本发明涉及一种共生质，特别是指含神秘果与益生菌的共生质。本发明另涉及一种制备方法，特别是指含神秘果与益生菌的共生质的制备方法。本发明另涉及一种锭剂，特别是指含神秘果与益生菌的共生质的锭剂。
背景技术：
依据中国台湾卫福部统计，大肠癌已连续第六年蝉联国人的十大癌症发生第三位，这与现代人生活饮食习惯密不可分，中国台湾国民健康署署长指出国人饮食西化，喜好烧烤红肉、缺乏运动以及肥胖都是促使大肠癌发生机率增加的原因，因此除了定期检查与提高活动量，营造一个健康「肠」久的饮食习惯，亦是降低罹癌风险的方法，科学研究指出人类肠胃道的菌相会受宿主的饮食习惯产生变化，进而影响人体代谢功能，提高疾病发生机率。国内外医学研究证实，摄取益生菌(probiotics)与益生源(prebiotics)对肠道健康具有正面的效果，老化、代谢症候群、发炎等疾病的发生，进而影响人体免疫下降，肠道不仅是消化器官，也是最大的免疫器官。而抗氧化剂是可帮助对抗体内的自由基，减少发炎反应形成，因此抗氧化成为延缓老化、减少发炎的关键因素之一。
神秘果，学名为(synsepalmdulcificum)，属山榄科的长绿灌木，在欧美地区俗称「不可思议的莓果」，原产地为西非刚果、迦纳等国家的丛林沼泽地带，当地的土著利用其搭配食用难以咽下的发酵食物，其神奇之处在于神秘果的果肉中含有神秘蛋白(miraculin)，能够将酸度高的水果酸味转化成为具有适口甜度的味道，因此受到世人重视，更有许多人从事研究将其果肉成分的特殊醣蛋白加以提炼，以应用在糖尿病人饮食上的控制。神秘果成熟果实直径约1公分，长约2公分，表皮为鲜红色，白色果囊内有褐色的种子。白色果囊的主要成分为醣蛋白、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等，其中神秘果的神秘蛋白属于修饰味觉蛋白质(taste-modifyingprotein)的一种，具有将味蕾由酸味转变为甜味的功能。上述神秘果在应用上，虽具有将食物酸性转换成为甜味的神奇效果，但是由于其神秘蛋白在酸碱值2.5以下或12.0以上的环境中或高浓度有机溶媒存在的环境中均会破坏其活性，因此至今鲜少有人能将其制成携带方便的锭剂，以供使用者随身携带食用。
有鉴于此，如何发展并制备出具有抗氧化，同时能方便携带含神秘果的锭剂，现有技术实有待改善的必要。
技术实现要素：
为了克服现有技术的的缺点，本发明的目的在于提供一种含神秘果与益生菌的共生质，以达成提高清除超氧化物并保护细胞免受氧化损伤的功效。
为达到上述的发明目的，本发明提供一种含神秘果与益生菌的共生质的制备方法，其包含以下步骤：(1)齐备神秘果，并将其与水均质混合形成神秘果水溶液；(2)将该神秘果水溶液调整酸碱值界于5至8；(3)将经调整酸碱值的神秘果水溶液添加奶粉，形成神秘果基质；以及，(4)将该神秘果基质与益生菌经一时间发酵培养，获得含神秘果与益生菌的共生质。
本发明所述的的「共生质」，是指益生菌与益生源的混合物，并经一时间培养，共生质在肠胃道中可滋益生菌生长，促进人体健康。在本发明中，例如乳酸菌与神秘果基质的组合；又或是干酪乳酸杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌及或嗜热链球菌中一种或多种与神秘果基质的组合。
较佳的，所述的步骤(1)中，神秘果于神秘果水溶液的重量百分比浓度为0.1％至10％。
更佳的，所述的步骤(1)中，神秘果于神秘果水溶液的重量百分比浓度为0.5％至5％。
较佳的，所述的步骤(2)中，酸碱值界于6至7。
更佳的，所述的步骤(2)中，酸碱值为6.5。
较佳的，所述的步骤(3)中，奶粉于神秘果基质的重量百分比浓度为1％至10％。
更佳的，所述的步骤(3)中，奶粉于神秘果基质的重量百分比浓度为6.5％。
较佳的，所述的步骤(4)中，培养的时间为24至72小时，培养条件为37℃。
更佳的，所述的步骤(4)中，培养的时间为48小时，培养条件为37℃。
较佳的，所述的步骤(4)中，更包含将该神秘果基质与益生菌经一时间发酵培养后，经过高温灭菌。
更佳的，所述的高温灭菌以121℃灭菌15分钟。
