本发明涉及农产品加工领域，更具体地涉及应用酶工程技术自金针菇柄中提取分离脂肪代谢调节剂组合物的方法。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，对畜禽肉品的品质要求也越来越高，无公害且胴体瘦肉率高是目标所在。这就要求在养殖过程中既不能添加诸如瘦肉精之类的化学品，又要调节脂肪代谢，提高瘦肉占比，因此促使人们在不用大幅提高养殖成本的前提下从天然产物中筛选提取。
金针菇学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、冻菌、金菇、智力菇等，植物学名为flammulinavelutipes(fr.)。我国是世界上金针菇等食用菌类的主要生产和消费国之一，金针菇采收时，紧邻培养基的菇柄部分会被切除，产生大量的废弃物，约占原料的20％-30％。其通常直接作为饲料加以利用，使用价值很低，其中含有的蛋白质、多糖、萜类、矿质元素等生物活性成分没有得到充分利用，因此，将菇柄进行生物酶处理，可以增加动物机体的吸收利用，提高其附加值，促进金针菇的综合利用。
已有大量研究表明，金针菇多糖和萜类物质具有提高免疫和降血脂的功能，其提取方法多采用热水提取法，也有采用酶法提取多糖。前者能耗较高，且不能同时提取萜类物质；后者大多采用单一酶，提取效率低，尤其是没有根据食用菌细胞壁的组成特点采用几丁质酶，因而提取效率差。
此外，由于种种原因，本领域尚没有在水-乙醇体系中酶法同时生产金针菇柄多糖和萜类的工艺。
综上所述，本领域迫切需要开发对环境友好的、有效的利用金针菇柄的深加工技术。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对环境友好的、有效的利用金针菇柄生产多糖和萜类组合物的方法。
本发明的技术方案为：
一种酶法制备脂肪代谢调节剂组合物的方法，包括步骤：
(a)将金针菇柄水溶液-乙醇的混合液用果胶酶处理，获得经果胶酶处理的第一酶解液；
(b)将所述的第一酶解液用蛋白酶处理，获得经蛋白酶处理的第二酶解液；
(c)将所述的第二酶解液用纤维素酶处理，获得经纤维素酶处理的第三酶解液；
(d)将所述的第三酶解液用几丁质酶处理，获得经几丁质酶处理的第四酶解液；
(e)从所述的第四酶解液中进行过滤，分离出脂肪代谢调节剂组合物溶液。
所述的制备脂肪代谢调节剂组合物的方法还包括步骤：
(f)对步骤(e)获得的组合物溶液进行脱色、浓缩从而制得浓缩液；
(g)对所述的浓缩液进行干燥。
本发明应用所述的制备方法制备一种脂肪代谢调节剂组合物，所述的调节剂组合物组分的组成为金针菇柄可溶性多糖和倍半萜，其中多糖分子量在10万～100万道尔顿，其多糖组成包括：葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和岩藻糖；其倍半萜结构为2，3，4，5-四氢-2，7-二羟基-5，8，10，10-四甲基-2，5-亚甲基-1-苯并氧杂分子量248，薄层层析位移值＝0.35，紫外最大吸收峰225nm和5-甲基-2(3-氧-1，2，2-三甲基环戊基)苯醌分子量246，rf＝0.68，紫外最大吸收峰242nm。
所述的脂肪代谢调节剂组合物被作为添加剂用于食品或饲料；其脂肪代谢调节剂组合物的功能在于调节脂肪代谢和提高畜禽瘦肉率。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明采用复合酶解法，尤其是几丁质酶的首次应用于金针菇炳的降解，由于具有特异性，可选择性地酶解切断特定链，酶解过程可控，提高酶解效率，从而得到高收率的金针菇多糖，而且反应条件温和，没有强酸强碱，减少了环境污染，可实现清洁生产。其酶解多糖纯度高，安全性好，尤其适合于医药、食品、绿色养殖领域中的运用。
(2)本发明首次采用水-乙醇体系进行金针菇柄的复合酶解，可一次性提取多糖和倍半萜类功效成分，降低生产成本，提高金针菇柄的综合利用价值。
(3)本发明制备的组合物具有调节脂肪代谢，提高胴体瘦肉率的作用。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用含有几丁质酶的复合酶工程方法对金针菇柄中的多糖和倍半萜类组合物成功地进行了提取分离，获得了有功能的脂肪代谢调节组合物。它们可作为添加剂用于食品和畜禽养殖加工过程。在此基础上完成了本发明。
