一种防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂及其制备方法与流程

本发明属于食品储藏加工领域，尤其涉及一种防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂及其制备方法。

背景技术：

高白鲑(coregonuspeled)为辐鳍鱼纲鲑形目鲑科白鲑属其中一种，由于其适应性强、肉味鲜美、无肌间刺和生长迅速等特点，已经成为冷水鱼养殖中的一个重要品种。高白鲑自捕捞、漂洗、放置、冷冻、包装、贮藏环节中，极易受蛋白质氧化的影响，从而降低高白鲑的食用品质。有效防止高白鲑在贮藏保鲜中受蛋白质氧化的影响而降低食用品质，提升保藏和保鲜的水平成为亟待解决的课题。

冷冻保藏是一种普遍使用的水产品保藏和保鲜的方法，冷冻保藏可使水产品中的水分冻结，通过抑制活性酶和微生物生长，达到水产品长期保藏的目的。但是，水产品在冻藏过程中会出现渗透脱水、机械损伤、肌球蛋白变性、肌纤维蛋白聚集和疏水侧链的展开外露等问题。从而导致冻藏品解冻后色泽不佳，汁液流失严重，组织纤维化现象加剧等。口感和风味也与新鲜品有较大的差距，因此影响其商品价值。

抗冻剂是一类能够减轻或防止水产品蛋白冷冻变性的物质，通常在冷冻水产品中添加抗冻剂用以提升保藏保鲜的效果。工业上主要采用的抗冻剂为4％蔗糖和4％山梨醇的混合物(称“商业抗冻剂”)，该抗冻剂对鱼糜蛋白虽然具有较好的抗冻效果，但甜度和热量较高，不符合现代人追求“低甜、低热”的消费趋势。

中国专利“用于鳙鱼冷冻鱼糜的抗冻剂及其应用(申请号：200310111812.5)”公开了一种抗冻剂应用：在脱水后的鱼糜中加入4％-8％乳酸钠，于温度-18℃下冻藏，起到良好的防冻作用。乳酸钠不具有甜味，热量也较低，对鱼糜感官质量不会带来不良影响，而且还有防腐作用，试验证明其对鳙鱼冷冻鱼糜具有显著的抗冻效果，乳酸钠也具有很好的防止蛋白质变性的作用。《浙江大学》2011年第7期刊载的《纳米tio2/spi复合物的制备和保鲜性能研究》中公开了一种纳米tio2/spi复合物，将纳米tio2加入到大豆分离蛋白中,制成纳米tio2/spi复合物，能够有效降低膜的水蒸气透过率和水溶性，减小膜的油脂渗透系数,增强膜的脂质阻隔能力，改善膜的透气性，抑制细菌生长繁殖,同时,纳米tio2/spi复合物涂膜处理还能有效降低失重率和tvb-n值,减小硬度、ph值和总酸度的变化,抑制硫化氢产生,减缓感官品质的下降速度。

目前，尚未见一种既具有防止水产品蛋白质氧化功能，又可以抑制细菌生长繁殖并有效抑制水分流失的复合型抗冻剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂及其制备方法，该抗冻剂是由大豆分离蛋白、纳米二氧化钛％、乳酸钠％、甘油％、无水乙醇、余量为蒸馏水制成，该抗冻剂不仅具备了防止水产品蛋白质氧化的功能，同时可抑制细菌生长繁殖并有效抑制水分流失。该抗冻剂为复合型制剂，利用大豆分离蛋白(spi)优良的成膜性、阻水、阻氧和阻油特性；二氧化钛(纳米级)具有的无毒、抗菌并分解细菌、防紫外线、超亲水和超亲油等特性；同时利用乳酸钠的防腐、水分保持和防止蛋白质变性的作用，不仅解决了高白鲑在贮藏保鲜过程中因蛋白质氧化而导致的肉质劣变以及因水分流失引起的鲜度下降的难题，还能增强抗菌抑菌的效果。有效地提高了高白鲑贮藏期的肉质品质和保鲜水平。

本发明所述的一种防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂，所述的复合型抗冻剂的各组分是由体积百分比大豆分离蛋白4-6％、纳米二氧化钛0.1-0.2％、乳酸钠4-6％、甘油2-4％、无水乙醇10-20％、余量为蒸馏水制成。

所述的防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂，所述的复合型抗冻剂各组分是由体积百分比大豆分离蛋白5％、纳米二氧化钛0.1％、乳酸钠5％、甘油3％、无水乙醇10％、余量为蒸馏水制成。

