包含饲料添加剂的动物饲料颗粒、其制备和使用方法与流程

本申请要求ericnadeau于2016年6月14日提交的美国临时专利申请序列号62/349,843的权益。以上引用的文件的内容通过引用整体并入本文。

本发明一般地涉及包含饲料添加剂的动物饲料颗粒(animalfeedpellet)领域、其制备及其用途。

背景技术：

颗粒状动物饲料通常定义为通过任何机械方法通过压缩和强制通过模具开口挤出单独的成分或混合物而形成的团聚饲料。基本上，造粒(pelleting)的目的是使得细碎、有时多尘、不适口和难以处理的饲料物质通过使用高的热、湿度(蒸汽调理(steam-conditioning))和压力，将其形成更大的颗粒。

在商业饲料研磨中使用多种调理温度(conditioningtemperature)和保留时间组合(mccracken，poultryfeeds，supply，compositionandnutritivevalue，cabinternational，newyork(2002)，第301-316页)并且通常来说，造粒过程涉及恶劣的热、湿度和压力条件，以便控制饲料传播的病原体，例如沙门菌(salmonella)和大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)。例如，在目前的工业实践中，一些饲料厂的调理器温度可达到90℃，其中饲料工业倾向于采用甚至更高和更苛刻的饲料加工条件来控制饲料传播的病原体。

并入到动物饲料颗粒中的益生菌补充剂可能带有热稳定和贮存稳定的细菌菌株，由于在其他情况下在造粒的苛刻压力、温度和湿度条件下细菌的不稳定性将对它们在颗粒化饲料中的使用造成问题。

例如，可以以芽孢形式存在的菌株可用于并入到动物饲料颗粒中。细菌芽孢是休眠的生命形式，其通过抵抗细菌生境的极端变化(包括极端温度、缺乏水分/干旱或暴露于化学品和辐射)而有助于细菌生存。当试图将益生菌并入到动物饲料颗粒中时，细菌芽孢可因此是有帮助的。大多数形成芽孢的细菌包含在芽孢杆菌属(bacillus)和梭菌属(clostridium)物种中。

非芽孢形成的益生菌菌株通常不并入颗粒中，而是涂覆在颗粒上，即在颗粒成分经受上述苛刻条件之后。例如，wo2011/094469描述了益生菌宠物食物和鱼饲料的制备，其中饲料颗粒首先用基于脂肪的水分屏障喷涂，然后与含有益生菌的干燥组合物接触，并最后用另外的基于脂肪的水分屏障涂层喷涂，使得饲料颗粒表面上的涂层量为约10％至15％(wt/wt)。

技术实现要素：

提供本概述以便以简化的形式介绍将在以下的详细描述中进一步描述的一些概念。本概述不旨在确定所要求保护主题的关键方面或基本方面。

如本文中具体实现和广泛描述的，本公开内容涉及动物饲料颗粒，其包含并入到该颗粒中的活的非致病性大肠杆菌。大肠杆菌的量足以向摄入该动物饲料的动物提供有益效果。大肠杆菌是通常与食物无关的微生物；因此，大肠杆菌自主地包含在该动物饲料中不是常规和惯用的。

如前所述，工业中使用的造粒条件设计成使饲料成分经受苛刻条件以控制(即，杀伤)病原体，例如沙门菌和大肠杆菌。在一个实施方案中，本公开内容提出了减轻必要的苛刻条件之影响的方法，以便在仍然控制病原体的同时将非致病性大肠杆菌细菌并入到饲料颗粒中。

在一个实施方案中，动物饲料颗粒包含至少1×10⁵cfu/g的并入到该颗粒中的活的非致病性大肠杆菌细菌。

在一个实施方案中，活的非致病性大肠杆菌包埋在饲料添加剂中。然后将饲料添加剂并入到动物饲料颗粒中。在实际的一些实施方案中，饲料添加剂可以以多种形式并入到动物饲料中。例如，饲料添加剂可与动物饲料共挤出，或包封在动物饲料中等。本领域技术人员将容易认识到，多种将饲料添加剂并入到动物饲料中的方式可在本公开内容的上下文中使用。

如本文中所体现和广泛描述的，本公开内容还涉及用于将活的非致病性大肠杆菌并入到动物饲料颗粒中的饲料添加剂，该饲料添加剂包含包埋在基质中的非致病性大肠杆菌，其中所述基质在并入到该颗粒中之前具有≤0.3的水活度(wateractivity，aw)。基质包含形成水胶体的多糖(hydrocolloid-formingpolysaccharide)。

在一个非限制性实施方案中，饲料添加剂还包含以下特征组中的一种或更多种：

·基质可包含第二多糖，其不同于形成水胶体的多糖。任选地，基质可包含二糖。

·基质可包含布置在其表面的至少一部分上的涂层。

·基质可包含孔。

·涂层可包含第二多糖，其不同于形成水胶体的多糖。任选地，涂层可包含二糖。

·涂层可包含颗粒状含钙化合物。

·基质可包含孔，并且涂层可至少布置在界定该孔的表面上。

技术人员将容易认识到，饲料添加剂的一些实施方案可包括上述特征的任意组合。

在以上一些实施方案中，技术人员将容易认识到，基质可包含一种或更多种要素(element)，其适合于动物食用(consumption)和/或与非致病性大肠杆菌相容。

在一个非限制性实施方案中，饲料添加剂包含至少1×10⁶cfu/g的大肠杆菌。例如，饲料添加剂可包含至少1×10⁷cfu/g、至少1×10⁸cfu/g、至少1×10⁹cfu/g、至少1×10¹⁰cfu/g、至少1×10¹¹cfu/g。

在一个非限制性实施方案中，饲料添加剂是颗粒形式。在实际实施中，至少一部分颗粒可形成颗粒聚集体，其通过包含如先前所述的涂层的桥(bridge)结合在一起。

在一个实际的非限制性实施方案中，本文中所述的颗粒状含钙化合物包含乳酸钙。

在一个非限制性实施方案中，饲料添加剂可包含一种或更多种要素，其提供如同饲料添加剂的常规储存/运输条件，和/或当并入到动物饲料中时，对细菌细胞生存力和/或功能特征没有显著的不利影响。换言之，即使在特定实施方案中，非致病性大肠杆菌可具有天然的对应物，后者将经受常规储存/运输条件，使得其将导致细菌细胞生存力的显著降低和/或丧失功能特征。因此，本文中所述的饲料添加剂在常规储存/运输条件下(例如，可包括例如处于或高于环境温度和相对湿度的条件)可使大肠杆菌稳定化并长时间保持其活性。此类要素的实例在本文的其他地方进一步讨论。

在一个作为补充或替代的实施方案中，饲料添加剂可包含一种或更多种要素，使得与天然存在的大肠杆菌相比，大肠杆菌具有显著改变的性质，例如但不限于以下至少一种：

·饲料添加剂可包含一种或更多种低温保存剂，其可有利地允许在饲料添加剂的制备和/或储存期间冻干或冷冻大肠杆菌，而不显著降低细菌细胞生存力和/或丧失功能特征；

·饲料添加剂可包含一种或更多种可积极影响感官特性的要素，使得在并入到动物饲料中后，与缺乏这样的一种或更多种要素的组合物中天然存在的非致病性大肠杆菌相比，动物饲料可具有更令人愉快的口感。例如，可包含与培养液(culturebroth)混合的非致病性大肠杆菌的饲料添加剂会具有典型的恶臭(foul)气味/味道，其可使动物抗拒并因此显著地使该饲料的施用更加困难，而对感官特性产生积极影响的一种或更多种要素的存在可掩饰或中和这种恶臭气味/味道；

·饲料添加剂可包含可影响大肠杆菌制剂形式(例如，转化为凝胶状可涂抹稠度和/或多孔固体或半固体结构等)的一种或更多种要素，这可有利于造粒时将大肠杆菌并入到动物饲料中；

·饲料添加剂可以是具有可定制粒度的颗粒形式，其中可选择定制尺寸或尺寸范围以获得期望的结果。例如，可选择第一颗粒群体以具有第一平均直径尺寸，并且可选择第二颗粒群体以具有第二平均直径尺寸。第一平均直径尺寸和第二平均直径尺寸可不同，即具有>1的尺寸比(第一：第二)。技术人员将认识到这样的粒度分布可导致可定制的溶出速率(dissolutionrate)以获得期望的结果。

技术人员将容易认识到，饲料添加剂的一些实施方案可包括上述特征的任意组合。

上述实施方案代表了改变的性质的一些非限制性实例，其与天然存在的大肠杆菌的特征相比可示出显著的特征差异，因为它们导致动物饲料颗粒以与本发明的性质相关的方式与其天然对应物不同。

在一个非限制性实施方案中，与天然存在的干燥大肠杆菌的相应缓慢和不一致的溶出速率相反，可定制的粒度可提供获得干燥大肠杆菌的提高和/或一致的溶出速率。实际上，可基于第一和第二颗粒群体之间的适当粒度比的选择来获得定制的溶出速率。