本发明中的名词说明
1、金针菇柄
术语“金针菇柄”包括干金针菇柄以及湿金针菇柄。可用于本发明的金针菇柄没有特别限制，此外，应理解，术语“金针菇柄”不仅包括纯的金针菇柄，还可包括完整的金针菇。
2、酶
文中所用“复合酶”指用于的本发明酶法的4种酶的总称，即果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶。所述的果胶酶、纤蛋白酶、维素酶和几丁质酶的用量没有特别限制，只要各种酶能够发挥其酶解功能即可。
果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶都是可以通过市售方式购买或者通过现有技术中已知的方法进行制备。根据所采用酶的种类，可以在其最适ph值或其附近范围、最适温度或其附近范围下进行酶解。
本发明第一方面提供了一种酶法制备脂肪代谢调节剂组合物的方法，在本发明的酶工程制备方法中，包括原料金针菇柄水溶液的预处理制备步骤：将金针菇柄原料在水中浸泡1-12小时，金针菇柄原料(g)与水(ml)的比例选择在1∶10-1∶2之间，调溶液ph到1-7，100℃-121℃灭菌10-50分钟，后冷却到35℃-55℃，制成金针菇柄水溶液。
所述的酶法制备脂肪代谢调节剂组合物的方法包括步骤：
(a)将金针菇柄水溶液-乙醇的混合液用果胶酶处理，获得经果胶酶处理的第一酶解液；
(b)将所述的第一酶解液用蛋白酶处理，获得经蛋白酶处理的第二酶解液；
(c)将所述的第二酶解液用纤维素酶处理，获得经纤维素酶处理的第三酶解液；
(d)将所述的第三酶解液用几丁质酶处理，获得经几丁质酶处理的第四酶解液；
(e)从所述的第四酶解液中进行过滤，分离出脂肪代谢调节剂组合物溶液。
在优选例中，步骤(a)中所述的金针菇柄水溶液-乙醇的混合液，金针菇柄水溶液∶乙醇的体积比值范围为99∶1至85∶15之间。
在优选例中，对于1克金针菇柄干重，所述的果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶4种酶的总用量10-1000iu。果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶的用量之间的重量比例为：0.5-5∶0.2-1∶0.5-5∶0.5-2。
在步骤(a)中，用果胶酶进行处理的条件为：在温度25℃-65℃，ph1.0-ph9.0，10转-150转/分钟搅拌，35℃-55℃的条件下酶解1-24小时(较佳4-16小时)。
在步骤(b)至(d)中，用酶进行处理的条件为：将前一步骤获得的酶解液温度调至100℃保温8-15分钟，然后降温至温度25℃-65℃，加入相应酶，再调整ph值1.0-ph9.0，在10转-150转/分钟搅拌，35℃-55℃的条件下酶解1-24小时(较佳4-16小时)。
在步骤(a)-(d)中，对于处理后获得的酶解液还要进行酶灭活处理。所述的酶灭活处理是在70-100℃下放置1-20分钟。
在优选例中，步骤(b)中所述的蛋白酶是酸性蛋白酶。
本发明中，当使用果胶酶和酸性蛋白酶时，可用酸酸化溶液。其中，采用的酸没有特别限制，可以是盐酸，硫酸等无机酸或乙酸等有机酸，较佳地是盐酸，其浓度通常2-8n。通常将ph调节为1-5.5，较佳的ph2.5-3.5即可。
当需要中和酸或调节ph时，可使用碱。其中，采用的碱没有特别限制，可以是氢氧化钠，氢氧化钾、碳酸钠等无机碱，也可使用常规的有机碱，较佳地是氢氧化钠，其浓度通常2-8n。使用纤维素酶或几丁质酶时，通常可用碱将酸性溶液的ph调节至4-8，较佳的ph5-6。
所述的制备脂肪代谢调节剂组合物的方法还包括步骤：
(f)对步骤(e)获得的组合物溶液进行脱色、浓缩从而制得浓缩液。
所述的脱色采用以下条件进行：将步骤(e)得到的组合物溶液经颗粒状活性炭脱色，活性炭柱(4.6×200cm)。活性碳∶酶解液＝1∶3-15，流速10ml/分钟，从而获得脱色液。
所述的浓缩采用以下条件进行：将脱色液进行真空浓缩，操作条件为真空度0.05mpa-0.1mpa；温度25℃-65℃，从而获得浓缩液。