较佳的，所述的步骤(4)中，益生菌包括，但不限于干酪乳酸杆菌(lactobacilluscasei)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseisubsp.)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、嗜热链球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus)及其组合。
更佳的，所述的干酪乳酸杆菌包括，但不限于bcrc17487。
更佳的，所述的副干酪乳杆菌包括，但不限于bcrc14023、bcrc17001、bcrc17483、bcrc17488及其组合。
更佳的，所述的嗜酸乳杆菌包括，但不限bcrc16092、bcrc16099及其组合。
更佳的，所述的嗜热链球菌包括，但不限bcrc13869、bcrc14085、bcrc14086及其组合。
本发明另提供一种含神秘果与益生菌的共生质，其由如前述的制备方法所制备而得。
本发明另提供一种含神秘果与益生菌的共生质的锭剂，其包含如前述的神秘果与益生菌的共生质经干燥研磨成一共生质粉末、一果粉以及赋形剂。
本发明的锭剂系可利用本领域技术人员所详知的技术，将上述的含神秘果与益生菌的共生质与赋形剂(excipient)制备成一适用本发明的锭剂。其中本发明所述的「赋形剂」包含，但不限于增塑剂、填料、润滑剂、稀释剂、黏合剂、崩解剂、溶剂、界面活性剂、防腐剂、甜味剂及黏度剂；较佳的，所述增塑剂包括，但不限于玉米粉；较佳的，所述润滑剂包括，但不限于二氧化硅(sio2)；较佳的，所述润滑剂包括，但不限于树脂。
较佳的，所述的共生质粉末占锭剂总重量的0.1％至1％(w/w)。
更佳的，所述的锭剂的果粉为神秘果粉或神秘果柠檬汁果粉；该神秘果柠檬汁果粉由一神秘果与一柠檬汁以重量比1：1.5至1.5：1混合后，干燥研磨制备获得。
更佳的，所述的锭剂更包含水果粉，所述水果粉系选自由西红柿、菠萝、香蕉、火龙果及其组合所组成的群组。
更佳的，所述的该锭剂更包含，但不限于芽孢杆菌属(bacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、肠球菌属(enterococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、酵母菌属(saccharomyces)、有孢子乳酸菌属(sporolactobacillus)、链球菌属(streptococcus)、梭菌属(clostridium)、红曲属(monascus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、假丝酵母菌属(candida)、或其组合。
本发明的优点在于本发明的含神秘果与益生菌的共生质能显着提升类超氧歧化酶(superoxidedismutase-like；sod-like)活性，以达成提高清除超氧化物并保护细胞免受氧化损伤的功效。此外，由于神秘果具有将酸变甜的神秘蛋白，结合益生菌发酵时产酸且提升类超氧歧化酶活性的特性，开发含神秘果与益生菌的共生质口含锭产品，达成抗氧化、健康、低卡、无糖的机能性口含锭。
附图说明
图1为本发明所使用的10种乳酸菌以deman、rogosa及sharpe(mrs)培养基后总菌数的柱状图；样品代码请参阅表1。
图2为本发明的所使用的单一乳酸菌以神秘果基质发酵后总菌数的柱状图；样品代码请参阅表1。
图3本发明的所使用的单一或混合乳酸菌以神秘果基质发酵后总菌数的柱状图；样品代码请参阅表1。
图4为本发明的所使用的单一乳酸菌以神秘果基质发酵后类超氧歧化酶活性的柱状图；样品代码请参阅表1。
图5为本发明的所使用的单一或混合乳酸菌以神秘果基质发酵前后类超氧歧化酶活性的柱状图；样品代码请参阅表1。
图6为本发明的不同浓度的神秘果基质与干酪乳杆菌lc1发酵后总菌数的柱状图。
图7为本发明的不同浓度的神秘果基质与干酪乳杆菌lc1发酵前后类超氧歧化酶活性的柱状图。
具体实施方式