在一个非限制性实施方案中，与天然存在的大肠杆菌或以其他形式(例如，在饮用水中)施用的大肠杆菌的突释递送相反，可定制的粒度可提供获得非致病性菌株的时间释放递送。这样的时间释放递送可基于定制大/小颗粒的比值，使得总的来说大肠杆菌在预定的时间段内免受苛刻的肠道环境的影响。进而，大肠杆菌的受控递送定时可在沿着肠道的预选位置处提供递送。换言之，技术人员可选择特定的粒度分布以提供大肠杆菌的给定的时间释放，使得当影响肠道转运的多种因素时，大肠杆菌可主要在预先确定的肠道部分中递送。

如本文中所体现和广泛描述的，本公开内容还涉及用于将本文中所述的饲料添加剂并入到动物饲料颗粒中的系统。该系统可包含用户界面，用于允许用户控制并入到动物饲料中的细菌量或者提供给每个动物送料车(feedwagon)和/或饲料系统的细菌量。这可通过以下非限制性实际实施中的一个或更多个来获得：

·活化包埋在饲料添加剂中的预定量的活的但是休眠的细菌。这可例如通过向预定量的细菌/饲料添加剂添加合适的活化剂(例如但不限于水分、糖等)来实现。随后，可将饲料添加剂并入到动物饲料中以获得颗粒。然后可将颗粒递送至动物饲料系统和/或动物送料车；

·选择待并入到动物饲料颗粒中的饲料添加剂颗粒的特定比例。在这样的实际实施中，颗粒可包含具有第一量(菌落形成单位(colony-formingunit)，“cfu”)的活的非致病性细菌的第一颗粒群体和具有第二cfu的所述可存活的非致病性细菌的第二颗粒群体。

如本文中所体现和广泛描述的，本公开内容还涉及用于形成本文中描述的饲料添加剂的试剂盒(kit)。所述试剂盒包含：在第一个小瓶(vial)中的本文中所述的形成水胶体的多糖、在单独的第二小瓶中的本文中所述的大肠杆菌、在单独的第三小瓶中的本文中所述的不同于第一多糖的第二多糖，以及在单独的第四小瓶中的本文中所述的二糖。任选地，本文中所述的第二、第三和/或第四小瓶中的一种还可包含钙盐。在另一种选择中，钙盐可包含在单独的第五小瓶中。

本领域技术人员将容易理解，先前描述的试剂盒可包括存在于同一小瓶中的一种或更多种所列要素，其与同样被包含的那些相容。

在一个非限制性实施方案中，本文中描述的二糖包含蔗糖、海藻糖、或其组合。

在一个非限制性实施方案中，本文中描述的钙盐可包含乳酸钙。

如本文中所体现和广泛描述的，本公开内容还涉及用于制备动物饲料颗粒的方法，其包括：提供饲料添加剂和用于制备饲料颗粒的成分，所述饲料添加剂包含活的非致病性大肠杆菌；将成分和饲料添加剂造粒以获得动物饲料颗粒。

在一个非限制性实施方案中，提供饲料添加剂的步骤包括提供颗粒形式的饲料添加剂，其中所述颗粒具有：具有第一平均直径尺寸的第一颗粒群体和具有第二平均直径尺寸的第二颗粒群体。

如本文中所体现和广泛描述的，本公开内容还涉及用于形成本文中描述的饲料添加剂的方法。该方法包括提供包含以下的颗粒：第一多糖，其是形成水胶体的多糖；第二多糖，其不同于第一多糖；以及二糖，其包含蔗糖、海藻糖、或其组合；以及本文中所述的大肠杆菌。该方法还包括使颗粒干燥以获得≤0.3的水活度(aw)。

在一个非限制性实施方案中，提供颗粒的步骤包括使大肠杆菌与第一多糖混合以形成混合物；从混合物中形成颗粒；并使颗粒与包含蔗糖或海藻糖的保存溶液以及第二多糖接触。

在另一个非限制性实施方案中，提供颗粒的步骤包括使大肠杆菌与第一多糖和与包含蔗糖或海藻糖的保存溶液以及第二多糖混合以形成混合物；并且从混合物中形成颗粒。

在一个实施方案中，动物饲料颗粒用于被家禽、猪和牛中的任一种食用。

在本公开内容中描述并且不相互排斥的实施方案的所有特征可彼此组合。一个实施方案的要素可在其他实施方案中使用而无需另外提及。通过结合附图查看一些具体实施方案的以下描述，本发明的其他方面和特征对于本领域普通技术人员将变得明显。

附图说明

一些具体实施方案的详细描述在下文中参考附图提供，其中：

图1示出了根据本公开内容的一个实施方案制备细菌培养物的非限制性流程图。

图2示出了根据本公开内容的一个实施方案的干燥具有包埋的大肠杆菌的珠的非限制性流程图。

图3示出了根据本公开内容的一个实施方案的用于分配饲料添加剂的系统的非限制性图表。

图4示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s2、s3和s4对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图5示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s5、s6和s7对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图6示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s0、s8和s9对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图7示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s10、s11和s12对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图8示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s13、s14和s15对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图9示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1、s16、s17和s18对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图10示出了描述根据本公开内容的一个实施方案的保存溶液s1和s19对空气干燥后细菌生存力之影响的非限制性条形图。

图11a、11b和11c示出了图4至10中所示的原始数据。

图12示出了在24周的时间内干燥颗粒珠中cfu稳定性的非限制性图示。黑色和白色填充圆圈是使用相同制造工艺的两个不同批次生产的结果。

图13示出了描述用并入根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂的动物饲料(ip)和用不含饲料添加剂的动物饲料(“cp”)喂养猪7天后平均增重(kg)的非限制性条形图。误差棒(barerror)描述标准误(p＝0.044)。

图14示出了描述来自图13的猪7天期间的平均日增重(g/天)。误差棒描述标准误(p＝0.044)。

图15示出了根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂颗粒的截面。

图16示出了图15的饲料添加剂颗粒的变体的截面，其中颗粒具有孔。

图17示出了如何阅读包含表29和30中所示原始数据的后续图。随后的图是17a至17p。

在附图中，通过示例示出了一些实施方案。应该清楚地理解，说明书和附图仅用于举例说明某些实施方案的目的，并且有助于理解。权利要求的范围不应受本公开内容中阐述的实施方案的限制，而是应当被给予与作为整体的描述相一致的最宽的解释。

具体实施方式

本公开内容广泛地涉及包含大肠杆菌细菌的动物饲料颗粒，所述大肠杆菌的量足以向摄入该动物饲料的动物提供有益效果。

在一个实际实施中，动物饲料是动物饲料颗粒，其包含活的大肠杆菌细菌细菌。在本公开内容中，术语“活的”是指这样的概念，即尽管动物饲料中的细菌可以被认为处于非活动(休眠)状态，这些细菌可在将细菌暴露于某些条件(例如，足够的温度、湿度和/或氧气)时恢复到活动状态。

有利地，这种动物饲料颗粒的施用可需要动物生产者的最小处理和/或可不需要剂量制备。此外，与本文中所述的饲料相比，通过其他方式(例如，饮用水)的长期施用可对菌株的存活具有显著影响。

大肠杆菌(e.coli)是非芽孢形成细菌，并因此对苛刻条件的抗性低于产芽孢细菌。此外，目前在压力、温度和湿度条件方面的饲料造粒的工业实践旨在将病原体(例如大肠杆菌和沙门菌)控制至最低水平以降低污染风险。本申请出乎意料地涉及动物饲料颗粒，其包含大量的大肠杆菌，并且仍然适合于动物食用。换言之，本公开内容中描述的动物饲料颗粒包含非致病性大肠杆菌，其量足以为摄入该饲料的动物提供期望的益处，然而，动物饲料仍然适于在受控(最小化)的致病性大肠杆菌的水平下食用。

本公开内容的出乎意料至少在于，虽然在制备本公开内容中的颗粒饲料时仍然实施先前讨论的病原体控制条件由此控制病原体，但通过在进行造粒步骤之前，将期望的大肠杆菌菌株包埋到合适的饲料添加剂中，非致病性大肠杆菌的生存力得到充分保持。

本发明人出乎意料且意外地观察到，包含包埋在本文中所述的饲料添加剂中的活的非致病性大肠杆菌的动物饲料颗粒能够在延长的26周的给定时间段中在25℃下保持充足细菌cfu的生存力和功能性以用于其商业用途。

将大肠杆菌包埋在饲料添加剂中

在本领域中已经提出了将细菌(尽管是益生菌)并入到饲料添加剂中的实际实施。

例如，wo2011/094469描述了包含藻酸钠、寡糖(菊糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等)、二糖和水解蛋白质的混合物，其中藻酸钠/寡糖的重量比为1∶1-10。wo2013/142792描述了包含寡糖、二糖和多糖，以及包括水解动物或植物蛋白的蛋白质组分的组合物。这些文件中的每一个都描述了获得以干燥形式包封在饲料添加剂中的益生菌的相同程序：

·在第一步中，形成含有组合物和益生菌之混合物的冷冻珠(其中益生菌来自冷冻液体培养物或来自益生菌的商业化粉末形式)。通过将混合物的微滴浸入到液氮中获得冷冻珠，并将所得珠储存在-80℃。

