包含乌饭树果实提取物的用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物的制作方法

本发明涉及一种包含乌饭树(vacciniumbracteatumthunb.)提取物作为有效成分的用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物或药学组合物，更具体地，涉及可通过利用天然原料的乌饭树果实提取物来无毒性、无副作用地且可安全使用的一种用于预防及改善抑郁症的药学组合物及保健食品组合物。

背景技术：

抑郁症是一种以意志低落和抑郁感为主要症状来引起各种认知及精神上、身体上的症状并导致日常功能下降的疾病。抑郁障碍是一种导致感情、思想、身体状况以及行为等发生变化的严重疾病，从而影响个人整体生活。抑郁症与暂时的抑郁感不同，无法用个人的懦弱表现或意志来消除。

抑郁障碍是非常常见的精神疾病之一，从根据国家的比较中表现出患病率的差异。相比于美国或欧洲、新西兰等国家的主要忧郁障碍终生患病率高达10.1％～16.6％，包括韩国或中国在内的非西方国家的患病率则为5％以下的低水平。

2011年的韩国保健福祉部的精神疾病流行病学调查显示，主要抑郁症的终生患病率为6.7％，年患病率为3.1％，比2006年的流行病学的结果略高，但低于西方国家的水平，处于与非西方国家相似或略高的水平。关于抑郁症的明确原因尚不清楚，但如同其他精神疾病，各种生化、遗传以及环境因素都可导致抑郁症。抑郁症与其他疾病不同，若接受专家的适当治疗，则可预计抑郁症好转，并且可以恢复如往的正常生活。

另一方面，乌饭树(vacciniumbracteatumthunb.)为属于杜鹃花目的双子叶植物，生长于海边的山地。乌饭树高1～3m，幼枝呈灰褐至红色，几乎无毛。叶是交替的叶序且厚实，呈椭圆形或长椭圆形，具有革质。边缘具有稀疏锯齿，后基部有小腺体，6月份开花呈红白色，下垂的总状花序中开着钟状花10余朵，留有苞片。果实为浆果，呈圆形，上面覆盖着白色粉末，直径约6mm，可在10月份食用。

最近，随着现代人的生活水平的提高，对几乎没有副作用且可从自然中采取的自然资源的兴趣日益增加。尤其，随着积极进行对含有人体所需的营养素或对疾病的预防和恢复有特殊帮助的天然功能性物质的健康食品的研究，对乌饭树或其功能的调查正在实施当中，但至今为止，营养学价值和生理活性功能的相关信息仍然不足。

技术实现要素：

技术问题

为了提供生理活性功能尚不明确的作为天然资源的乌饭树的功能食品组合物及药学组合物，本发明提供包含通过从乌饭树果实中提取有效成分来以无毒性、无副作用地且可安全使用的乌饭树果实提取物作为有效成分的用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物或药学组合物。

解决问题的手段

本发明提供利用作为韩国天然资源的乌饭树果实提取物来无毒性、无副作用地且可安全使用的一种用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物及药学组合物。为了实现上述目的，本发明提供包含乌饭树果实提取物作为有效成分的用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物及药学组合物。

具有预防及改善抑郁症功能的药学组合物及功能性食品组合物的提取方法如下：在乌饭树果实添加蒸馏水，利用回流提取器将温度升至100℃后，进行了3小时的加热及萃取。

本发明提供包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的可溶于选自上述水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或它们的混合溶剂中的一种的提取物作为有效成分的用于预防及改善抑郁症的保健功能食品组合物及药学组合物。

上述组合物可制备成选自片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、液剂或饮料中的一种以上的形态。

发明的效果

本发明的乌饭树果实提取物通过减少四肢完全不动的不动时间，证实了其抗抑郁效果优于作为比较组的艾司西酞普兰草酸盐，在动物实验中，当给药乌饭树果实提取物、艾司西酞普兰草酸盐时，与对照组相比，在乌饭树果实提取物给药组中呈现出去甲肾上腺素(正肾上腺素)浓度增加的趋势，从而证实了乌饭树果实提取物通过增加去甲肾上腺素(正肾上腺素)的浓度来具有作为抗抑郁制剂的效果。

附图说明

图1为示出乌饭树果实提取物的示意图。

图2为示出乌饭树果实的分馏物示意图。

图3为示出在对将本发明的乌饭树果实提取物给药6天的白鼠的强迫游泳试验法中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间(immobilitytime)、游泳时间(swimmingtime)、爬升时间(climbingtime)进行比较的图形。

图4为示出关于在给药本发明的乌饭树果实提取物的小鼠的血液中有无神经递质增加，将对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠进行比较的图形。

