本发明属于医药技术或保健食品等
技术领域：
，具体涉及一种松露和石斛为原料的菌质及其制备方法。
背景技术：
：石斛为兰科石斛兰属多年生草本植物，喜在温暖、潮湿、半阴半阳的环境中生长。李时珍在《本草纲目》中称其“强阴益精，久服厚肠胃，轻身延年”。民间称为“救命仙草”“紫楹仙姝”的石斛含有丰富的多糖类、石斛碱等物质，不但具有增强免疫功能的作用，而且能够滋阴养血，是气阴两虚人群清补首选；由于市场需求量大且原生态石斛产量有限，如何高效利用成了目前亟待解决的问题。松露，别称块菌(truffle)，俗称猪拱菌，是一类与松科、壳斗科、桦木科等高等树木形成典型共生关系的外生菌根真菌，我国松露资源主要分布在四川和云南；松露中含有α-雄烷醇、神经酰胺、块菌多糖等多种生物活性物质，不仅具有抗病毒、抗突变和高效抗氧化性等方面的药理作用，而且其作为男性传统壮阳食用菌备受关注，对女性也有很好的养颜健体的保健价值。块菌子实体在发育的过程中伴有细菌、酵母菌等微生物，块菌根际或子囊果内微生物多样性不仅影响块菌的生长发育，而且对块菌芳香族化合物的产生有不可忽视的作用，研究结果表明块菌特殊香气的产生既来自块菌本身，也来自其体内的细菌(splivalloetal.2011)。基于geochip功能基因列阵分析块菌微生物居群的最新研究结果证实t.borchii子囊果内的细菌可以产生含硫化合物。运用微生物发酵转化中药材已成为现代中药研究的热点，“神曲”最早见于北魏《齐民要术》，沿用至今已1500余年，它是曲类药的代表，至近代又发展出现了“固体培养”工艺生产猴头培养物等。技术实现要素：基于上述原因，申请人经过多年的研究，以石斛作为主要发酵基质，以松露菌液作为菌种，采用真菌双向发酵技术进行发酵，得到一种新的药性菌质制备方法，该方法旨在增加两者的生物活性成分的含量及增强药效，尤其是提高免疫力功效。本发明通过下述技术方案实现的。一种发酵菌质，发酵菌质由下述原料制备而成：石斛和松露。所述的发酵菌质的制备方法包括松露菌液的制备方法和双向发酵方法，其中双向发酵方法包括：固态双向发酵方法或液态双向发酵方法。其中松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果依次用75％酒精处理5min，0.1％升汞处理5min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养24h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于23-28℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复4-6次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物按照5％(w/v)接入种子培养基，在23-28℃、150rpm条件下培养6-10d得到松露菌液；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。其中固态双向发酵的制备方法为：a、将石斛加入营养液和纯净水匀浆使其含水量为总重量的60-70％，于121℃灭菌20min得到石斛固态培养基；b、将松露菌液按照10ml/100g接种到石斛固态培养基中，搅拌均匀使料层厚度为3-5cm，放置于23-28℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质。其中液态双向发酵的制备方法为：a、将石斛与水按质量比1∶5-10混合并打浆，在60℃逆流提取1h后取滤液，加入营养液于121℃灭菌20min得到石斛液态培养基；b、将10％体积比松露菌液接入石斛液态培养基中，在23-28℃、150rpm条件下发酵6-10d；c、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质。所述的菌质在提高免疫力食品中的应用。所述的菌质在与谷物一起发酵制备养生酒中的应用。本发明所述的菌质为：松露与石斛双向发酵药性菌质，该菌质可以单独作为食品食用，也可以将其与其他成分组合后用于提高免疫力，或者将该菌质单独或与谷物一起发酵制备养生酒使用。本发明所述的石斛为石斛全草、石斛根、石斛茎、石斛叶、石斛花、石斛组织培养物中的一种或几种，可以是鲜品或干品。本发明所述的营养液由去离子水、可溶性淀粉、无机盐、维生素b、铵态氮、硝态氮、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、蛋白胨、酵母膏、麦芽、麸皮、松针、橘皮苷、桑色素、甲硫氨酸、苯丙氨酸、柠檬酸中的一种或几种制备而成。上述原料都可从商业途径购买得到。具体实施例以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。尽管以下本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，下述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。本发明下述试验，是在多次创造性试验的基础上，以本发明所要保护的技术方案为基础，总结的研发人员的结论性试验。试验1提高免疫力试验试验动物：balb/c雄性小鼠，体重18-20g。试验药物：对照组：石斛100g，加注射用水，匀浆后备用；试验组：本发明实施例菌质100g，加注射用水，匀浆备用。试验方法：取小鼠，随机分组，每组10只，将小鼠造模为免疫力低下，正常组不造模，造模成功开始给药，空白组给予生理盐水0.2ml/20g。对照组和试验组灌胃给药，给药量10ml/kg，连续给药30天，停药后24小时断头放血处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用1640培养液(含10％小牛血清)制成脾细胞悬液，将小鼠脾细胞调整到5×106细胞/ml，加到96孔培养板中，每孔100μl，每个孔加双份(即一个加cona，一个不加cona)。cona20μl(浓度为1000μg/ml)，1640培养液80μl，是每孔至200μl体积，于5％co237℃恒温箱内培养72小时，终止培养前24小时，每孔加3h-tdr3.7×109(iucr)。用细胞收集器(titertekcellharvester550)收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，依次用蒸馏水、5％三胺醋酸、无水乙醇洗涤，将滤纸置于60℃温箱中烘干，加到含5ml闪烁液的杯内，经液闪仪(beckmenls9800)测参入放射性活度(cpm)，然后计算刺激指数(si)，即si＝加入cona孔cpm/未加入cona孔cpm。表1对免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化的影响。组别si正常组0.709±0.054**空白组0.131±0.102对照组1.479±0.096**实施例1组2.891±0.570**#实施例2组2.918±0.543**#实施例3组2.930±0.607**#实施例4组2.874±0.472**#实施例5组3.217±0.749**#实施例6组3180±0.701**#注：与空白组比较**p＜0.01，与对照组比较#p＜0.05试验结论：上述试验表明，本发明菌质具有很好的提高免疫力的作用，与石斛组比较，具有显著性差异(p<0.05)。制备实施例实施例1松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果20g依次用75％酒精处理5min，0.1％升汞处理5min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养24h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果10g用无菌水50ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于23℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复4次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物10g接入200ml种子培养基，在23℃、150rpm条件下培养6d得到松露菌液160ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。