一种多菌混合发酵青砖茶的方法与流程

本发明涉及两种真菌，匍枝根霉菌和总状枝毛霉菌的应用及其发酵青砖茶的方法，属于微生物发酵技术应用领域。

背景技术：

我省是茶叶大省，产量大，中高档茶全部由春季茶的鲜叶加工而成，夏秋季茶的鲜叶只能加工成附加值低的大宗茶，但近年来大宗茶价格连续下跌，茶叶生产结构调整迫在眉睫。

后发酵茶(黑茶)是指在干燥前或者干燥后进行握堆，通过微生物作用和水热作用促使多酚类物质充分进行自动氧化，从而形成的香味醇，汤色深红的干茶。成品茶现有湖南的天尖，贡尖，生尖，黑砖茶，花砖茶，特制获砖茶，普通获砖茶，湖北青砖茶，广西六堡茶，四川的南路边茶和西路边茶，云南紧茶等，黑茶成品繁多，炒制技术和压造成型的方法不尽相同，都是经原料粗老，握堆变色，高温气蒸，压造成型等工序。

青砖茶是湖北特产之一，是由黑茶经紧压后制成的再加工茶，风味独特。青砖茶特殊风味的形成主要在发酵阶段形成，黑茶发酵利用湿热与微生物共同作用发生物质转化，发酵周期长，品质特征突出。

湖北青砖茶采用海拔600-1200米高山茶树鲜叶为原料，经发酵，成化，蒸压，烘干等程序制成。青砖茶色泽青褐，香气纯正，汤色红黄，滋味香浓，是独具特色的黑茶之一。从前人对湖南安化黑茶、云南普洱茶等黑茶系列的研究得知，发酵的过程对改变茶的品质具有非常关键的作用。

渥堆工艺是黑茶品质形成关键，其实质是茶坯在湿热和微生物共同作用下发生以多酚类为主化学成分发生一系列的生化反应，从而形成了黑茶特有的风味品质。目前国内外对黑茶品质的研究多集中于茯砖茶和普洱茶等，普洱茶香气成分的特征在于渥堆过程中形成了大量芳香族化合物，如1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯等。而茯砖茶的“菌花香”也主要在“发花”期间通过冠突散囊菌等微生物作用下形成，其中芳樟醇及其氧化物是对香气贡献较大的一类成分。此外，渥堆后的风干陈化也对黑茶的香气有显著影响。以上加工化学研究为探明黑茶风味品质形成机理奠定了基础，对黑茶加工工艺优化和产品品质的提升具有积极意义。

黑茶发酵中参与的微生物主要有真菌、酵母、细菌、放线菌等，其中丝状真菌为优势菌株，在发酵过程中起到重要作用。与茯砖茶、普洱茶等其他黑茶相比，青砖茶加工品质化学研究较少，关于青砖茶发酵过程在初制、渥堆过程中变化更是尚未见报道，从毛茶初制到渥堆结束的整个动态加工过程中青砖茶挥发性成分的变化规律及形成原因尚不明确。

技术实现要素：

本发明目的在于提供两种能够用于发酵青砖茶的真菌菌株；以及运用两种真菌混合发酵青砖茶的方法。

本发明利用的真菌均从青砖茶发酵茶堆中分离纯化获得；一种菌株是总状枝毛霉菌(mucorracemosusfres)，命名为总状枝毛霉菌xingding-2；另一种菌株是匍枝根霉菌株(rhizopusstolonifer)，命名为匍枝根霉菌xingding-3；均保藏于中国典型培养物包藏中心；保藏编号分别为cctccm2017241，cctccm2017240；保藏时间为2017年5月5日。

采用本发明的两种真菌发酵生产青砖茶的方法为：分别液态培养两种真菌，富集其孢子制成孢子悬液并计数。按照每斤晒毛青茶投放二十万真菌孢子的比例进行接种。

具体采用两种真菌发酵青砖茶的方法如下：

(1)斜面培养：匍枝根霉菌xingding-3和总状枝毛霉菌xingding-2分别接种于斜面培养基上培养，得斜面菌株；

(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，得到种子培养液，培养完成后于3000r/min离心10min弃去上清液，获得菌种孢子；

(3)茶叶发酵：选取绿毛茶洒水至含湿量为20-50％，接种步骤(2)中收获的菌种孢子后进行发酵，发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25-30℃，湿度为85-95％，发酵3-4天以后，待茶堆温度升到50-60℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续生长白色菌丝体，并伴随温度上升，待温度再升到50-55℃时，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止；

(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为35-45小时，完成青砖茶散茶的制作。

所述的步骤(1)中，匍枝根霉菌xingding-3和总状枝毛霉菌xingding-2分别接种于斜面培养基上，在28℃下培养48小时，得斜面菌株；所用斜面培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

所述的步骤(2)中，取斜面菌株分别接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液，培养完成后于3000r/min离心10min弃去上清液，获得菌种孢子；所用种子培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

所述的步骤(3)中，绿毛茶洒水至含湿量为30％；接种步骤2中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放二十万真菌孢子的比例进行发酵；发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％。