图5为示出本发明的乌饭树果实提取物对sh-sy5y细胞(神经母细胞瘤(neuroblastoma)、人多巴胺能神经细胞(humandopaminergicneuronalcell))的细胞毒性程度的图形。

图6为示出经过氧化氢处理的乌饭树果实提取物对氧化应激诱导的神经细胞保护效果的图形。

图7为示出经过作为精神应激激素的皮质酮(corticosterone)处理的细胞内应激诱发及根据乌饭树果实提取物的浓度的神经细胞保护效果的图形。

图8为示出本发明的乌饭树果实提取物在表达5-ht1a受体基因的细胞系中使由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加浓度依赖性地增加的效果的图形。

图9为示出本发明的乌饭树果实提取物在表达5-ht2a受体基因的细胞系中使由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加浓度依赖性地抑制的效果的图形。

图10为示出本发明的乌饭树果实提取物的溶剂分馏物对在表达5-ht2a受体基因的细胞系中由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加进行抑制的效果的图形。

具体实施方式

1.乌饭树果实热水提取物的制备

图1为示出获得乌饭树果实提取物的过程。向2.0kg的乌饭树果实中添加蒸馏水30l，利用回流提取器，在100℃升温后，进行3小时的加热、萃取。将获得的提取物减压过滤后进行减压浓缩，获得107.02g的浓缩液。

2.乌饭树果实的极性溶剂、非极性溶剂可溶分馏物的制备

如图2所示，具体说明通过实施体系分馏从上述乌饭树果实热水提取物制备乌饭树果实提取物的分馏物(15g)的步骤如下：将浓缩液充分悬浮在水中，用2倍体积的己烷进行3次的第一次溶剂转移，分离为水层和己烷提取物(hexaneext.)(41.8mg)。再将水层用2倍体积的三氯甲烷进行3次的第二次溶剂转移来确保了三氯甲烷提取物(chcl3ext.)(79.9mg)。用乙酸乙酯进行3次的第三次溶剂转移来确保了乙酸乙酯提取物(etoacext.)(312.4mg)。最后，用正丁醇进行3次的第三次溶剂转移来确保了正丁醇提取物(n-buohext.)(5g)。

3.实验动物及饲养

从(株)桑塔科(samtaco，韩国(korea))购买6周龄的雄性icr小鼠来作为用于测定乌饭树提取物的抗抑郁效果的实验动物，并将小鼠在动物饲养室以恒定条件(温度：22±2℃，湿度：50±5％，明暗度：12小时光照/黑暗循环(light/darkcycle))适应一周后使用。

4.利用乌饭树提取物的抗抑郁动物行为实验

给雄性icr小鼠口服本发明的乌饭树提取物，并且作为比较组，口服用作抗抑郁剂的艾司西酞普兰草酸盐。根据实验给药6天。

作为给药之前的预实验(pre-swim)，在圆柱形水槽(直径20cm，高40cm)中将25℃左右的自来水从槽底倒入至15cm后，将小鼠放入水中并使强迫游泳15分钟，从水中捞出后用干毛巾擦干并送回饲养箱。给药6天后，进行了本实验(post-swim)，将小鼠放入水中并使其强迫游泳6分钟，同时进行了影像拍摄。在记录的影像中，除了最初1分钟之外，对其余5分钟的动物行为进行了3种分类分析，即，分为动物将包括脸在内的上身的一部分露出水面，并仅作出轻微的动作，而漂浮在水面的行为(浮动姿势，immobilitybehavior)，随着向水平方向移动水槽周围，并作出用前脚和后脚打水的行为(游泳，swimmingbehavior)，以及朝向墙壁将前脚踢向水面外，稍微剧烈地移动并作出刮墙壁的行为(爬升，climbingbehavior)后测定了各个时间。

图3为在对将本发明的乌饭树果实提取物给药6天的白鼠的强迫游泳试验法中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间(immobilitytime)、游泳时间(swimmingtime)、爬升时间(climbingtime)进行比较的图形。如图3所示，在将各给药6天后进行强迫游泳的期间，与对照组(245.48±4.05秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的不动时间为169.65±7.15秒，在给药乌饭树果实提取物(100mg/kg及200mg/kg每次口服(p.o))的比较组中的不动时间分别为114.98±9.26秒、118.29±6.35秒，其呈现出显著性减少(p＜0.01及p＜0.001)。并且，与对照组(51.82±3.38秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的游泳时间为128.16±6.65秒，在给药乌饭树果实提取物(100mg/kg及200mg/kg每次口服(p.o))的比较组中的游泳时间分别为177.07±9.79秒、172.23±6.72秒，其呈现出显著性增加(p＜0.01及p＜0.001)。