所述一种防止蛋白质氧化引起高白鲑肌肉劣变的复合型抗冻剂的制备方法，按下列步骤进行：

a、按体积百分比将大豆分离蛋白4-6％用蒸馏水溶解，大豆分离蛋白和蒸馏水体积比为1:2，将纳米二氧化钛0.1-0.2％溶解到无水乙醇10-20％中，再将两种溶液混合；

b、将步骤a得到的混合液超声30min，加入体积百分比甘油2-4％和乳酸钠4-6％，利用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；

c、将步骤b得到的混合液利用1.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph到9.0；

d、将步骤c得到的溶液在温度80℃，恒温水浴30min，再加入余量蒸馏水进行定容，冷却至室温，即得到复合型抗冻剂。

所述的复合型抗冻剂在高白鲑以及水产品冷冻保藏中的应用。

所述的复合型抗冻剂在高白鲑以及水产品冷冻保藏中的应用方法为：将捕捞的白鲑鱼去头、去骨、去皮，清水洗净，切成长、宽各约5cm的鱼块，然后将鱼块浸泡在本复合型抗冻剂溶液中5min，取出沥干，于温度4℃下贮藏。

附图说明

图1为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白的羰基含量的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图2为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白的总巯基含量的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图3为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白游离氨含量的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图4为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图5为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白氮溶性指数的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图6a为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白乳化性的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图6b为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白乳化稳定性的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组；

图7为本发明的对高白鲑肌原纤维蛋白起泡性的作用对比图，其中—■—为对照组，—⊕—为添加传统抗冻剂组，—△—为本发明的复合型抗冻剂组。

具体实施方式

本发明所给出的实施例是便于更好地理解，但并不限定本发明。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

其中：

大豆分离蛋白由上海瑞永生物科技有限公司出产；

纳米二氧化钛(锐钛，亲水，25nm)由上海阿拉丁试剂有限公司出产；

1.5mol/l氢氧化钠溶由天津永晟精细化工有限公司出产；

乳酸钠由天津福晨化学试剂厂出产；

甘油由天津永晟精细化工有限公司出产；

实验和测试所采用的高白鲑(1000-1500g，体长30-35cm)由新疆赛湖渔业科技开发有限公司提供。

实施例1

a、按体积百分比将大豆分离蛋白4％用蒸馏水溶解，其中大豆分离蛋白和蒸馏水体积比为1:2，将纳米二氧化钛0.1％溶解到无水乙醇10％中，再将两种溶液混合；

b、将步骤a得到的混合液超声30min，加入体积百分比甘油2％和乳酸钠4％，利用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；

c、将步骤b得到的混合液利用1.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph到9.0；

d、将步骤c得到的溶液在温度80℃，恒温水浴30min，再加入余量蒸馏水进行定容，冷却至室温，即得到复合型抗冻剂。

将制备得到的抗冻剂溶液装于棕色玻璃瓶内，加盖密封，温度4℃冰箱保藏。

实施例2

a、按体积百分比将大豆分离蛋白5％用蒸馏水溶解，其中大豆分离蛋白和蒸馏水体积比为1:2，将纳米二氧化钛0.2％溶解到无水乙醇15％中，再将两种溶液混合；

b、将步骤a得到的混合液超声30min，加入体积百分比甘油3％和乳酸钠5％，利用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；

c、将步骤b得到的混合液利用1.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph到9.0；

d、将步骤c得到的溶液在温度80℃，恒温水浴30min，再加入余量蒸馏水进行定容，冷却至室温，即得到复合型抗冻剂。

将制备得到的抗冻剂溶液装于棕色玻璃瓶内，加盖密封，温度4℃冰箱保藏。

实施例3

a、按体积百分比将大豆分离蛋白6％用蒸馏水溶解，其中大豆分离蛋白和蒸馏水体积比为1:2，将纳米二氧化钛0.15％溶解到无水乙醇20％中，再将两种溶液混合；

b、将步骤a得到的混合液超声30min，加入体积百分比甘油4％和乳酸钠6％，利用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；