以下配合图式及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成目的所采取的技术手段。
制备例1培养菌株
根据国内外文献数据显示乳酸菌对人体的健康利益良多，已经证实的功效有改善乳糖的吸收、减少下痢的发生、抑菌、降低胆固醇、抗癌及增强免疫力。参考卫生署可供食品使用原料一览表，筛选常见应用于乳酸菌共10株，都取自于台湾食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter,bcrc)，如下表1所示。
表1、10种乳酸菌株
将上述10株乳酸菌分别取每毫升104至109菌落形成单位(colony-formingunits，cfu/ml)10毫升(即105cfu至1010cfu)于100ml的mrs培养基进行培养，培养条件为37℃、48小时，以序列稀释方式进行乳酸菌数的计数(如图1所示)。除了菌株嗜酸乳杆菌la2、嗜热链球菌ss2及嗜热链球菌ss3的菌数小于107cfu/ml，另外的7株乳酸菌其菌数都大于108cfu/ml以上。
制备例2神秘果基质调配
首先将神秘果果实去除种子后的果浆进行冷冻干燥，并研磨成神秘果粉。配制每单位体积为0.5％、1.0％、1.5％及2.0％重量(w/v)的神秘果水溶液，并检测该神秘果水溶液酸碱值(ph)分别为3.18(0.5％)、3.21(1.0％)、3.26(1.5％)、3.33(2.0％)，其酸碱值都为3.5以下。因此以微量的氢氧化钠进行酸碱中和，使其最终酸碱值为5至8；较佳的酸碱值为6至7；更佳的酸碱值为6.5。将经调整酸碱值的神秘果水溶液添加6.5％(w/v)奶粉(脂肪含量为每100克奶粉含有28.8克脂肪，购自丰力富tm高优质特浓奶粉)进行高温灭菌121℃、15分钟获得神秘果基质，呈现均匀无悬浮。若灭菌前未调整酸碱值，则该神秘果基质将产生蛋白质变性悬浮(数据未呈现)，并影响乳酸菌之后的发酵程序。
实施例1神秘果与乳酸菌共同发酵培养
从制备例1中选择干酪乳杆菌1株(lc1)、副干酪乳杆菌3株(pc2、pc3及pc4)、嗜酸乳杆菌1株(la1)以及嗜热链球菌1株(ss1)，取10ml浓度为108cfu/ml至109cfu/ml(即109cfu至1010cfu)分别置于制备例2的0.5％(w/v)神秘果基质100ml共同培养于37℃、48小时。
结果如图2所示，各组的总乳酸菌数都可达到108cfu/ml以上，其中菌数较高的三者分别是副干酪乳杆菌pc2为3.1×109cfu/ml、副干酪乳杆菌pc3为1.9×109cfu/ml及干酪乳杆菌lc1为2.0×109cfu/ml；菌数较低的两者分别是嗜酸乳杆菌la1为2.3×108cfu/ml及嗜热链球菌ss1为3.9×108cfu/ml。
此外，从制备例1中选取干酪乳杆菌lc1、副干酪乳杆菌pc2、嗜热链球菌ss1、混合干酪乳杆菌lc1与嗜热链球菌ss1、以及混合副干酪乳杆菌pc2与嗜热链球菌ss1共5组进行比较。其中单一菌种的以109cfu至1010cfu菌数分别置于制备例2的0.5％(w/v)神秘果基质100ml；混合菌种干酪乳杆菌lc1取6ml浓度为109cfu/ml、嗜热链球菌ss1取4ml浓度为108cfu/ml形成3：2(v/v)，并置于制备例2的0.5％(w/v)神秘果基质100ml；混合菌种副干酪乳杆菌pc2取6ml浓度为109cfu/ml、嗜热链球菌ss1取4ml浓度为108cfu/ml形成3：2(v/v)，并置于制备例2的0.5％(w/v)神秘果基质100ml；前述5组培养于37℃、48小时。
结果如图3所示，干酪乳杆菌lc1的菌数为1.1×109cfu/ml、副干酪乳杆菌pc2的菌数为1.4×109cfu/ml，嗜热链球菌ss1的菌数为9.8×107cfu/ml，干酪乳杆菌lc1与嗜热链球菌ss1混合后菌数为8.0×108cfu/ml、副干酪乳杆菌pc2与嗜热链球菌ss1混合后菌数为7.6×108cfu/ml。
实施例2类超氧歧化酶(sod-like)活性分析
