一种对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的制作方法

本发明涉及一种水产养殖用免疫增强剂，具体涉及一种对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂，属于水产配合饲料添加剂技术领域。

背景技术

据联合国粮农业组织（fao）统计数据显示，2016年世界对虾养殖产量518万吨，约占世界水产养殖总产量的6.5%。近年来，对虾养殖业主要存在着种质退化、养殖环境恶化等问题，导致对虾免疫机能下降，病害大规模爆发，养殖成功率骤降，极大地阻碍了对虾养殖业健康持续发展。目前，主要通过传统化学药物和抗生素来预防病原爆发，导致环境污染、病原生物耐药性增强并通过食物链直接危害人类健康。

中草药是我国医药文化的瑰宝，相较于传统化学药物和抗生素具有绿色天然、无耐药性、毒副作用小或无、资源丰富等优势，在水产动物疾病防治上具有十分广阔的应用前景。目前，传统的中草药添加剂多采用原粉添加，存在有效成分不明确、杂质多、适口性差等问题，在养殖过程中长期投喂还会引起对虾肝胰腺损伤和养殖环境污染。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂，该制剂选用三种中草药分别提取免疫多糖，组成中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂添加进对虾饲料中，提高对虾免疫力和抗病力。本发明采用的具体技术方案为：

一种对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂，其特征在于，以质量分数计，它包括黄芪多糖40-70%、白术多糖10%-20%、防风多糖10%-40%。

优选的，所述的中草药多糖免疫增强剂，黄芪多糖：白术多糖：防风多糖的质量比为4：1：1。

优选的，所述的中草药多糖免疫增强剂，黄芪多糖：白术多糖：防风多糖的质量比为4：1：3。

所述的黄芪多糖提取自黄芪，所述的白术多糖提取自白术，所述的防风多糖提取自防风，提取方法均采用水提取，以黄芪为例，将黄芪均匀粉碎后，与蒸馏水按质量分数1:12混合均匀后，用沸水煎煮2次，每次1.5小时，合并两次滤液，减压浓缩后加入95%乙醇，最终醇浓度为70%，静置过夜，抽滤，得黄芪多糖粗提物、白术多糖粗提物和防风多糖粗提物；

然后按照常规方法从上述黄芪多糖粗提取物、白术多糖粗提取物和防风多糖粗提取物中分别提取黄芪多糖、白术多糖和防风多糖。

所述的一种对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂在对虾免疫中的应用；能够显著提高对虾机体免疫力，提高对虾抗病力。

一种含有对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的对虾饲料，其特征在于该饲料是在基础饲料中添加黄芪多糖、白术多糖和防风多糖后得到的；且每千克基础饲料中添加黄芪多糖1.3g、白术多糖0.325g和防风多糖0.325g，或者黄芪多糖1.3g、白术多糖0.325g和防风多糖0.975g。

所述的基础饲料以质量分数计，鱼粉34%、豆粕20%、花生粕16.4%、小麦粉22%、大豆磷脂5%、复合维生素0.6%、复合矿物质2%。

本发明的优点和有益效果：

（1）提高了凡纳滨对虾血细胞数量。血细胞是甲壳动物的免疫系统的核心组分，反映了机体的免疫应激能力或健康状况。在投喂中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的28天内，试验组对虾血细胞数量均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。

（2）提高了凡纳滨对虾血细胞吞噬活性。血细胞可以通过吞噬作用消灭病原等外来物质，因此，血细胞吞噬活性是对虾免疫能力的重要体现，在投喂中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的28天内，试验组对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。

（3）提高了凡纳滨对虾血浆抗菌活性。抗菌活性反映了甲壳动物的抗菌肽等成分的抗微生物作用活性，在投喂中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的28天内，试验组对虾血浆抗菌活性均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。

（4）提高了凡纳滨对虾血浆溶菌活性。溶菌活性反应了甲壳动物体内溶菌酶活性，在投喂中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的28天内，试验组对虾溶菌活性均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。

（5）提高了凡纳滨对虾对致病弧菌的抵抗能力。攻毒试验结果表明在注射哈维氏弧菌后7天，试验组对虾累计死亡率均显著低于对照组（p<0.05）。

试验证明了本发明所提供的中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂能够增强对虾机体免疫力和疾病抵抗力；该增强剂选用黄芪、白术、防风三种中草药进行科学配伍，并提取其免疫多糖，有效避免了添加中草药原粉所产生的适口性差、肝胰腺负担增大、破坏养殖环境等不良效应；可以有效的替代和减少传统化学药物和抗生素的使用，符合水产养殖绿色健康发展理念；本发明有效成分制备简易，成本较低，能够提高对虾养殖业的经济效益。