如上所述，可以确认，由于本发明的乌饭树果实提取物减少四肢完全不动的不动时间，因此抗抑郁效果优于作为比较组的艾司西酞普兰草酸盐。

5.利用乌饭树提取物的血浆内去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)及皮质酮(corticosterone，cor)的测定

在正常状态下，对于作为与忧郁症相关的神经递质的去甲肾上腺素和作为应激激素的皮质酮的浓度变化所产生的影响，从给药6天后的各小鼠中分离血浆(plasma)后，使用亚诺法(abnova)公司的酶联免疫试剂盒(elisakit)并根据制造商的指示进行了测定。

图4为关于在给药本发明的乌饭树果实提取物的小鼠的血液中有无神经递质增加，将对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠进行比较的图形。在正常状态下，对去甲肾上腺素和皮质酮的变动的乌饭树果实提取物的抗抑郁功效进行了验证。感到抑郁的原因是因为脑中神经细胞分泌的血清素或去甲肾上腺素(正肾上腺素)的量很少。通过乌饭树果实提取物来确认去甲肾上腺素神经递质的有无增加的结果显示，如图4的(a)部分所示，当向正常动物给药乌饭树果实提取物(100mg/kg及200mg/kg)、艾司西酞普兰草酸盐(10mg/kg)时，与对照组相比，在乌饭树果实提取物100mg/kg及200mg/kg给药组中，呈现出去甲肾上腺素的浓度增加的趋势。由于乌饭树果实提取物增加去甲肾上腺素的浓度，因此意味着具有抗抑郁剂的功效。

并且，如图4的(b)部分所示，与对照组相比，乌饭树果实提取物(100mg/kg及200mg/kg)给药组的作为应激激素的皮质酮的数值显著地减少，与对照组相比，作为比较组的艾司西酞普兰草酸盐给药组呈现出减少的趋势，但未呈现出显著性减少。因此，可确认，当感到有压力时，皮质酮的数值增加，但这启示乌饭树果实提取物在压力抑郁模型中也可具有抗抑郁作用。

6.对在脑神经细胞中利用乌饭树提取物的压力缓解活性的确认

将sh-sy5y细胞(神经母细胞瘤(neuroblastoma)、人多巴胺能神经细胞(humandopaminergicneuronalcell))在含有1％抗真菌剂/抗生素(antimicotics/antibiotics)和10％胎牛血清(fbs)的最低必需培养基(mem)中培养，在96-孔板(wellplate)中接种使得细胞数为10⁵cell/ml后，培养了24小时。

为了确定乌饭树果实提取物对神经细胞的细胞毒性，按浓度进行处理。乌饭树果实提取物处理24小时后，用mtt比色法(mttassay)测定了细胞生存率。

图5为示出本发明的乌饭树果实提取物对sh-sy5y细胞(神经母细胞瘤(neuroblastoma)、人多巴胺能神经细胞(humandopaminergicneuronalcell))的细胞毒性程度的图形。

关于细胞毒性程度，通过利用mtt测定乌饭树果实提取物的细胞毒性(cytotoxicity)来设定了使用浓度的最大安全范围。通过以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的乌饭树果实热水提取物浓度处理来确认作为使用细胞系的sh-sy5y细胞的细胞毒性，与对照组(0μg/ml)相比，在1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml浓度下未发现显著性差异。然而，在100μg/ml浓度下，与对照组相比没有显著性差异，但细胞生存度降低。作为本实验结果，在30μg/ml内进行了实验。

为了确认乌饭树果实提取物对因氧化应激导致的神经细胞死亡的效果，首先，为了确定过氧化氢的使用浓度，将过氧化氢(h2o2)按浓度处理24小时来确认细胞毒性，确定呈现出50-60％的细胞毒性的浓度后将其用于实验中。对于乌饭树果实提取物的神经细胞保护效果确认实验，将实验细胞系(sh-sy5ycellline)分成96孔微量培养板培养24小时，然后将乌饭树果实提取物处理2小时，并处理10μm的h2o2，培养了24小时。24小时后，利用mtt比色法(mttassay)测定了细胞生存率(cellviability)。