·在第二步中，将冷冻珠在真空下干燥，直至珠达到小于0.3的水活度。

因此，这些文献中描述的包封程序将液氮中冷冻和随后干燥的苛刻条件组合。尽管存在组合物，其在这些文献中被教导为据称是干燥稳定化组合物，但是如用获得的0.73-0.90的cfulog损失所反映的，这种苛刻的条件对细菌的生存力造成影响(参见，例如，wo2011/094469中的图7和wo2013/142792中的图14)。因此，当使用液体细菌培养物作为原料时，这些文献中描述的方法和组合物未针对工业环境进行优化，其中cfulog损失可导致在经济上不太理想。

先前已经提出过细菌(尽管是益生菌)的其他实际保存和储存条件。

由于干燥期间的低温暴露，冷冻干燥(也称为冻干)通常用于细菌的保存和储存(rhodes，exploitationofmicroorganismsed.jones，dg，1993，第411-439页，london：chapman&hall)。然而，其具有显著降低生存力以及时间和能量密集的不期望特性。已经提出了保护剂，但是在冷冻干燥期间由给定添加剂提供的保护作用随着微生物物种而变化(fontdevaldez等，cryobiology，1983，20：560-566)。

空气干燥(例如用干化(desiccation))也已用于细菌的保存和储存。虽然真空干燥是与冷冻干燥相似的过程，但其在0-40℃下进行30分钟至数小时。该过程的优点是产品不冻结，因此降低了能量消耗和相关的经济影响。从产品的角度来看，避免了冻结损伤。然而，在低温或环境温度下，干化是缓慢的，需要额外的预防措施以避免污染，并且经常产生不令人满意的生存力(lievense等，advbiochemengbiotechnol.，1994，51：71-89)。

在形成水胶体的多糖基质(例如藻酸钙(calciumalginate，ca-alginate)珠)中包封细菌，也已被用于在广泛且不断增多的不同应用范围中保存和储存细菌(islam等，j.microbiol.biotechnol.，2010，20：1367-1377)。为了使细菌保持在代谢和生理学上的活性状态并由此获得期望的益处，已经建议向此类基质添加合适的保存剂制剂。保存剂制剂通常包含在合适的载体中的活性成分以及添加剂，所述添加剂有助于在储存、运输和位于目标区域期间使微生物细胞稳定化并且保护微生物细胞。

然而，新制剂的开发是具有挑战性的任务，并且并非所有制剂对给定细菌都有效(youg等，biotechnolbioeng.，2006年9月5日；95(1)：76-83)。此外，对于包封细菌的特别问题结果是，为了确保产品的适当保质期，必须在制备、储存和/或运输期间小心地使细菌对水分的暴露最小化。

本文中所述的物质组合物及其制备方法提供了饲料添加剂，其有助于保护活的大肠杆菌细菌(特别是当其由液体培养物制成时)免受：(1)制备饲料添加剂时进行的干燥条件，以及(2)对动物饲料造粒时使用的严苛的温度、湿度和压力条件。实际上，在本公开内容中获得的结果显示了在干燥步骤之后意外且出乎意料的cfu平均log损失，通常接近0.30。例如，小于0.70，或小于0.60，或小于0.50，或小于0.40，或小于0.30，或小于0.25，或小于0.20，或小于0.15，或小于0.10。

例如，在包埋到饲料添加剂中程序期间，活的大肠杆菌可维持颗粒的aw倍数降低(foldreduction)是至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.7，而没有显著的cfu损失，如本文稍后所述。

有利地，本文中描述的制备饲料添加剂的方法可在工业环境中实施，而没有先前已知程序的至少一些缺点。例如，在工业环境中，通常情况是大规模生产批次以或多或少的连续方式生产，其通常使细菌长时间地经受高温和/或高湿度，例如数小时至数天。本文中描述的程序足以保护非致病性大肠杆菌免受此类条件的影响，从而为所提出的期望结果提供足够的存活(即，足够的cfu)，尽管时间段延长，其中大肠杆菌没有处于对于长期存活而言理想的温度/湿度环境。

在实际实施中，用于制备动物饲料颗粒的方法可包括提供饲料添加剂和用于制备饲料颗粒的成分，其中饲料添加剂包含活的非致病性大肠杆菌。该方法然后还包括将所述成分和所述饲料添加剂造粒以获得动物饲料颗粒。造粒程序是本领域中已知的，因此这里不再进一步讨论。

在一个实施方案中，该方法还可包括提供颗粒形式的饲料添加剂。有利地，颗粒可具有不均匀的平均粒度群。例如，颗粒可包含具有第一平均直径尺寸的第一颗粒群体和具有第二平均直径尺寸的第二颗粒群体。用于获得具有给定平均直径尺寸之颗粒的程序(例如筛分或过滤)是本领域中已知的，并且这里将不再进一步讨论。在一个特别的实施方案中，饲料添加剂可包含经选择的第一群体量和第二群体量以获得＞1的第一/第二群体比值。在一个非限制性实施方案中，第一种颗粒平均尺寸为至少250微米，或至少500微米，或至少1mm。

在一个非限制性实施方案中，可将饲料添加剂切成期望的形状和尺寸，或压碎并碾磨成自由流动的粉末。饲料添加剂可使用湿法或干法团聚、制粒、压片、压实、造粒或本领域技术人员容易获得的任何其他种类的递送方法进一步加工。用于压碎、碾磨、研磨或粉碎的方法是本领域中公知的。例如，可使用锤磨机、空气磨机、冲击式磨机、喷射磨机、针磨机、wiley磨机或类似的碾磨装置。

饲料添加剂特征

图15示出了根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂颗粒1600的截面视图。

在图15中所示的具体实施方案中，颗粒1600包含其中包埋有大肠杆菌1520的基质1510。基质1510可包含涂层1550，其覆盖颗粒1600表面的至少一部分。涂层1550显示为具有厚度的变化，该厚度在一些涂层施加过程中可以是固有的。

参照图16，基质1510可包含孔。在一些实施方案中，颗粒可包含可用于制备基质的材料所固有的孔。在另一些实施方案中，颗粒可包含通过在制备颗粒时在混合物中注入空气/气体而制成的孔。在另一些实施方案中，由于两种概念的组合，颗粒可包含孔。有利地，由于空隙区域1530的存在，孔的存在可需要较少的材料来制造基质，和/或可提高成分向颗粒中的渗透。如图16中所示，涂层1550可覆盖界定孔的颗粒表面的至少一部分表面。

对于一些具体实施方案，涂层1550可或多或少地覆盖饲料添加剂颗粒1600的整个表面。

有利地，如本文中所述，将活的大肠杆菌包埋在基质中可在动物饲料或饲料添加剂制造期间使细菌对环境湿度、氧气和/或温度的暴露最小化。例如，当使用挤出机生产动物饲料颗粒时，通常在挤出期间使动物饲料成分暴露于相对高的压力、温度和湿度条件，从而当细菌不以某种方式受到保护时导致cfu损失。当细菌是芽孢形成细菌时(例如当使用典型的益生菌时)，不一定需要额外的保护。然而，在这种情况下，大肠杆菌通常对这种苛刻的挤出条件敏感，因此，将细菌包埋在本文中所述的基质中可有助于使由于暴露于此类苛刻挤出条件而导致的损害最小化，从而使cfu损失最小化。

作为补充或替代，如本文中所述将细菌包埋在基质中可有助于在储存/处理期间的细菌稳定性。实际上，在储存/处理期间细菌暴露于环境湿度、氧气和/或温度可引起细菌从非活动状态(休眠)转换为活动状态。除非控制这种暴露，否则这种转换可导致细菌不可量化且不受控制的生长，这将影响向摄入含有这种细菌的动物饲料的动物递送的有效剂量，从而影响预期结果的一致性。

作为补充或替代，如本文中所述将细菌包埋在基质中可在动物摄入后提供细菌从动物饲料中的受控释放，从而实现时间释放或定位释放细菌递送系统。

例如，当基质包含大部分不可被肠液或胃液消化的物质时，在细菌被基质屏蔽的同时保护细菌免受胃破坏。在一个非限制性实施方案中，基质可因此适于在到达合适的环境后(例如在肠中)释放细菌。在这样的实施方案中，基质可包含例如高直链淀粉和/或果胶的化合物，其在易被肠微生物群消化的同时大部分不可被肠或胃液消化，此时所递送的活细菌随后以其完整的形式被释放。因此，选择合适浓度的基质组分可在动物摄入后提供细菌从动物饲料中的受控释放。换言之，该实施方案可提供细菌的时间释放或位置释放。

在另一个实例中，基质可以是颗粒的形式，其中颗粒的尺寸可在动物摄入后提供细菌从动物饲料中的受控时间释放或位置释放。换言之，相对于较小尺寸的颗粒，较大尺寸的颗粒可在给定的胃液和/或肠环境中在较长时间后完全降解。因此可选择/定制基质的粒度，以便提供细菌从动物饲料中的受控时间释放或位置释放。在一个非限制性实施方案中，颗粒可具有小于包含其他的饲料颗粒的平均直径尺寸，例如小于2mm，或小于1mm等。在另一些实施方案中，基质可以是颗粒形式，其至少具有：具有第一颗粒平均尺寸的第一颗粒群体和具有第二颗粒平均尺寸的第二颗粒群体，其中第一与第二颗粒平均尺寸之间的尺寸比值大于1。在一个非限制性实施方案中，第一颗粒平均尺寸为至少250微米，或至少500微米，或至少1mm。