所述的步骤(4)中，将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min。

有益效果：

1、首次分离培养出能够用于青砖茶发酵生产的真菌菌株匍枝根霉菌xingding-3；

2、本发明利用混合真菌发酵方式生产青砖茶，大大缩短了青砖茶发酵周期，提高生产效率；

3、本发明应用外加混合真菌菌株的方法，使发酵过程快速形成特定优势菌群，应用于发酵生产青砖茶，生产方式具有新意。

保藏说明

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学

保藏日期：2017年5月5日

保藏编号:cctccm2017240和cctccm2017241

分类命名：匍枝根霉rhizopusstolonifer(xingding-3)和总状枝毛霉菌mucorracemosusfres(xingding-2)

附图说明

图1：本发明所用匍枝根霉菌xingding-3在显微镜下形态特征。

图2：本发明所用毛霉菌xingding-2在显微镜下形态特征。

图3：本发明匍枝根霉菌xingding-3在pda平板上正面的形态。

图4：本发明匍枝根霉菌xingding-3在pda平板上反面的形态。

图5：本发明毛霉菌xingding-2在pda平板上正面的形态。

图6：本发明毛霉菌xingding-2在pda平板上反面的形态。

图7：添加匍枝根霉菌xinding-3发酵青砖茶茶堆样。

图8：添加匍枝根霉菌xingding-3和总状枝毛霉菌xingding-2发酵青砖茶茶堆样。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂活仪器为注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1匍枝根霉菌菌株xingding-3的形态学鉴定；

菌株xingding-3分离自青砖茶发酵茶堆，显微镜观察其形态如图1所示。分别在查氏琼脂、查氏酵母琼脂、麦芽汁琼脂等培养基质上培养，培养温度28℃，培养时间2-5d，观察形态。

查氏琼脂上菌落为白色、菌丝体分为两部，营养菌丝生长由中央向四周呈现较规则圆形，气生菌丝大量，菌落生长较快。察氏酵母琼脂上菌落为白色、菌落形态为较规则圆形，气生菌丝较多，与查氏琼脂相比，生长更快。麦芽汁琼脂上菌落为白色，气生菌丝较多，生长较查氏琼脂和察氏酵母琼脂快。参照《真菌鉴定手册》对xingding-3菌株进行形态学比对，确定xingding-3菌株为rhizopusstolonifer属菌。

实施例2菌株xingding-3分子鉴定：

提取菌株基因组dna，利用its1与its4通用引物对该基因组dna进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)以增殖特定dna序列，并利用美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)数据库进行菌株比对。

(1)18srdna序列分析：

its1rdna引物序列：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'

its4rdna引物序列：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'

扩增获得18srdna序列，序列全长617bp。将该扩增所得18srdna序列与genebank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，从ncbi上查出与菌株xingding-3同源性较高的菌株为rhizopusstolonifer(am933546.1)，同源性达到99％。

(2)lsurdna序列分析：

nl1rdna引物序列：5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3'

nl4rdna引物序列：5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3'

扩增获得28srdna序列，序列全长683bp。将该扩增所得28srdna序列与genebank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，查出与菌株xingding-3同源性较高的菌株为rhizopusstoloniferstraindaom225707(jn938904.1)，同源性达到99％

因此可以判定xingding-3为匍枝根霉菌株。序列已经提交至ncbi上genebank数据库(序列号为ky373221)。匍枝根霉菌xingding-3于2017年保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)；保藏编号为cctccm2017240；此生物材料已经存活实验测试并通过该实验。

实施例3利用匍枝根霉菌株进行青砖茶发酵实验：

(1)斜面培养：匍枝根霉菌xingding-3接种于斜面培养基上，在28℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株一环接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液，并于3000r/min离心10min弃去上清液，获得菌种孢子。所用种子培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

(3)茶叶发酵：选取三级绿毛茶洒水至含湿量为30％。接种步骤2中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵。发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为30℃，湿度为90％。发酵3至4天以后，发酵真菌在茶堆表面繁殖生长，茶叶叶片上可见白色菌丝体，同时伴随着茶堆温度上升，待茶堆温度升到45℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续上升，待温度升到40℃左右，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止。

(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min，得到汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为40小时，完成青砖茶散茶的制作。

实施例4利用两种真菌混合发酵青砖茶实验

(1)斜面培养：匍枝根霉菌xingding-3和总状枝毛霉菌xingding-2分别接种于斜面培养基上，在28℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

(2)发酵菌种扩大培养：各取斜面菌株一环分别接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液，于3000r/min离心10min弃去上清液，获得菌种孢子。所用种子培养基，每1l中含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然ph，121℃灭菌20min。

(3)茶叶发酵：选取三级绿毛茶洒水至含湿量为30％。接种步骤2中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放真菌孢子各十万的比例进行发酵。发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为28℃，湿度为90％。发酵3至4天以后，发酵真菌在茶堆表面繁殖生长，茶叶叶片上可见白色菌丝体，同时伴随着茶堆温度上升，待茶堆温度升到50℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续上升，待温度升到45℃左右，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止。

(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min，得到汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为40小时，完成青砖茶散茶的制作。

实施例5发酵青砖茶的审评：

对发酵茶的审评参照《茶叶感官审评方法》，从外形、汤色、香气、滋味等方面对本实验发酵生产的茶叶与传统生产方式生产的青砖茶进行对比，结果如表1。结果显示运用本方法发酵生产的茶与传统方法生产的青砖茶品质上并无太大差异，与单独匍枝根霉发酵相比，滋味更加醇和，汤色更红，香气略差。说明本方法可以用于青砖茶的生产，且本方法用时更短，生产效率更高。

表1本发明生产青砖茶与传统青砖茶审评对比