图6为示出经过氧化氢处理的乌饭树果实提取物对氧化应激诱导的神经细胞保护效果的图形。在图6的(a)部分中，为了确定过氧化氢的使用浓度，对作为使用细胞系的sh-sy5y细胞按h2o2浓度处理后，确认其细胞毒性，结果，在10μm中，与对照组(0μg/ml)相比，细胞生存度呈现出50-60％的显著性细胞毒性，因此将其用于实验中。在图6的b部分中，当与过氧化氢(h2o2)10μm一同处理乌饭树果实的热水提取物时，由于浓度分别为0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml时的细胞生存度分别为54.75±2.85％、52.18±5.05％、69.01±1.48％、80.24±1.14％，因此，确认了细胞生存度显著增加(p＜0.05或p＜0.01)。

为了从细胞水平上确认乌饭树提取物的精神压力的抵抗活性，为了确认对作为应激激素的皮质酮诱发的神经细胞损伤的保护效果而进行了实验。将皮质酮(corticosterone)按浓度处理24小时来确认细胞毒性，确定呈现出50-60％的细胞毒性的浓度后将其用于实验中。对于乌饭树果实提取物的保护效果实验，将实验细胞系(sh-sy5ycellline)分成96孔微量培养板培养24小时，然后将乌饭树果实提取物处理2小时，并处理1mm皮质酮培养了24小时。24小时后，利用mtt比色法(mttassay)测定细胞生存率(cellviability)。

图7为示出根据经过作为精神应激激素的皮质酮(corticosterone)处理的细胞内应激诱发及乌饭树果实提取物的浓度的神经细胞保护效果的图形。为了确定作为应激激素的皮质酮(corticosterine)的使用浓度，用以50μm、100μm、300μm、500μm、1000μm的皮质酮浓度处理sh-sy5y细胞来确认细胞毒性，与对照组(0μg/ml)相比，在300μm、500μm、1000μm下细胞生存度减少，将呈现出50-60％细胞毒性的1mm用于实验中。图7的(b)部分中，当与皮质酮一同处理乌饭树果实的热水提取物时，由于浓度分别为0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml时的细胞生存度分别为63.28±0.42％、66.55±2.21％、86.91±4.27％、89.08±5.47％，因此，确认细胞生存度显著增加(p＜0.05或p＜0.01)。

7.利用乌饭树提取物的5-ht1a受体或者在5-ht2a受体基因表达的细胞系中细胞内ca²⁺的活性测定

从atcc购买cho-k1细胞系(chinesehamsterovarycell)，使用培养液(rpmi1640、胎牛血清(fetalbovineserum)10％、青霉素(penicilin)100iu/ml、链霉素(streptomycine)100μg/ml)在96孔黑壁/透明底(bdfalcon)中分裂细胞后，在37℃、5％co2培养箱中培养了24小时。利用等离子体变换试剂lipofectamine2000，将血清素1a受体(5-ht1areceptor)或者血清素2a受体(5-ht2areceptor)的每个cdna在细胞中瞬时表达48小时的细胞用于实验。

用hepes缓冲溶液(155mm的nacl、2mm的cacl2、1mm的mgcl2、3mm的kcl、10mm的hepes、10mm的葡萄糖、ph7.4)对荧光染色之前的细胞洗涤一次，然后，使用用于测定细胞内钙浓度的荧光染料对fura-2/am以最终5μm浓度处理，在37℃、5％co2培养箱中以遮光状态反应了60分钟。60分钟后，用hepes缓冲溶液洗涤一次，然后使用高通量系统(hts)测定细胞内钙浓度使得340/380nm光以选择性地暴露，之后使用数字荧光分析仪测定经分析的340/380nm比(ratio)值。由于细胞中的fura-2/am在与ca²⁺结合状态下在340nm激发，在未结合状态下在380nm激发，因此，340/380nm比值的增加意味着与细胞内ca²⁺结合的fura-2/am变多。

将处理血清素(5-ht)100μm获得的值使用于对照组，将乌饭树果实提取物以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml浓度处理1分钟后，通过处理5-ht100μm来确认细胞内钙的含量变化。作为参考，在图8及图9中各项目的误差条上显示的数字表示实验中使用的细胞数量。

图8为示出本发明的乌饭树果实提取物将在表达5-ht1a受体基因的细胞系中使由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加浓度依赖性地增加的效果的图形。乌饭树果实提取物在5-ht1a受体中血清素诱导的细胞内ca²⁺的增加过程中，与血清素相比，激活细胞内ca²⁺，从而作为5-ht1a受体的部分兴奋剂作用剂来确认效果。如图8所示，可以确认，与以100μm血清素处理的对照组相比，以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的乌饭树果实提取物浓度处理的细胞生存度分别为10.31±6.86％、47.45±1.45％、62.73±2.37％、67.08±1.36％、88.09±3.50％，经5-ht1a受体-特异性血清素诱导的细胞内ca²⁺浓度依赖地被激活。