有利地，本文中所述的动物饲料颗粒可包含不均匀的饲料添加剂颗粒平均直径尺寸，使得饲料添加剂能够以受控且预定的方式释放细菌。例如，颗粒可包含不均匀的直径的饲料添加剂粒度，使得每种饲料添加剂颗粒在给定时间和/或给定的肠位置被有效消化，这取决于颗粒的实际平均直径尺寸。例如，颗粒状动物饲料可包含多种尺寸(例如0.1mm、0.5mm、1mm、2mm等)的饲料添加剂颗粒，只要颗粒小于动物饲料颗粒即可。本领域技术人员将容易理解，合适的饲料添加剂粒度的任意组合都意味着落入本公开内容的范围内。

作为补充或替代，将饲料添加剂与动物饲料结合，其中饲料添加剂是具有不均匀粒度分布的颗粒形式，使调节到达肠的细菌量并因此控制动物中的细菌释放成为可能。在摄入包含本文中所述的饲料添加剂的颗粒饲料后，颗粒饲料通过胃，在那里颗粒至少部分降解，并因此可至少部分地释放饲料添加剂。饲料添加剂有利地可包含保护细菌免受胃的酸性ph影响的要素。这在可对饲料添加剂中的细菌脱敏的动物中可以是特别有利的，因此可建议限制细菌的“脉冲型”递送(即，其中细菌的全部在短时间中释放)。

在实际实施中，本文中所述的饲料添加剂可用于定制并入到给定动物饲料中的细菌量。

例如，具有给定受控浓度的活的非致病性细菌的饲料添加剂可用于制备特定动物的动物饲料颗粒。例如，用于家禽的动物饲料颗粒将不一定需要与作为预期用于猪或牛的对比动物饲料颗粒相同量的活的非致病性细菌来获得有益效果。当制备与家禽饲料不同的猪饲料时，如果期望的话，技术人员可替代地使用相似的比例但使用包含给定的受控浓度的非致病性细菌的对猪具有特异性的饲料添加剂，而不是必须使用不同比例的饲料添加剂。

换言之，饲料添加剂可根据预期的动物规格制造，并且包含适合于预期动物的给定cfu/g量，即，根据“猪级别”、“牛级别”、“家禽级别”等。

或者，可使用相同的“级别”作为制备动物饲料颗粒的原料，但相反，当制备与家禽饲料不同的猪饲料时，可在饲料颗粒制造水平上通过使用不同比例的饲料添加剂进行动物规格定制。

作为补充或替代，具有给定受控浓度的非致病性细菌的饲料添加剂可用于制备用于特定动物的生长曲线的特定阶段的动物饲料颗粒。例如，用于猪的动物饲料颗粒可具有受控量的活细菌，其在断奶后阶段与随后的多个肥育阶段相比是不同的。

例如，在某些非限制性实施方案中，动物饲料颗粒可包含以下数量cfu/g的活细菌：至少10⁴，或至少10⁵，或至少10⁶，或至少10⁷，至少10⁸，或至少10⁹，或至少10¹¹。例如，动物饲料颗粒可包含1×10⁵至1×10¹¹cfu/g，或其中的任何值。例如，在动物饲料颗粒的制造过程中，通过并入提高量的饲料添加剂(其包含控制量的活细菌)或通过并入不同级别的饲料添加剂，可获得这样的不同数量的cfu/g。本领域技术人员将容易理解，在这种情况下，饲料添加剂的级别可对应于具有不同受控量活细菌的饲料添加剂。这样的给定动物饲料中细菌量的定制可在沿着链供应的任何位置进行，例如在颗粒珠生产地点、在动物饲料生产地点、在最终使用者地点等。

因此，读者还将容易理解，饲料添加剂包含合适量(cfu/g)的大肠杆菌菌株，以在动物饲料颗粒中实现先前描述的cfu/g。例如，饲料添加剂可包含至少1×10⁶cfu/g，或至少1×10⁷，或至少1×10⁸，或至少1×10⁹，或至少1×10¹⁰，或至少1×10¹¹等。

本文中描述的给定动物饲料中细菌量的定制可用于饲养用于肉类生产的动物的情况中，例如在养猪业中，农场通常使用具有不同饲料阶段(例如，2至4个阶段)的饲料计划喂养动物，其中第一饲料(即，第一断奶饲料)可给予约一周至两周的时间。在这样的情况下，在给定动物饲料中具有这样定制的细菌量可以是可用的，以便在动物饲料中获得不同水平的细菌以用于不同的饲料阶段。例如，在饲料添加剂中所包含的大肠杆菌应对猪的特定肠道应激的情况下，在工业上可用的是定制动物饲料以在其中包含特定水平的细菌用于第一断奶和第一肥育饲料阶段，因为这两个阶段代表猪的两个肠道应激窗。

大肠杆菌细菌

在一个非限制性实施方案中，本文中描述的非致病性大肠杆菌(e.coli)包含任何重组或野生大肠杆菌菌株，或其任何混合物。

在一个非限制性实施方案中，大肠杆菌菌株是2005年1月21日以登记号idac210105-01保藏于加拿大国际保藏机构(internationaldepositoryauthorityofcanada，idac)的菌株，其描述于美国专利7,981,411(通过引用整体并入本文)中，或2013年6月20日以登记号200613-01保藏在加拿大国际保藏机构(idac)的菌株，其描述于美国专利9,453,195(通过引用整体并入本文)中，或其组合。

idac是微生物专利保管机构，已于1996年9月21日由加拿大允许加入《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(布达佩斯条约)》(budapesttreatyontheinternationalrecognitionofthedepositofmicro-organismsforthepurposesofpatentprocedure(thebudapesttreaty))。此外，对《加拿大专利法》和《专利法则》进行修正以确保符合于1996年10月1日生效的《布达佩斯条约》。idac的实际地址为：1015arlingtonstreet，winnipeg，canada，r3e3r2。

本领域技术人员将容易认识到，大肠杆菌在包埋在基质中之前可以是干燥、新鲜或冷冻形式。这种形式可直接从培养物形式获得(即，在培养基存在下的菌株)，或者可在一个或更多个加工步骤之后获得，例如从培养基中去除一种或更多种要素或用另外的一种或更多种要素(例如，适用于冷冻保存或任何其他后续加工步骤)从培养基中替换一种或更多种要素。

适用于冷冻保存的一种或更多种要素的实例可满足以下特征中的至少一个：高度水溶性、渗透到细胞内、具有低毒性、非反应性、并且在高浓度下不沉淀。例如，适合于冷冻保存的一种或更多种要素可包括例如但不限于甘油、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)。

基质

基质包含形成水胶体的多糖。数种形成水胶体的多糖适合于如本文中所述单独使用或以其任意组合使用。

高直链淀粉是合适的形成水胶体的多糖的实例，其能够在淀粉颗粒在沸水中水合后形成坚固的凝胶，借助于高剪切混合器分散颗粒，并随后将溶液冷却至约0-10℃。凝胶的坚固性和强度取决于溶液中淀粉的浓度，其中最大可工作浓度高至10％w/v。

果胶是合适的形成水胶体的多糖的另一个实例，其表现与高直链淀粉非常相似。果胶具有另外的优点，因为通过添加二价阳离子(例如ca²⁺)还可提高果胶凝胶基质的强度，所述二价阳离子在糖聚合物的羧基之间形成桥。

藻酸盐是合适的形成水胶体的多糖的另一合适实例，其可通过与二价阳离子交联形成牢固的凝胶基质。通过将藻酸盐第一多糖与双阳离子(例如ca²⁺)内部交联，例如通过将细线、绳或基本上球形的珠形式的藻酸盐挤出到ca²⁺浴中，可使藻酸盐硬化成坚固的凝胶基质。藻酸盐在与ca²⁺相互作用时硬化。制备本领域中已知基质的替代方法包括将混合物喷射雾化到含ca²⁺浴中、基于乳液的技术以及流化床团聚和涂覆。

在一个非限制性实施方案中，形成水胶体的多糖以0.1％至20％的总干物质的重量百分比存在于基质中。在一个非限制性实施方案中，形成水胶体的多糖以以下值的总干物质的重量百分比存在于基质中：0.1％至19％，或0.1％至18％，或0.1％至17％，或0.1％至16％，或0.1％至15％，或0.1％至14％，或0.1％至13％，或0.1％至12％，或1％至12％，包括其中的任意值。