固态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g加入营养液3g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的60％，于121℃灭菌20min得到石斛固态培养基；b、将松露菌液10ml接种到100g石斛固态培养基中，搅拌均匀使料层厚度为3cm，放置于23℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质90g。实施例2松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果20g依次用75％酒精处理5min，0.1％升汞处理5min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养24h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果10g用无菌水50ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于23℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复4次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物10g接入200ml种子培养基，在23℃、150rpm条件下培养6d得到松露菌液160ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。液态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g与纯净水500ml混合并打浆，在60℃逆流提取1h后取滤液，加入营养液3g于121℃灭菌20min得到石斛液态培养基；b、将50ml松露菌液接入500ml石斛液态培养基中，在28℃、150rpm条件下发酵6d；c、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质65g。实施例3松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果50g依次用75％酒精处理15min，0.1％升汞处理15min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养48h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果30g用无菌水300ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于28℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复6次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物15g接入300ml种子培养基，在28℃、150rpm条件下培养10d得到松露菌液240ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。固态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g加入营养液6g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的70％，于121℃灭菌20min得到石斛固态培养基；b、将松露菌液按10ml接种到100g石斛固态培养基中，搅拌均匀使料层厚度为5cm，放置于28℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质85g。实施例4松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果50g依次用75％酒精处理15min，0.1％升汞处理15min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养48h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果30g用无菌水300ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于28℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复6次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物15g接入300ml种子培养基，在28℃、150rpm条件下培养10d得到松露菌液240ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。液态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g与纯净水1000ml混合并打浆，在60℃逆流提取1h后取滤液，加入营养液6g于121℃灭菌20min得到石斛液态培养基；b、将松露菌液100ml接入1000ml石斛液态培养基中，在28℃、300rpm条件下发酵10d；c、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质60g。实施例5松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果100g依次用75％酒精处理10min，0.1％升汞处理10min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养24h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果50g用无菌水300ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于25℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复5次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物10g接入200ml种子培养基，在25℃、150rpm条件下培养8d得到松露菌液160ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。固态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g加入营养液5g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的65％，于121℃灭菌20min得到石斛固态培养基；b、将松露菌液10ml接种到100g石斛固态培养基中，搅拌均匀使料层厚度为4cm，放置于25℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质95g。实施例6松露菌液的制备方法为：(1)取松露子囊果100g依次用75％酒精处理10min，0.1％升汞处理10min，无菌水充分清洗3次，取最后一次清洗的溶液0.1ml涂布pda培养基，30℃培养24h后无菌生长则认为表面消毒干净；(2)将消毒后的松露子囊果50g用无菌水300ml和无菌研钵适度研碎得到研磨液；(3)将研磨液涂布于ksp培养基平板，于25℃培养，挑取单菌落于ksp培养基平板划线纯化分离，重复5次分离纯化培养，直至获得纯培养物；所述的ksp培养基的成分为：麦芽糖30g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏10g/l、琼脂20g/l、新鲜石斛浸出汁1l。(4)将上述获得的纯培养物10g接入200ml种子培养基，在25℃、150rpm条件下培养8d得到松露菌液160ml；所述的种子培养基成分为：麦芽糖30g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨10g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸铵1g/l，121℃灭菌20min。液态双向发酵的制备方法为：a、将石斛100g与纯净水800ml混合并打浆，在60℃逆流提取1h后取滤液，加入营养液5g于121℃灭菌20min得到石斛液态培养基；b将松露菌液80ml接入800ml石斛液态培养基中，在25℃、150rpm条件下发酵8d；c、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质70g。当前第1页12