8.利用乌饭树的溶剂提取物的在5-ht2a受体基因表达的细胞系中细胞内ca²⁺的活性测定

从atcc购买cho-k1细胞系(chinesehamsterovarycell)，使用培养液(rpmi1640、胎牛血清(fetalbovineserum)10％、青霉素(penicilin)100iu/ml、链霉素(streptomycine)100μg/ml)在96孔黑壁/透明底(bdfalcon)中分裂细胞后，在37℃、5％co2培养箱中培养了24小时。利用等离子体变换试剂lipofectamine2000，将血清素2a受体(5-ht2areceptor)的每个cdna在细胞中瞬时表达48小时的细胞用于实验。

用hepes缓冲溶液(155mm的nacl、2mm的cacl2、1mm的mgcl2、3mm的kcl、10mm的hepes、10mm的葡萄糖、ph7.4)对荧光染色之前的细胞洗涤一次，然后，使用用于测定细胞内钙浓度的荧光染料对fura-2/am以最终5μm浓度处理，在37℃、5％co2培养箱中以遮光状态反应了60分钟。60分钟后，用hepes缓冲溶液洗涤一次，然后使用高通量系统(hts)测定细胞内钙浓度使得340/380nm光以选择性地暴露，之后使用数字荧光分析仪测定经分析的340/380nm比值。由于细胞中的fura-2/am在与ca²⁺结合状态下在340nm激发，在未结合状态下在380nm激发，因此，340/380nm比值的增加意味着与细胞内ca²⁺结合的fura-2/am变多。

将处理血清素(5-ht)100μm获得的值使用于对照组，将乌饭树果实提取物的己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇以及水分馏物以10μg/ml浓度进行1分钟的预处理之后，通过处理5-ht100μm来确认细胞内钙的含量变化。

图9为示出本发明的乌饭树果实提取物将在表达5-ht2a受体基因的细胞系中使由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加浓度依赖性地抑制的效果的图形。根据图9可以确认，乌饭树果实提取物在5-ht2a受体中血清素诱导的细胞内ca²⁺的增加过程中，与血清素相比，将细胞内ca²⁺浓度进行依赖性抑制。如图9所示，与以100μm血清素处理的对照组相比，以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的乌饭树果实提取物浓度处理的细胞生存度分别为29.15±0.81％、37.53±0.49％、42.09±0.92％、54.39±0.55％、59.03±0.48％，抑制经5-ht2a受体-特异性血清素诱导的细胞内ca²⁺。

图10为示出本发明的乌饭树果实提取物的溶剂分馏物对在表达5-ht2a受体基因的细胞系中由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加进行抑制的效果的图形。在图10中，各项目的误差条上指示的数字表示实验中使用的细胞数量。根据图10，示出了在乌饭树果实提取物的溶剂分馏物有关的5-ht2a受体中血清素诱导的细胞内ca²⁺增加，与血清素相比，细胞内ca²⁺的浓度抑制活性的结果。如图10所示，乌饭树果实提取物的溶剂分馏物的己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇以及水分馏物中乙酸乙酯及丁醇分馏物对5-ht2a受体中血清素诱导的细胞内ca²⁺增加的降低活性最高。

9.利用乌饭树果实提取物的药剂或保健食品的制备

将乌饭树果实提取物作为有效成分的用于增强免疫力的药物组合物或保健食品组合物可制备成片剂及胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、液剂的形态。根据另一适当的实施方式，上述组合物可以制备成饮料添加剂。上述用于增强免疫力的药剂或保健食品可剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶、硬皮剂、栓剂或灭菌注射用液来制备，以包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的组合物，其将乌饭树果实提取物作为有效成分。

在灭菌注射液的情况下，可通过包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的上述药物组合物，并混合99.9重量百分比至0.01重量百分比的纯净水或葡萄糖来制备，在胶囊剂的情况下，可通过将上述药物组合物冻干，以包含0.01重量百分比至99.9重量百分比，并混合99.9重量百分比至0.01重量百分比的维生素剂和钙制剂来制备。

上述制备的药物组合物的日剂量为含有上述提取物10mg/kg至2000mg/kg体重的含量，并且可制备成包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的上述药物组合物的用于预防或改善抑郁症状的保健功能食品。

产业上的可利用性

本发明提供包含乌饭树(vacciniumbracteatumthunb.)果实提取物作为有效成分的用于改善抑郁症原因和症状性疾病的保健功能食品组合物，用栖息于自然的植物替代生产原料，从而可以降低制造生产成本并预期通过工业化来替代进口及出口效果，因此具有产业上可利用性。