在一个实施方案中，多糖是第一多糖，并且基质还包含不同于第一多糖的第二多糖。任选地，基质可包含二糖。

作为替代或补充，基质可包含布置在基质表面的至少一部分上的涂层。涂层可包含不同于第一多糖的第二多糖。任选地，涂层可包含二糖。

在一个非限制性实施方案中，二糖和第二多糖以1∶10至10∶1的二糖/第二多糖(wt.％/wt.％)的比例存在于涂层和/或基质中。在另一个非限制性实施方案中，该比例为9∶1、9∶2、9∶3、9∶4、9∶5、9∶6、9∶7、9∶8、8∶1、8∶2、8∶3、8∶4、8∶5、8∶6、8∶7、7∶1、7∶2、7∶3∶7、7∶5、7∶6、6∶1、6∶2、6∶3、6∶4、6∶5、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、4∶1、4∶2、4∶3、3∶1、3∶2、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8、2∶9、3∶4、3∶5、3∶6、3∶7、3∶8、3∶9、4∶5、4∶6、4∶7、4∶8、4∶9、5∶6、5∶7、5∶8、5∶9、6∶7、6∶8、6∶9、7∶8、7∶9或8∶9，包括其间的任意比例值。

在另一个非限制性实施方案中，二糖/第二多糖的比值(wt.％/wt.％)小于10，或更优选小于5。在一个非限制性实施方案中，二糖/第二多糖的比例(wt.％/wt.％)为约1。

在一个非限制性实施方案中，二糖以以下值存在于涂层和/或基质中(以总干物质的重量百分比计)：0.1％至90％，或0.1％至75％，或0.1％至50％，或0.1％至35％，或0.1％至20％，或0.1％至15％，或0.1％至10％，包括其中的任意值。

在一个非限制性实施方案中，二糖包含蔗糖。

在一个非限制性实施方案中，二糖包含海藻糖。

在一个非限制性实施方案中，二糖包含蔗糖和海藻糖。

在一个非限制性实施方案中，第二多糖包含麦芽糖糊精。

在一个非限制性实施方案中，第二多糖包含葡聚糖。

在一个非限制性实施方案中，第二多糖包含麦芽糖糊精和葡聚糖。

在一个非限制性实施方案中，葡聚糖的分子量为20至70kda。

在一个非限制性实施方案中，饲料添加剂(即，基质和/或涂层)还包含氨基酸的盐。

在一个非限制性实施方案中，氨基酸的盐包含l-谷氨酸的盐。

在一个非限制性实施方案中，盐是l-谷氨酸的钠盐。

本文中所述的基质在退出本文中所述的干燥步骤后具有aw≤0.3的水活度(“aw”)，例如0.04≤aw≤0.3、0.04≤aw≤2.5、0.04≤aw≤2.0、0.04≤aw≤1.5等。在本公开内容的上下文中，“水活度”或“aw”是指水的可用性并且表示系统中水的能量状态。它通常定义为样品上方的水的蒸气压除以相同温度下的纯水的蒸气压。水活度可根据本领域中已知的材料和程序测量，例如，使用aqualabwateractivitymeter4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)。干燥可包含例如喷雾干燥、流化床干燥、冻干、真空干燥等的步骤。干燥步骤的一些非限制性实际实施将在本文中稍后进一步描述。

动物饲料颗粒覆盖层

在另一个实际实施中，动物饲料颗粒还可包含覆盖动物饲料颗粒表面的至少一部分的层，其中该层包含饲料添加剂，以形成经涂覆的动物饲料颗粒。动物饲料颗粒的涂层可根据本领域中已知的方法进行，例如喷雾干燥、喷雾冷却、喷雾雾化、流化床团聚和基于乳液的技术。可通过使未经涂覆的动物饲料颗粒经受翻滚动作来实现涂层在未经涂覆的动物饲料颗粒上的完全分散。

在一些实施方案中，在丸粒中存在另外的大肠杆菌来源(即，外层中的第一来源，以及并入到颗粒中的第二来源)可提供大肠杆菌的时间释放或位置特定性递送。实际上，外层可用以给定速率溶解或在沿着动物胃肠道的给定位置溶解的成分配制，其可与并入到动物饲料中的大肠杆菌的递送速率不同。

在一些实施方案中，动物饲料颗粒的涂层还可增强针对湿度和酸败的保护并且延长动物饲料颗粒的保质期。动物饲料颗粒的涂层还可增强针对污染物的保护。

在另一些实施方案中，动物饲料颗粒的涂层可改善动物饲料颗粒的适口性，这进一步降低了向颗粒添加适口性增强剂的需要。动物饲料颗粒的涂层还可以掩盖强烈的气味和味道以进一步提高动物对经涂覆的动物饲料颗粒的摄入。

包装

在一个实际实施中，本公开内容涉及具有湿度控制屏障的包装，所述湿度控制屏障足以控制其中的内容物对环境湿度的暴露。换言之，包装可控制本公开内容的活的非致病性细菌(即，在饲料添加剂和/或饲料颗粒中)对环境湿度的暴露。具有湿度控制屏障的有利效果是包含在内容物中的细菌可基本上保持在非活性状态，从而显著延长饲料添加剂和/或饲料颗粒的可用保质期。

在实际实施中，所述包装还可包含单独的隔间，在至少一个隔间中，其配置成用于储存并入到饲料颗粒中的饲料添加剂，且在至少另一个隔间中，其配置成用于储存湿度控制元件。

在一个非限制性实施方案中，所述包装可包含内衬，所述内衬包含聚乙烯、聚氨酯或任何其他合适的与饲料相容的聚合物。衬里可以是单层或多层材料。不希望受任何理论的束缚，据信衬里至少可提供对泄漏、湿度、氧气、污染和紫外线(uv)辐射的保护，并确保饲料添加剂和/或饲料颗粒的适当保质期。

在实际实施中，包装可包含通过任何适当的密封机构在上端处的密封件。在上端处的密封件的开口可提供用于分配饲料添加剂和/或饲料颗粒的出口。

在另一个实际实施中，所述包装可包含单独的隔间，在至少一个隔间中，其配置成用于储存饲料添加剂，在至少另一个隔间中，其配置成用于储存饲料颗粒成分。

在一个非限制性实施方案中，用于储存饲料添加剂的至少一个隔间和用于储存饲料颗粒成分的至少另一个隔间可配置成防止其间的流体连通，即，使得它们不互连。不存在互连可防止饲料颗粒成分和饲料添加剂的过早混合。

在一个非限制性实施方案中，用于储存饲料添加剂的至少一个隔间可配置成储存一定量的饲料添加剂(即相当于活细菌的cfu数)，其适合于添加至至少另一个隔间的整个内容物用于储存饲料颗粒成分。根据该实施方案，简化了具有饲料添加剂的饲料颗粒的制备，因为不需要使用者计算添加至颗粒饲料的饲料添加剂的量。如先前所讨论的，饲料添加剂中cfu的量可根据不同级别定制，即可根据具体动物应用而变化。在这样的应用中，用户可选择请求已在饲料添加剂中具有合适量的cfu的特定“猪”包装以获得“猪”饲料颗粒，而不是必须计算添加至颗粒饲料的饲料添加剂的量。作为非限制性实例，具有数量λ的饲料添加剂的包装可适用于制备用于断奶后仔猪的饲料颗粒，而具有量β的饲料添加剂的包装可适用于肥育阶段的仔猪的饲料颗粒的制备。

在另一些实施方案中，所述包装可进一步包含另外的隔间，所述隔间配置成储存不同的饲料添加剂或多种量的饲料添加剂。

有利地，包装可用“最迟使用”或“最迟销售”日期标记，以确保在“最迟使用”或“最迟销售”日期时期望的最小量的cfu(即，期望的cfu/g)。实际上，技术人员例如通过考虑给定时间段之后饲料添加剂的预期湿度/温度/氧气暴露，能够推断在给定时间段之后剩余的可用量的cfu。

用于分配饲料添加剂的系统

图3示出了用于分配本文中所述的饲料添加剂的系统1000。系统1000包含若干单独的组件，其包括至少一个遥控单元1100、配置成储存饲料添加剂1200的料斗(hopper)、支架(stand)1300、密封机构1400和分配机构1500。

在一个非限制性实施方案中，遥控单元1100包含计算机并且可容纳在机柜(cabinet)(未示出)内，该机柜可通过数据网络(未示出)牢固地连接到支架1300。在实际实施中，数据网络可以是任何合适的数据网络，包括但不限于公用网络(例如，因特网)、专用网络(例如，lan或wan)、有线网络(例如，以太网网络)、无线网络(例如，802.11网络或wi-fi网络)、蜂窝网络(cellularnetwork)(例如，长期演进(longtermevolution，lte)网络)、路由器(router)、集线器(hub)、交换机、服务器计算机和/或其任意组合。

料斗1200可在上端处开口，以便配置成接收饲料添加剂。料斗1200可在下端处连接至密封机构1400。密封机构1400可在关闭位置(其中料斗1200的内部不与分配机构1500连通)(如图3中所示)与打开位置(其中料斗1200的内部与分配机构1500连通(未示出))之间移动。

在一个非限制性实施方案中，分配机构1500可包含具有限定网格尺寸的可移除网格。在一个优选的实施方案中，选择网格尺寸，使得仅特定直径的饲料添加剂珠通过分配机构分配。作为一些非限制性实例，可选择网格尺寸，使得仅至多250微米、至多500微米、至多1mm或至多2mm的珠可通过分配机构分配。取决于源饲料添加剂的珠直径分布，分配机构可用于分配具有均匀或不均匀直径的珠。