本试验方法参考marklund等人(1974)方法，以邻苯三酚(pyrogallol)氧化受抑制原理来定量类超氧歧化酶活性。pyrogallol在酸碱值小于7的环境很稳定，但若在大于7的环境中则会有自身氧化的情况，且会产生超氧阴离子，同时以一定速度生成橙色的红桔酚，若此时有类超氧歧化酶的存在则会将超氧阴离子歧化，因而抑制pyrogallol自身氧化的速率，可由此原理换算类超氧歧化酶的活性。一单位类超氧歧化酶活性定义为抑制50％pyrogallol自身氧化速率的酵素量，以紫外光-可见光分光亮度计(uv-visspectrophotometer)于420纳米(nm)测一分钟内每10秒吸光值变化，一单位酵素活性(unit,u)定义为每分钟可使pyrogallol自氧化速率减少50％所需的酵素量。对照组为制备例2的单独0.5％(w/v)神秘果基质，实验组同实施例1取制备例1中1010cfu干酪乳杆菌lc1、1010cfu副干酪乳杆菌pc2、1010cfu副干酪乳杆菌pc3、109cfu副干酪乳杆菌pc4、109cfu嗜酸乳杆菌la1、109cfu嗜热链球菌ss1、6×109cfu干酪乳杆菌lc1/4×109cfu嗜热链球菌ss1、6×109cfu副干酪乳杆菌pc2/4×109cfu嗜热链球菌ss1分别置于制备例2的0.5％(w/v)神秘果基质100ml共同培养；前述9组培养于37℃、48小时。
请参阅图4所示，类超氧歧化酶活性以干酪乳杆菌lc1的496.64u/ml最高，其次为副干酪乳杆菌pc2的447.49u/ml、副干酪乳杆菌pc3的375.07u/ml、副干酪乳杆菌pc4的364.72u/ml，活性略低的组别为嗜酸乳杆菌la1的312.99u/ml与嗜热链球菌ss1的310.40u/ml。
请参阅图5所示，对照组单独0.5％(w/v)神秘果基质的类超氧歧化酶活性为109.8u/ml，实验组经发酵后类超氧歧化酶活性以干酪乳杆菌lc1的496.64u/ml最高，其次为副干酪乳杆菌pc2的447.49u/ml，活性略低的组别为嗜热链球菌ss1的310.40u/ml、干酪乳杆菌lc1/嗜热链球菌ss1的310.30u/ml与副干酪乳杆菌pc2/嗜热链球菌ss1的316.88u/ml。因此可发现乳酸菌与神秘果基质共同发酵后，类超氧歧化酶活性具有相乘效果(synergisticeffect)。
实施例3不同浓度秘果基质对干酪乳杆菌lc1的类超氧歧化酶活性的影响
选择类超氧歧化酶活性最佳的发酵菌株干酪乳杆菌lc1与制备例2不同浓度的神秘果基质进行发酵，探讨神秘果基质添加浓度对类超氧歧化酶活性的影响。实验分为乳酸发酵前的对照组与乳酸发酵后的实验组，取制备例1中干酪乳杆菌lc1为1010cfu置于6.5％(w/v)奶粉100ml(视为0％神秘果基质)、干酪乳杆菌lc1为1010cfu分别置于制备例2的0.5％(w/v)、2％(w/v)及5％(w/v)神秘果基质各100ml，培养于37℃、48小时。
经过不同浓度的神秘果基质与干酪乳杆菌lc1发酵后，发酵液外观因添加比例而有所不同，当神秘果基质添加浓度越高，培养基质的颜色越深，溶液的黏度越高，沈淀的固型物也较为明显，以0.5％(w/v)神秘果基质添加浓度其外观与对照组较为相近。请参阅图6所示，不同浓度的神秘果基质添加对干酪乳杆菌lc1的生长没有影响，其总乳酸菌数各试验组别均为109cfu/ml以上。
请参阅图7所示，各试验组别的类超氧歧化酶活性随神秘果添加浓度增加而提升，四组对照组单独神秘果基质浓度分别为0％(w/v)、0.5％(w/v)、2.0％(w/v)及5.0％(w/v)，其类超氧歧化酶活性分别为117.64u/ml、109.80u/ml、180.39u/ml、250.98u/ml；四组实验组为经与干酪乳杆菌lc1分别与0％(w/v)、0.5％(w/v)、2.0％(w/v)及5.0％(w/v)的神秘果基质培养后各组类超氧歧化酶活性分别454.9u/ml、509.8u/ml、627.5u/ml、729.4u/ml，与对照组比较，活性增加倍数分别为2.9倍、3.6倍、2.5倍及1.9倍。由此可知，0.5％(w/v)神秘果基质添加浓度进行乳酸菌发酵，可达到较高类超氧歧化酶活性，且具有相乘效果。
实施例4共生质口含锭配方设计
