入添加剂；处理2在饲料中混入本发明实施例1的添加剂，添加量为饲料质量的0.1％；处理3在饲料中混入本发明实施例2的添加剂，添加量为饲料质量的0.1％；处理4在饲料中混入本发明实施例3的添加剂，添加量为饲料质量的0.1％。表25各组抗病能力试验结果组别试验开始头数成活头数成活率(％)处理1502142处理25050100处理35050100处理4504998结果表明空白对照组海参的抗病能力比较弱，免疫力不高海参反复发病，最终导致成活率仅42％；处理2-4，使用本发明实施例的添加剂后抗病能力增强，没有继续感染，腐皮病得到有效控制。说明使用本发明实施例的添加剂后海参的抗病能力增强，免疫力提高。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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