在另一些实施方案中，分配机构1500可包含多个彼此叠置的具有不同网格尺寸的可移除网格，使得当使用具有不均匀珠尺寸分布的饲料添加剂作为来源时，分配机构可有利地用于分配具有均匀直径的饲料添加剂珠。即，可将具有不同珠直径的数种饲料添加剂混合并装载在料斗1200中，以便在料斗1200中产生具有不均匀珠尺寸分布的饲料添加剂。使用适当的网孔去除顺序，本发明的系统可方便地用于从不均匀的珠尺寸分布中分配第一部分的饲料添加剂和第二部分的饲料添加剂，所述第一部分的饲料添加剂具有第一珠直径并因此具有量x的第一cfu的活的非致病性细菌，并且所述第二部分的饲料添加剂具有第二珠直径并因此具有量y的第二cfu的活的非致病性细菌。因此，系统1000可用于获得在本文其他地方讨论的不同“级别”的饲料添加剂/饲料颗粒。简言之，通过选择随后分配用于制备颗粒的特定粒度量比值，可为给定的应用(例如，动物物种和/或生长期)选择和提供(即，定制)一定量的cfu。

在一个非限制性实施方案中，料斗1200优选地由不锈钢制成。

在一个非限制性实施方案中，料斗1200还可在其内部包含混合装置(未示出)，以防止在料斗1200的下端处堵塞。在另一些实施方案中，可用液体(例如水)分配饲料添加剂以防止系统堵塞。

本领域技术人员将容易理解，在不背离本发明的情况下，另一些分配器系统可以是可适用的。

实施例

在以下实施例中，与保存溶液s1一起测试了三种保存溶液。测试一式三份地进行，根据下式计算一个标准差：

其中n：样本数，且样本群体的平均值。

在以下每个实施例中，通过根据本领域中已知的方案测量菌落形成单位(cfu)的数量来评估细菌生存力。

以下实施例中使用的保存溶液示于表1中。

表1

¹x意指不存在

²n/a意指不适用

1.实施例1

本实施例描述了根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂的制备。在本实施例中，细菌被包封在由藻酸钙(alginate-calcium)制成的基质中。藻酸钙基质是颗粒形式，根据应用可具有不均匀或均匀的平均直径尺寸。因为珠是用液体细菌培养物作为原料制成的，所以本领域技术人员将理解，本文中所述的干燥大肠杆菌珠的最终组合物可包含细菌培养基的组分。

a.大肠杆菌培养

参照图1，在第一步骤100中在非动物来源的胰蛋白酶大豆琼脂上培养大肠杆菌菌株。然后在第二步骤200中使用六(6)个分离的菌落在37℃下在30ml非动物来源的胰蛋白酶大豆培养液(trypticsoybroth，tsb)(对于1ltsb：20g大豆蛋白胨a3sc-(organotechnie)，2.5g无水葡萄糖usp-(jtbaker)，5g氯化钠usp-(j.t.baker)和2.5g磷酸氢二钾usp-(fisherchemical))中以200rpm搅拌2小时以培养大肠杆菌菌株。

将得到的培养物1在tsb中稀释10倍，并随后在第三步骤300中在37℃下在100ml非动物来源的tsb中以200rpm搅拌2小时以培养大肠杆菌菌株。将得到的培养物2在tsb中稀释10倍，并随后在第四步400中在37℃下在1l非动物来源的tsb中以200rpm搅拌5小时以培养大肠杆菌菌株。然后将得到的培养物3用于将大肠杆菌包埋在基质中。本文中描述的培养方案的变化和修正是可能的，并且对于本领域技术人员而言根据本教导将变得明显。例如，非致病性大肠杆菌也可根据本领域中已知的方案在厌氧条件下培养(son&taylor，curr.protoc.microbiol.，2012，27：5a.4.1-5a.4.9)。在制备后续实施例的珠时，使用于2005年1月21日以保藏号idac210105-01保藏于加拿大国际保藏机构(idac)的非致病性大肠杆菌菌株。

b.基质制备

将bacto^tm蛋白胨(1.5g，bd，mississauga，canada)与1.5l加热的水混合以获得混合物。在用磁棒以360rpm混合的同时，将藻酸盐(30gdupont^tmdanisco，mississauga，canada)缓慢添加至混合物。在约3小时内获得藻酸盐的完全溶解以获得2％藻酸盐(rn/v)溶液。然后将包含磁棒的溶液在标准条件下高压灭菌。本文中描述的基质制备方案的变化和修正是可能的，并且对于本领域技术人员而言根据本教导将变得明显。

c.将大肠杆菌包埋在基质中

在与磁棒混合的同时，向高经压灭菌的基质溶液(1.5l)按顺序添加以下物质以获得浆液：1l非动物来源的tsb，以及参照图1，0.5l所得的大肠杆菌培养物3。

使用改进自thermoscientific^tmreacti-vap^tm蒸发器的9出口注射器系统，将浆液(3l)挤出到聚合浴(在水中的300mmcacl2，0.1wt./v.％bacto^tm胰蛋白胨，0.1wt./v.％bacto^tm蛋白胨和0.05wt./v.％gbacto^tm酵母)中以形成珠。在注入浆液的同时轻轻搅拌浴。使基质珠交联约30分钟，并随后收获所得的硬化珠。本文中描述的包埋的方案的变化和修正是可能的，并且对于本领域技术人员而言根据本教导将变得明显。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠，并随后将半干燥珠置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时以获得干燥珠。

本发明人出乎意料且意外地观察到，在干燥之前将包埋的大肠杆菌在保存溶液中孵育，同时温和搅拌约20分钟，显著降低了干燥步骤期间细菌的损失，导致干燥珠的形成。

d.包埋的大肠杆菌的干燥和测试

对于每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将基质中包埋有大肠杆菌的珠置于保存溶液s1、保存溶液s2、保存溶液s3或保存溶液s4中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3之水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果显示在图4中。保存溶液s4显示归一化的平均生存力损失为0.32，同时维持水活度为0.142±0.004。

实施例1的结果汇编列于表2和3中。这些结果表明，保存溶液s1和s4的要素对包埋在干燥基质中的大肠杆菌的生存力及其对于干燥过程700的抗性具有显著影响。

表2

表3

e.将干燥的包埋的大肠杆菌并入到动物饲料中(“造粒”)

用于将干燥基质并入到动物饲料中的方案(例如以饲料添加剂的形式)是本领域中已知的。这样做的举例说明性实例可例如通过将500g至1000g干燥基质珠并入到一吨(atonof)动物饲料中来完成。如果期望的话，饲料还可包含适合量的灭活酵母产品。例如，包含包埋的大肠杆菌的干燥基质珠(即，饲料添加剂)可在均化槽中与所有其他成分的至少一部分混合。优选地，在造粒过程期间将混合物连续混合。然后将混合的材料向挤出机泵送。

当蒸汽将要进入挤出机时或在位于挤出机内的隔间内时，蒸汽被施加在混合材料上(即，蒸汽调理)(即，因此，混合物的温度在该阶段提高)。典型的温度值可在约70℃至约90℃的范围内变化。在混合物在挤出机内通过期间，将合适的压力施加到混合物上。典型的压力值可在约20psig至约80psig的范围内变化。然后将形成的颗粒从挤出机中排出到冷却槽(coolingtank)中(迅速温度降低至30-40℃，随后再次冷却以达到环境温度)。然后可将包含饲料添加剂(包含包埋的大肠杆菌的基质)的颗粒饲料储存在例如袋/容器中，如下面进一步描述的。本文中所述的造粒方案的变化和修正是可能的，并且对于本领域技术人员而言根据本教导将变得明显。

2.实施例2

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s5、保存溶液s6或保存溶液s7中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果显示在图5中。保存溶液s7显示归一化的平均生存力损失为0.38，同时维持水活度为0.298±0.013。

实施例2的结果的汇编列于表4和5中。这些结果表明，保存溶液s7的要素对包埋在干燥基质中的大肠杆菌的生存力及其对干燥过程700的抗性提供了显著的保护作用。

表4

表5

3.实施例3

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s0、保存溶液s8或保存溶液s9中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(7s0)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果如图6中所示。

实施例3的结果汇编列于表6和7中。

表6

表7

4.实施例4

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s10、保存溶液s11或保存溶液s12中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果显示在图7中。保存溶液s7显示归一化的平均生存力损失为0.58。

实施例4的结果汇编列于表8和9中。

表8

表9

5.实施例5

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s13、保存溶液s14或保存溶液s15中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果显示在图8中。保存溶液s7显示归一化的平均生存力损失为0.35。

实施例5的结果汇编列于表10和11中。

表10

表11

6.实施例6

对于每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s16、保存溶液s17或保存溶液s18中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果如图9中所示。

实施例6的结果汇编列于表12和13中。

表12

表13

7.实施例7

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。参照图2，在第一步骤500中，将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1或保存溶液s19中，同时温和搅拌约20分钟。在每种情况下，在浸泡在保存溶液中后进行总cfu550的测定。在第二步骤600中，将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。在每种情况下，使用aqualab水分活度仪4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)对半干燥珠进行水活度aw650的测量。在第三步骤700中，将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。根据本公开内容的一个实施方案，干燥过程800包括至少两个步骤：步骤600，其包括在室温下将珠置于空气干燥器中24小时并获得半干燥珠，以及步骤700，其包括将半干珠置于干燥器中64小时以获得干燥珠。在每种情况下，对干燥珠进行总cfu750的测定和水aw760的测量。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算aw倍数降低：