c、将步骤b得到的混合液利用1.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph到9.0；

d、将步骤c得到的溶液在温度80℃，恒温水浴30min，再加入余量蒸馏水进行定容，冷却至室温，即得到复合型抗冻剂。

将制备得到的抗冻剂溶液装于棕色玻璃瓶内，加盖密封，温度4℃冰箱保藏。

实施例4

a、按体积百分比将大豆分离蛋白5％用蒸馏水溶解，其中大豆分离蛋白和蒸馏水体积比为1:2，将纳米二氧化钛0.1％溶解到无水乙醇10％中，再将两种溶液混合；

b、将步骤a得到的混合液超声30min，加入体积百分比甘油3％和乳酸钠6％，利用磁力搅拌器搅拌均匀，得到混合液；

c、将步骤b得到的混合液利用1.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph到9.0；

d、将步骤c得到的溶液在温度80℃，恒温水浴30min，再加入余量蒸馏水进行定容，冷却至室温，即得到复合型抗冻剂。

将制备得到的抗冻剂溶液装于棕色玻璃瓶内，加盖密封，温度4℃冰箱保藏。

实施例5

本发明得到的抗冻剂在实际应用中的具体使用方法：

将捕捞的白鲑鱼(每条体重约2-3kg)去头、去骨、去皮，清水洗净，切成长、宽各约5cm的鱼块；

然后将鱼块浸泡在本发明得到的复合型抗冻剂溶液中5min，取出沥干，于温度4℃下贮藏。

实施例6

本发明的复合型抗冻剂抗氧化效果试验：

为检测本复合型抗冻剂的抗氧化效果，对使用本复合型抗冻剂、使用传统抗冻剂以及未经抗冻剂处理的高白鲑鱼肉相关指标进行了对比试验和检测；

将分割好的高白鲑鱼肉块，随机取一部分分成3份用于实验和对比检测：

(1)对照组，不添加任何抗冻物质；

(2)添加传统抗冻剂，主要由蔗糖和山梨醇组成；

(3)添加本发明得到的复合型抗冻剂；

(4)将3份分别包装，封口，所有样品放入温度-18℃冰箱中冷冻，经1周、2周、3周、4周和5周冻藏后，在每个处理组中随机取3份，测定理化指标和功能性指标；

一、理化指标检验：

羰基含量的检测：

取5ml的蛋白样品溶液放进离心管中，每管中加入5ml10mmol/l的2,4-二硝基苯肼(dnph)，室温下反应1h(每10min旋涡振荡一次)后，添加5ml浓度为20％三氯乙酸(tca)，8000r/min离心5min，弃清液，用5ml体积比为1:1的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液清洗沉淀3次除去多余的试剂，再向沉淀中加入3ml6mol/l盐酸胍溶液后，置于水浴锅中(温度37℃，15min)，将沉淀溶解，8000r/min离心5min，除去不溶物质，取离心后的上清液用紫外分光光度计在370nm处测吸光度，使用摩尔消光系数22000l/(mol·cm)计算羰基含量；

图1为本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白的羰基含量的作用肌原纤维蛋白的总巯基含量的作用情况；

由图1可知，随着冻藏时间的延长，对照组肌原纤维蛋白的羰基含量呈明显的上升趋势，而添加不同抗冻物质的实验组羰基含量虽在冻藏过程中也呈上升趋势，但比对照组上升缓慢。从抑制蛋白质羰基含量增加来看，本复合型抗冻剂的抗冻效果强于传统抗冻剂；

总巯基含量的检测：

取1ml的蛋白样品溶液，加入8ml的三羟甲基氨基甲烷(tris)-甘氨酸(ph8，每升该溶液中含有10.4g三羟甲基氨基甲烷，6.9g甘氨酸，1.2g乙二胺四乙酸(edta)，8mol/l尿素)，然后经均质，8000r/min离心15min，除去不溶蛋白，再在溶液中加入0.5ml，10mmol/l2-硝基苯甲酸(ellman)试剂，反应半小时后，用紫外可见分光光度计在412nm处测定吸光值，使用摩尔消光系数13600l/(mol·cm)计算总巯基含量；

图2为使用本发明的复合型抗冻剂与其它抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白的总巯基含量的作用情况；

由图2可知，随着冻藏时间的延长，对照组肌原纤维蛋白的总巯基含量呈下降趋势，而添加不同抗冻物质的实验组总巯基含量虽在冻藏过程中也呈下降趋势，但比对照组的含量要高。对照组的总巯基含量显著低于添加抗冻物质组，而传统抗冻剂和本复合型抗冻剂区别显著。说明添加抗冻物质能够有效防止蛋白质氧化，从抑制蛋白质总巯基含量减少来看，本复合型抗冻剂强于传统抗冻剂；

游离氨的含量检测：

准确称取40mg的邻苯二甲醛(opa)溶解于1ml的甲醇中，分别加入2.5ml浓度为20％的十二烷基硫酸钠(sds)、25ml0.1mol/l的硼砂和100μlβ-巯基乙醇后用蒸馏水定容到50ml，将200μl蛋白样品液分别注入到含有4ml空白液和4ml邻苯二甲醛(opa)试剂的试管中，两者混合均匀后在温度35℃条件下反应2min，在340nm下测吸光度a340nm，二者之差δa340nm为游离氨基的净吸光度，氧化蛋白的吸光度值与未氧化蛋白的吸光度值相比所占百分比为游离氨的相对含量；