(g)对所述的浓缩液进行干燥，从而获得组合物的干燥粉末。
所述的干燥采用喷雾干燥，工艺条件为多糖浓度20g/l-200g/l；进料速度0.05ml/s-0.5ml/s；进风温度110℃-200℃。
本发明第二方面提供了应用所述的制备方法制备的脂肪代谢调节剂组合物。所述的调节剂组合物组分的组成为金针菇柄可溶性多糖和倍半萜，其中多糖分子量在10万～100万道尔顿，其多糖组成包括：葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和岩藻糖。其倍半萜结构为2，3，4，5-四氢-2，7-二羟基-5，8，10，10-四甲基-2，5-亚甲基-1-苯并氧杂(c15h20o3)分子量248，薄层层析位移值(rf)＝0.35，紫外最大吸收峰225nm和5-甲基-2(3-氧-1，2，2-三甲基环戊基)苯醌(c15h18o3)分子量246，rf＝0.68，紫外最大吸收峰242nm。
本发明第三方面提供了应用所述的制备方法制备的脂肪代谢调节剂组合物的用途，其中所述的脂肪代谢调节剂组合物被作为添加剂用于食品或饲料。其脂肪代谢调节剂组合物的功能在于调节脂肪代谢和提高畜禽瘦肉率。在本发明的药物组合物、食品组合物或饲料组合物中，可以添加各种常规的载体、赋形剂、稀释剂、添加剂、香料、防腐剂等物质，只要它们不干扰本发明脂肪代谢调节剂组合物的功能。
实施例1
从大金针菇柄中制取水溶性和非组合物
100克干金针菇柄，加入300克去离子水，1mol/l盐酸调ph到3.5，升温到100℃保持45分钟，然后降温至在50℃。
向上述溶液中加入5个国际单位/克金针菇柄的果胶酶，45转/分钟搅拌下，50℃保温酶解8小时。
将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在45℃，1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到2.5，60转/分钟搅拌下，加入2个国际单位/克金针菇柄的酸性蛋白酶，保温酶解4小时。
将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在55℃，1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到5，80转/分钟搅拌下，加入5个国际单位/克金针菇柄的纤维素酶，保温酶解10小时。
将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在45℃，1mol/l的盐酸和1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到5.5，120转/分钟搅拌下，加入5个国际单位/克金针菇柄的几丁质酶，保温酶解12小时。
将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在25℃-65℃。过滤后获得组合物溶液240毫升。
将组合物液经颗粒状活性炭脱色，活性炭柱(2.6×100cm)，活性碳50克，，流速10ml/分钟，得到脱色多糖溶液210毫升。
将上述脱色液进行真空浓缩，操作条件为真空度0.08mpa；温度50℃；获浓缩液70毫升。
针对上述浓缩液进行喷雾干燥，工艺条件为多糖浓度150g/l；进料速度0.2ml/s；进风温度180℃。制得粉末状多糖18.5克，倍半萜类0.12克。
实施例2
在本发明的一个优选实施例中，提供了一种酶法制备脂肪代谢调节剂组合物的具体方法，它包括步骤：
(a)将金针菇柄水溶液∶乙醇＝90∶10的溶液中加入5-50国际单位/克金针菇柄的果胶酶，在搅拌速率10转-150转/分钟，ph2.5-5.5，35℃-55℃的条件下保温酶解2小时-12小时。
(b)将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在35℃-60℃，加入2-10国际单位/克金针菇柄的酸性蛋白酶，用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到1.5-5.5，在10转-150转/分钟搅拌下，保温酶解3小时-10小时。