在每种情况下，并参照图2，根据以下计算生存力损失(cfulog损失)：

cfu损失＝log10(550)-log10(750)

在每种情况下，计算相对于用保存溶液s1获得之结果的平均生存力损失和归一化平均生存力损失。

结果如图10中所示。

实施例7的结果汇编列于表14和15中。

表14

表15

8.实施例8

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s2、保存溶液s3和保存溶液s4中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例8的结果显示在表16中，其中当在4℃下储存时所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表16

9.实施例9

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s5、保存溶液s6和保存溶液s7中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例9的结果显示在表17中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表17

10.实施例10

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s0、保存溶液s8和保存溶液s9中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例10的结果显示在表18中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表18

11.实施例11

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s10、保存溶液s11和保存溶液s12中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例11的结果显示在表19中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表19

12.实施例12

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s13、保存溶液s14和保存溶液s15中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例12的结果显示在表20中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表20

13.实施例13

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1、保存溶液s16、保存溶液s17和保存溶液s18中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

实施例13的结果显示在表21中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表21

14.实施例14

对于此处测试的每种保存溶液，干燥和测试至少一式三份地进行。将如实施例1中制备的珠置于保存溶液s1或保存溶液s19中，同时温和搅拌约20分钟。将珠随后在室温下在空气干燥器中的盘式干燥器上放置约24小时以获得半干燥珠。将半干燥珠随后置于吹入干燥和经过滤空气的干燥器中约64小时。获得具有≤0.3的水活度aw的干燥珠。

在每种情况下，通过测量干燥珠的cfu/g，在4℃的储存条件下在四(4)周的时间中测试菌株生存力。至少一式三份地进行测试，并计算一个标准差。

结果显示在表22中，当在4℃下储存时，所测试的所有保存溶液在至少4周期间提供了饲料添加剂菌株稳定性。

表22

15.实施例15

该实施例描述了根据本公开内容的一个实施方案制备饲料添加剂的变体方法。在该实施例中，根据两种不同的生产方法，即如实施例1中所述的6步过程或如下所述的4步过程，将细菌包封在由藻酸钙制成的基质中。藻酸钙基质是颗粒形式，其根据应用可具有不均匀或均匀的平均直径尺寸。因为珠是用液体细菌培养物作为原料制成的，所以本领域技术人员将理解，本文中所述的干燥大肠杆菌珠的最终组合物可包含细菌培养基的组分。

6步过程包括以下步骤：

·步骤1：大肠杆菌培养

·步骤2：制备细菌/藻酸盐浆液

·步骤3：珠形成和聚合

·步骤4：珠洗涤

·步骤5：与保存溶液接触

·步骤6：干燥

4步过程包括以下步骤：

·步骤1：大肠杆菌培养

·步骤2：制备细菌/藻酸盐浆液

·步骤3：珠形成和聚合

·步骤6：干燥

a.大肠杆菌培养

在该实施例中，如实施例1中那样制备大肠杆菌菌株。

然后将所得培养物在4℃下保持14至18小时而不搅拌，然后用于生产饲料添加剂或在-80℃下冷冻。在冷冻之前，将一份培养物与一份保存溶液和一份新鲜培养基(即，比例为1∶1∶1)混合。保存溶液包含15wt/v％的麦芽糖糊精，21wt/v％的蔗糖和3wt/v％的l-谷氨酸单钠。

b.将大肠杆菌包埋在基质中

在以下段落中，通过首先制备藻酸盐/细菌浆液并随后由其形成颗粒，将大肠杆菌包埋在基质中。描述了两种变体，6步过程和4步过程。

6步过程

将1份细菌培养物(例如，500ml)与2份培养基(例如，1l)和3份藻酸盐溶液(2wt/v％alginatefd155，0.1wt/v％bacto^tm蛋白胨)(例如，1.5l)共混以获得浆液。

然后使藻酸盐-细菌培养物浆液通过容纳27针(20g，1/2英寸)的系统泵送以形成颗粒珠，其速度为允许液体逐滴落入含有12升氯化钙聚合溶液(300mmcacl2，0.1wt/v％bacto^tm胰蛋白胨，0.1wt/v％bacto^tm蛋白胨和0.05wt/v％gbacto^tm酵母)的18l槽中，该系统使用三个9端口thermoscientific^tmreacti-vap^tm蒸发器进行改进。缓慢搅拌聚合溶液以确保珠不会塌陷。一旦将整个藻酸盐-培养物浆液转移到聚合溶液中，在缓慢搅拌下使珠在溶液中再保持30分钟，以完成聚合过程。

聚合后，将颗粒珠从聚合溶液中排出并在洗涤溶液(50mmcacl2)中浸泡10分钟。

将珠排干，称重并在持续20分钟的搅拌下以1ml溶液/克珠的比例浸泡在保存溶液(10wt/v％葡聚糖40，14wt/v％蔗糖，2wt/v％l-谷氨酸单钠)中。最后，将珠排干并干燥。

还使用相同的方法(但仅在浸泡溶液中使用14wt/v％的蔗糖)进行另外的实验，具有类似的结果。

四步过程

将1份细菌培养物(例如，500ml)与1份保存溶液(15wt/v％麦芽糖糊精，21wt/v％蔗糖，3wt/v％l-谷氨酸单钠)(例如，500ml)、1份培养基(例如，500ml)和3份藻酸盐溶液(2wt/v％alginatefd155，0.1wt/v％bacto^tm蛋白胨)(例如，1.5l)共混，以获得浆液。

然后使藻酸盐-细菌培养物浆液通过容纳27针(20g，1/2英寸)的系统泵送以形成颗粒珠，其速度为允许液体逐滴落入含有12升氯化钙聚合溶液(5wt/v％乳酸钙)的18l槽中，该系统使用三个9端口thermoscientific^tmreacti-vap^tm蒸发器进行调整。缓慢搅拌聚合溶液以确保珠不会塌陷。一旦将整个藻酸盐-培养物浆液转移到聚合溶液中，在缓慢搅拌下使珠在溶液中再保持30分钟至4小时，以完成聚合过程。观察到粉末状含钙残余物在珠表面的至少一部分上形成颗粒状涂层。

c.包埋的大肠杆菌的干燥和测试

将颗粒珠置于铝盘中并分散以获得深度≤1.5cm的珠层。然后如实施例1那样将颗粒珠空气干燥。干燥之前和之后的颗粒珠重量用于计算干燥损失。

实施例15的结果汇编在下表中列出。这些结果表明，六(6)步过程和四(4)步过程对包埋在干燥基质中的大肠杆菌的生存力及其对干燥过程的抗性提供了显著作用。

开发了4步过程以优化6步过程，节省材料并缩短加工时间。关键要求是确保细菌在干燥步骤中存活。为了实现这一点，在6步过程中，在将珠干燥之前使颗粒与保存溶液接触。

本发明人测试了第一原型4步过程。在该原型4步过程中，发明人测试了是否有可能删除与保存溶液接触的步骤，并且作为代替，在珠形成和聚合之前将保存溶液添加细菌/藻酸盐浆液中。用两种不同的保存溶液测试该原型4步过程：含有葡聚糖40的第一种保存溶液和含有麦芽糖糊精(代替葡聚糖40)的第二种保存溶液。本发明人还测试了在氯化钙中聚合后是否可删除洗涤步骤。

表23a中报告的结果显示，在第一原型4步过程中，删除洗涤步骤导致干燥珠中显著的cfu损失。

在使洗涤步骤保持得到更好结果的同时，干燥颗粒珠中的cfu计数仍然低于6步过程中的cfu计数超过1log10(平均3.9×10⁸对5.9×10⁹cfu/g)。用葡聚糖40测试的第一个原型4步过程给出了与麦芽糖糊精相似的结果。由第一原型4步过程产生的珠之间的一个主要差异是干燥过程的程度。实际上，在干燥步骤之前删除洗涤/接触保存剂的步骤导致颗粒珠在干燥时损失其质量的92-95％。将其与过程包括洗涤/与保存剂接触的步骤的情况进行对比，且所得颗粒珠损失其质量的85％(表23)。

表23：根据本公开内容的一个实施方案，用6步过程获得的珠和用4步过程获得的珠的活大肠杆菌计数(cfu/g干燥珠)和干燥后珠重量损失的结果。

表23a：根据本公开内容的一个实施方案，通过4步过程获得的珠的活大肠杆菌计数(cfu/g干燥珠)和干燥后珠重量损失的结果，并评价在干燥步骤之前进行洗涤步骤的影响。

在工业环境中，聚合过程和颗粒珠与聚合溶液接触的时间可在制造过程中极大地变化。实际上，处理路径可基于不同的条件(例如所使用的工业机械和批量尺寸)而或多或少地变化，从而影响处理时间，包括颗粒珠与聚合溶液接触的时间。在特定的实际实施中，这种可变性可影响制备浆液的步骤和从针上滴下浆液以形成颗粒珠的步骤之间所需的时间。