图3为使用本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白游离氨含量的作用情况；

由图3可知，随着冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白的游离氨含量呈下降趋势，对照组的游离氨含量及其降低程度显著高于添加抗冻物质组，而传统抗冻剂与本复合型抗冻剂区别显著。说明添加抗冻物质能够有效防止高白鲑肌原纤维蛋白的氧化，从降低蛋白质游离氨含量来看，本复合型抗冻剂强于传统抗冻剂；

表面疏水性的检测：

取1ml的蛋白样品溶液加入200μl1mg/ml的溴酚蓝(bpb)，混匀，室温下搅拌10min，然后8000r/min离心15min，取上清液在595nm下测定吸光值，记作a；溴酚蓝空白样是用1ml20mmol/ml的磷酸盐缓冲液(ph6.0)加200μl溴酚蓝，磷酸盐缓冲液作空白样，在595nm下测定吸光值，记作a0，计算公式如下：

图4为使用本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性的作用情况；

由图4可知，对照组的表面疏水性及其变化程度与使用本复合型抗冻剂差异不显著，而与添加传统抗冻剂组区别显著，说明添加抗冻物质能够防止高白鲑肌原纤维蛋白的氧化，从抑制肌原纤维蛋白表面疏水性来看，本复合型抗冻剂的抗冻效果稍逊于传统抗冻剂；

二、功能性指标检验

氮溶性指数检测：

称取10ml蛋白样品分散于10ml的蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌30分钟，接着用1mol/lnaoh或hcl溶液调节溶液的ph值至7.0，搅拌30min后，温度4℃，8000r/min，离心20min，采用双缩脲法测定蛋白质的含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，制作标准曲线，蛋白质的氮溶指数用上清液蛋白浓度(mg/ml)占总蛋白浓度(mg/ml)的百分比表示，氮溶性指数(nsi)的计算公式为：

图5为使用本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白氮溶性指数的作用情况；

由图5可知，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白氮溶性指数在不断下降；对照组的氮溶性指数及其降低程度显著高于添加抗冻物质组，而传统抗冻剂与本复合型抗冻剂区别显著；说明添加抗冻物质能够有效防止高白鲑肌原纤维蛋白的氧化，从抑制蛋白质氮溶性指数下降来看，本复合型抗冻剂强于传统抗冻剂；

乳化性及乳化稳定性检测：

取大豆油和蛋白溶液1:4放入50ml的塑料离心管中，使其混合均匀，然后从距离心管底0.5cm的位置取50μl(剩余的混合液备用)混合均匀的溶液，放入到含有5ml0.1％十二烷基硫酸钠溶液中，使用漩涡振荡器使其混匀后用紫外可见分光光度计在500nm处测定吸光值记作a1，匀浆后10分钟再次在相同位置取匀浆液50μl，加入到5ml0.1％十二烷基硫酸钠溶液中，振荡混匀后测定吸光值记做a2，用0.1％十二烷基硫酸钠溶液作空白对照。肌肉蛋白匀浆液的乳化性eai和乳化稳定性esi，分别由下面公式来表示：

式中：

l—比色杯光径，1cm；

φ—为油相体积分数(v/v)(φ＝0.2)；

c—蛋白质浓度；

a1—乳状液在0min的吸光值；

a2—乳状液在10min的吸光值；

图6为使用本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白乳化性及乳化稳定性的作用情况；

由图6可知，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白乳化性和乳化稳定性在不断下降。对照组的乳化性及乳化稳定性显著高于添加抗冻物质组，从抗冻效果来看本复合型抗冻剂强于传统抗冻剂；

起泡性检测：

在室温下(25℃)取20ml的肌肉蛋白溶液，磁力搅拌30min，取10ml(v0)溶液于50ml塑料量筒中，高速匀浆机搅打1min，立刻读取泡沫的总体积(v1)，肌肉蛋白的起泡性fc由下面公式来表示：

图7为使用本发明的复合型抗冻剂与传统抗冻剂对高白鲑肌原纤维蛋白起泡性的作用情况；

由图7可知，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白起泡性在不断下降。对照组的起泡性及其降低程度显著高于添加抗冻物质组，而传统抗冻剂与本复合型抗冻剂区别显著，说明添加抗冻物质能够有效防止高白鲑肌原纤维蛋白的氧化，从蛋白质的起泡性来看，本复合型抗冻剂的抗冻效果强于传统抗冻剂。