(c)将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在35℃-60℃，加入5-50国际单位/克金针菇柄的纤维素酶，用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到3.5-6.5，在10转-150转/分钟搅拌下，保温酶解8小时-16小时。
(d)将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在35℃-65℃，加入5-50国际单位/克金针菇柄的几丁质酶，用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠调溶液ph到3-7，在10转-150转/分钟搅拌下，保温酶解6小时-20小时。
(e)将上述酶解液温度调至100℃保温10分钟，然后降温至在25℃-65℃。过滤后获得组合物溶液。
本实施例例还包括利用真空技术浓缩组合物的步骤，具体包括：
(f)将得到的组合物液经颗粒状活性炭脱色，活性炭柱(4.6×200cm)，活性碳∶酶解液＝1∶3-15，流速10ml/分钟。
(g)将上述脱色液进行真空浓缩，操作条件为真空度0.05mpa-0.1mpa；温度25℃-65℃，获浓缩液。
在本发明的酶工程制备方法中，还包括对浓缩液进行喷雾干燥的工艺，具体包括步骤：
(h)针对上述浓缩液进行喷雾干燥，工艺条件为多糖浓度20g/l-200g/l；进料速度0.05ml/s-0.5ml/s；进风温度110℃-200℃。
一种本发明的组合物的测定
成分测定：
准确称取制备的水溶性多糖纯品5.0mg加入200μl浓硫酸静置，添加800μl的蒸馏水，100℃恒温水解2.5h，冷却后定容至2ml，水解液以固体baco3中和，4000r/min离心10min除去杂质，将上清液稀释10倍并过滤后进行检测。
检测条件：色谱仪为waters486hplc色谱仪；色谱柱为pa20糖柱(4μm，4.6×250mm)：检测器为蒸发光散射检测器；流动相为10mmol/lnaoh溶液；工作参数：常温、流速0.4ml/min，样品浓度10μg/ml，进样量10μl，进样间隔10min。
将检测结果与各种单糖(包括半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖及糖醛酸)标准样品的保留时间进行比较，表明本发明的脂肪代谢调节剂组合物的单糖组成包括：半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖、阿拉伯糖。
下面用不同的实施例与本发明进行对比：
对比例1：重复实施例1，不同点在于，省略果胶酶处理步骤。结果：虽然获得组合物，但得率较低，多糖仅3.1克，未测出倍半萜类。
对比例2：重复实施例1，不同点在于，省略蛋白酶处理步骤。结果：虽然可获得组合物，但是数量很少，仅1.3克，倍半萜类仅0.06克。
对比例3：重复实施例1，不同点在于，将省略纤维素酶处理步骤。结果：获得水-乙醇的混合液较粘，难以进行后续处理，不易获得水溶性组合物。
对比例4：重复实施例1，不同点在于，将省略几丁质酶处理步骤。结果：水溶性组合物中多糖和倍半萜含量很低，多糖3.6克，倍半萜0.02克。
对比例5：重复实施例1，不同点在于，将纤维素酶处理步骤和果胶酶处理步骤的次序颠倒。结果：虽然可获得组合物，但是数量很少，仅约5克。
一种本发明的组合物作为饲料添加剂的测定
选择25日龄樱桃谷鸭，按饲喂日粮组(对照组)和饲喂灵芝发酵料组(实验组)分为2组，每组3个重复，每个重复10只。饲养方法和管理按常规进行，经25天喂养各项指标均优于对照组，见表1。
表1添加金针菇提取组合物饲料喂养肉鸭实验结果
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在实施例中具体描述的各技术特征可以互相组合，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，从而构成新的或优选的技术方案，这些等价形式同样落于本发明权利要求所限定的范围。