在第二原型4步骤方法中，发明人测试了使用不同聚合溶液的效果：第一聚合溶液包含氯化钙，而第二聚合溶液包含乳酸钙。本发明人还测试了与聚合溶液的多种接触时间，即1小时、3小时或4小时。

表24中报告的结果表明，在第二原型4步过程中，与氯化钙相比，乳酸钙提供了优异的结果，表明当降低方法中的步骤数时，后者比前者更合适。当聚合时间延长到3小时，即延长与聚合溶液的接触时间时，这种差异更显著。

表24：用于评价在或不在蔗糖溶液中的浸泡步骤(步骤5)之后不同的聚合溶液(步骤3)和聚合时间的活的大肠杆菌计数(cfu/g干燥珠)和干燥后珠重量损失结果。

发明人还测试了当将与乳酸钙聚合溶液的接触时间从1小时延长至4小时时，颗粒珠中细菌的生存力。表25中报告的结果表明，尽管将接触时间延长至4小时，但在该步骤期间没有生存力损失。

表25：用于评价在25℃下在4小时中乳酸钙聚合溶液中细菌的生存力的活的大肠杆菌计数结果(cfu/g珠)。

本发明人还测试了浆液(含有藻酸盐、细菌培养物和保存溶液的混合物)中的细菌的生存力，以确定当与浆液要素接触时细菌是否会在环境室条件下长时间存活。进行了两种测定；第一种测定包含浆液中的保存溶液，而第二种测定不包含浆液中的保存溶液。如先前所述制备浆液并在25℃下搅拌48小时的时间。表26中报告的结果表明，与浆液中没有保存溶液时相比，当细菌与浆液中的保存溶液接触时，48小时后细菌cfu没有损失。

表26：用于评价在25℃下在48小时时间中，在含有用麦芽糖糊精制成的保存剂的藻酸盐-细菌浆液和不含这种保存溶液的对照中细菌生存力的活大肠杆菌计数结果(cfu/ml浆液)。

在所提出的4步过程中的聚合步骤之前将细菌培养物与保存溶液混合导致相对于所提出的6步过程的步骤数量降低，因此，降低了工业生产时间、材料成本和/或加快上市速度。作为补充或替代，在一些情况下，当需要冷冻大肠杆菌培养物(例如，在-20℃或-80℃)用于储存和/或运输目的时，实施4步过程也是有利的，因此，还在沿着生产链提供方便的库存管理应用。

实际上，本发明人分析了在-80℃下冷冻，在20℃下放置24小时，然后解冻并在4℃下保持14天后细菌的生存力。在大规模工业过程中通常预期这些类型的条件。结果显示在表28中，并且表明当冷冻介质包含保存溶液时，细菌生存力不受冻融过程的显著影响，即，生存力在4℃下在14天时间中缓慢下降，具有的最终损失为0.35log10。

表28：用于评价在与保存剂(用麦芽糖糊精制成)混合，在-80℃下冷冻，在-20℃下放置24小时，并随后解冻并在4℃下保持14天时间后，细菌生存力的活大肠杆菌计数结果(cfu/ml)。

¹该时间点对应于临在-80℃冷冻前使用一个样品进行的分析

本发明人还测试了在25℃的储存条件下单独或在颗粒状动物(猪)饲料中的饲料添加剂中干燥细菌随时间的稳定性。图12显示在储存24周后，饲料添加剂(颗粒珠)中的干燥细菌相对稳定。

16.实施例16

在本实施例中，根据本公开内容的一个实施方案，将动物饲料添加剂并入到动物饲料中。在本实施例中，发明人示出，可用足够的活的非致病性大肠杆菌获得这样的动物饲料，以从该大肠杆菌中获得期望的益处。

在该实施例中，发明人并入了美国专利7,981,411(通过引用整体并入本文)中描述的于2005年1月21日以保藏号idac210105-01保藏于加拿大国际保藏机构(idac)的大肠杆菌菌株。已知该大肠杆菌在肠递送后促进动物的体重增长。因此，该测试的目的是评估根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂在造粒程序期间是否充分保护大肠杆菌菌株，使得包含饲料添加剂的颗粒状动物饲料的施用会导致向动物施用充足的活大肠杆菌以示出预期的生长促进作用。

16.1动物

128头仔猪来自eastlothian，scotland的农场。雄性和雌性的年龄为28天+/-2天的大白猪(largewhite)和长白猪(landrace)杂交。在第一饮食施用前的最后三天内，仔猪没有接受任何对大肠杆菌有效的治疗。仔猪在出生时(第0天)是健康的，称重为5.14kg至10.04kg。动物用独特的标牌(cartag)单独编号。

16.2试验

该研究是对照、随机、预试研究，有两个平行组，构成了与用不含受试菌株的预备级饮食(pre-starterdiet)喂养的对照组相比较的用含有受试菌株的预备级饮食喂养受试菌株的治疗组。

在第0天，根据它们的断奶重量将128只仔猪随机分成2组和多个围栏。每组有16个围栏，每个围栏4只动物。由于受试菌株活性成分(活大肠杆菌菌株)的性质，在相同的环境条件下根据处理将所述组饲养在2个不同的房间中(每种处理1个房间)。自测定开始(即第0天)起施用所测试的菌株。

16.3评价的参数

在本测定中，评价的参数是第0天和第7天的平均日增长(averagedailygain，adg)和总体重增长。

收集饲料样品用于营养分析并通过活细菌计数评估饲料添加剂细菌的量。

每天监测仔猪的健康状况，并记录不良事件和伴随用药。在预定天数测量个体体重。每个围栏记录摄食量(foodintake)和回料重量(feedweightback)。在第0天和第7天收集直肠拭子以通过pcr分析确认受试菌株的存在/不存在。

16.4动物饲料和饲料添加剂

如先前实施例中所述制备饲料添加剂，并且其包含6.6×10⁹cfu/g的大肠杆菌菌株。该饲料添加剂在2℃至8℃之间冷藏储存，并以250g包装包装在聚乙烯“拉链”密封袋中。

动物饲料并入浓度为5.4×10⁸cfu/200g的大肠杆菌菌株。该“受试”动物饲料也称为“预备级饮食”。对照产品是没有饲料添加剂的预备级饮食。

16.5施用

通过预备级饮食(第一饲料)以760g/公吨(tonmetric)的比例施用菌株。预备级饮食未补充有抗微生物剂和抗微生物生长性能促进剂(antimicrobialgrowthperformancepromoter，agp)替代物(有机酸/盐、高水平的cu/zn，等)。

供应预备级饮食持续7天，从研究的第0天至第7天。

16.6结果

分析证实了预备级饮食动物饲料中活性成分的存在和数量。通过pcr在来自处理组所有猪的粪便中检测到了受试菌株，但对照组中未检测到。

在测定期间，如表29中所示，在食用在饲料添加剂中并入大肠杆菌的动物饲料7天后，与未经处理的猪相比，经处理的猪体重增长了143g(每天21g)(p＝0044)。原始数据如图17a至17p中所示，并且如图17中所示进行读取。

表29：动物体重增长(以kg计)

16.7分析和结论

假设两个群体之间的方差不等，进行t检验。计算的t值足够高以拒绝零假设(即，两个群体之间没有显著性差异)，即t统计＞t临界双尾，其中p值＝0.044。然后计算每个群体的标准误，并且在图13和14中的相应图表上显示一个标准误。

图13示出了描述用并入根据本公开内容的一个实施方案的饲料添加剂的动物饲料(ip)和用不含饲料添加剂的动物饲料(“cp”)喂养猪7天后平均增重(kg)的非限制性条形图。误差棒描述标准误(p＝0.044)。图14示出了描述来自图13的猪7天期间的平均日增重(g/天)。误差棒描述标准误(p＝0.044)。

该效果与根据美国专利7,981,411(通过引用整体并入本文)中所述的将该菌株在饮用水中施用至仔猪后所预期的效果一致。换言之，本文中描述的在饲料添加剂中并入大肠杆菌的动物饲料包含充足的活大肠杆菌，其似乎没有显著地遭受动物饲料颗粒制造期间施加的苛刻条件。

注意到，为了方便读者，可在整个本公开内容中使用标题或副标题，但这些都不应限制本发明的范围。此外，本文中可提出和公开某些理论；然而，无论它们是对还是错，它们绝不应限制本发明的范围，只要在不考虑任何特定理论或行动方案的情况下根据本发明实施本发明即可。

在整个说明书中引用的所有参考文献出于所有目的通过引用整体并入本文。

本领域技术人员将理解，在整个说明书中，没有数量词修饰的名词涵盖一个/种或更多个/种。本领域技术人员还将理解，在整个本说明书中，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，其是包含性或开放式的，并且不排除其他未记载的要素或方法步骤。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。

如在本公开内容中使用的，术语“约”、“大约”或“大致”通常应意指在本领域中通常接受的误差幅度(errormargin)内。因此，本文中给出的数值量通常包括这样的误差幅度，使得如果没有明确说明，可推断出术语“约”、“大约”或“大致”。

尽管本公开内容已经相当详细地描述了某些实施例，但是变化和修正是可能的，并且对于本领域技术人员而言根据本教导将变得明显。