本实施例中可选取包括，但不限于表1中的10种菌株单独或多种，并与不同浓度的神秘果基质共同发酵培养。在具体的实施例中，神秘果基质与干酪乳杆菌lc1共同发酵培养后获得含神秘果与益生菌的共生质，然后将共生质进行冷冻干燥并研磨成粉，获得共生质粉末。预计最终口含锭产品干酪乳杆菌lc1浓度为108cfu/g，且产品计设为每锭1克，故可依所提供的共生质粉末浓度来作比例的调整；目前提供的共生质粉末中干酪乳杆菌lc1浓度为1011cfu/g，故只占锭剂的0.1％，然而考虑到产品架储期及打锭过程中干酪乳杆菌lc1的损失，于是添加1％共生质粉末至口含锭配方设计。将神秘果与柠檬汁以重量比例为1：1.5、1：1、1.5：1及1：0等组别的不同重量比例混合并冻干成神秘果柠檬汁果粉。神秘果具辨味能力需占锭剂的30％，故以此为依据进行锭剂制作，其口含锭配方设计如表2所示。
表2、不同神秘果柠檬汁果粉的口含锭配方
4种比例的神秘果柠檬汁果粉均可成锭(总重约0.3克)，且依添加柠檬汁比例增加，其口感酸度愈高，3种有添加柠檬汁的比例中以1：1及1.5：1较能接受，但考虑到此试验剂锭只有最终产品的三分之一，且此试验锭剂表面积较小，若以1：1比例未来一般人可能较不易入口，故后续将以1.5：1的神秘果柠檬汁果粉及单独神秘果粉(1：0)进行锭剂配方设计。
实施例5多种水果粉的口含锭配方设计
目前锭剂并无甜味且口感单薄，一般口含锭会添加水果粉来增加口感及甜味，故为了帮助当地农民及未来口含锭可诉求天然、低卡、无糖/低糖的健康食品，于是将当地农民种植的水果，包括香蕉、蕃茄、菠萝及红火龙果等水果进行干燥后磨粉，添加至口含锭配方中，评估与神秘果的口感。
(1)神秘果柠檬汁果粉与单一水果粉的口含锭配方
表3、神秘果柠檬汁果粉与单一水果粉的口含锭配方
配方设计如表3所示，神秘果柠檬汁果粉与水果粉的口含锭配方设计，主要将原本口含锭配方降低赋型剂玉米淀粉重量含量(由表2所示的50％减少至25％)，另外神秘果在锭剂中需占30％且共生质粉末中干酪乳杆菌lc1浓度于锭剂需达108cfu/g，故此2种成份在锭剂所占的量为固定，于是调整水果粉含量为占锭剂的24％。将4种水果粉分别添加并试制锭剂，结果4种配方均可成锭且可尝出柠檬的微酸口感，其中添加菠萝果粉具有甜味，而香蕉及火龙果则具有滑口感。
(2)神秘果粉与单一水果粉的口含锭配方
表4.神秘果粉与单一水果粉的口含锭配方
配方如表4所示，依然将原本口含锭配方中的赋型剂玉米淀粉含量降低(50％减少至25％)，而且神秘果粉(取自制备例2的将神秘果果实去除种子后的果浆进行冷冻干燥，并研磨成神秘果粉)及共生质粉末含量在锭剂所占的量为固定，调整水果粉含量为占锭剂的44％。4种配方均可成锭，且依添加的水果粉不同而有不同口味，其中以菠萝与神秘果口感最佳；西红柿与神秘果口感搭配较不适合，而香蕉及火龙果均有滑口感。由上述四种含神秘果粉与水果粉的搭配结果，而火龙果具有颜色优势，故选择菠萝及火龙果作不同组合搭配，以调整口含锭的口感及颜色。
(3)神秘果柠檬汁果粉与多种水果粉的口含锭配方
表5、神秘果柠檬汁果粉与多种水果粉的口含锭配方
配方如表5所示，水果粉占24％，故以此比例作菠萝及火龙果比例调整，其配方如表5所示。4种口含锭配方均可成锭，其口感差异不大，依添加火龙果量增加，颜色趋向深红色，以选择接近神秘果粉颜色为基准，最后选择第2组配方组成进行产品试制。
(4)神秘果粉与多种水果粉的口含锭配方
表6、神秘果粉与多种水果粉的口含锭配方
配方如表6所示，水果粉占44％，以此作为菠萝及火龙果比例调整的依据。3种口含锭配方均可成锭，其口感差异不大，依添加火龙果量增加，颜色趋向深红色，故以选择接近神秘果粉颜色为基准，最后选择第2组配方组成进行产品试制。
将试制的共生质口含锭进行变味活性测试，以kuriharaandbeidler1969年发表于科学期刊(science)中的方法进行分析。将口含锭含于口中至完全分解后，口含0.02m柠檬酸此时感觉有甜味；以饮用水漱口后，口含5％蔗糖溶液，均感觉不到甜度，表示试制锭剂具有变味能力，且每锭所产生的变味能力相当于2.5毫克蔗糖。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。