附图说明

图1为实施例2中对虾血细胞数量的结果图。

图2为实施例2中对虾血细胞吞噬活性的结果图。

图3为实施例2中对虾血浆抗菌活力的结果图。

图4为实施例2中对虾血浆溶菌活力的结果图。

图5为实施例2中攻毒实验对虾累计死亡率的结果图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1：

对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂及养殖饲料的制备

首先制备中草药免疫多糖，提取均采取水提法。分别将片状的黄芪、白术、防风均匀粉碎后，按照1:12的质量体积比与蒸馏水混合均匀，煎煮萃取2次，每次1.5小时，合并2次滤液，减压浓缩后加入95%乙醇使最终乙醇含量为70%，静置过夜，抽滤即得黄芪多糖粗提物、白术多糖粗提物和防风多糖粗提物；

然后按照常规方法从上述黄芪多糖粗提取物、白术多糖粗提取物和防风多糖粗提取物中分别提取黄芪多糖、白术多糖和防风多糖。

按照上述的制备方法分别制备两种不同浓度的中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂及相应的养殖饲料。以质量分数计，一种中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1.3g、白术多糖0.325g和防风多糖0.325；另一种中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1.3g、白术多糖0.325g和防风多糖0.975g；

上述中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。黄芪多糖含量的测定方法参照：黄芪中黄芪多糖含量测定方法的比较，中国医药工业杂志，2005年第36卷第9期；白术多糖含量的测定方法参照：不同产地白术多糖含量测定，中国药业，2005年第14卷第4期；防风多糖含量的测定方法参照：防风多糖的提取分离与含量测定方法研究，吉林中医药，2016年第36卷第5期。

实施例2：

对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂对凡纳滨对虾非特异性免疫力的影响。

本试验中，发明人将实施例1制备的对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂饲喂凡纳滨对虾，通过分析凡纳滨对虾的非特异性免疫指标，研究本发明对提高凡纳滨对虾免疫力的效果。

1材料与方法

1.1材料

试验用凡纳滨对虾（litopenaeusvannamei）购于青岛市崂山区沙子口对虾养殖厂，体重为3±0.32g克，试验用基础饲料的成分为：以质量分数计，鱼粉34%、豆粕20%、花生粕16.4%、小麦粉22%、大豆磷脂5%、多种维生素0.6%、复合矿物质2%。经实验计算饲料中营养成分为：以质量分数计，粗蛋白42.4%、粗脂肪7.2%、灰分8.4%。

1.2方法

1.2.1试验设计

试验用凡纳滨对虾暂养7天后随机分成3组，分别为对照组、试验组1和试验组2，每组设3个重复，每个重复组放养70尾虾。对照组投喂基础饲料，试验组1和试验组2分别投喂实施例1所制备的含有对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂饲料。养殖实验持续28天后，每组随机取30尾虾进行攻毒试验，以10尾虾为一个重复，每个试验组3重复。将哈维氏弧菌按1×10⁶cell/ml浓度在对虾尾节末端肌肉注射（30µl/尾）。试验期间，每日投喂2次，日投喂量为体重的5%，试验期间，水温，盐度，ph，分别为22-23℃,34‰,7.8-8.0。

1.2.2测定指标和方法

分别于投喂中草药免疫增强剂后第0、7、14、21、28天取样。每次每组随机取凡纳滨对虾8尾，使用消毒的5号针头和1ml注射器直接插入对虾头胸甲后缘围心腔内3mm左右进行采血，抽血前注射器内预先吸入了0.3ml改进的预冷凡纳滨对虾抗凝剂（0.34mnacl,0.01mkcl,0.01medta-na2,0.01mhepes,ph7.45,渗透压为780mosm.kg^-1），最终使得抗凝剂和血淋巴的比例为1:1。一部分血淋巴样品进行血细胞数量及吞噬率的测定，剩余血淋巴样品于4℃下800g离心10min后，取蓝色上清，即为血浆样品，进行抗菌活力及溶菌活力的测定。

血细胞数量的测定使用血球计数板在光学显微镜下进行计数；吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：immuneresponsesandexpressionofimmune-relatedgenesinswimmingcrabportunustrituberculatusexposedtoelevatedambientammonia-nstress.comparativebiochemistryandphysiologyparta；抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：insectimmunity.purificationandpropertiesofthreeinduciblebactericidalproteinsfromhemolymphofimmunizedpupaeofhyalophoracecropia.europeanjournalofbiochemistry；累计死亡率的测定：累计死亡率（%）=对虾死亡数/对虾总数×100。

2结果

2.1血细胞数量

由图1可见：在投喂对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的7天后，对虾体内血细胞数目显著增加（p<0.05），试验组2在14天达到最高值，试验组1在21天达到最高值。养殖试验结束后，试验组1和试验组2的血细胞数量分别增加19.5%和23.6%，均显著高于对照组（p<0.05），试验组2增加防风多糖投喂量可以进一步升高血细胞数量，但试验组1和试验组2间差异不显著（p>0.05）。

2.2血细胞吞噬活性

由图2可见：在投喂对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂7天后，对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组（p<0.05），在投喂14天到21天期间，试验组2吞噬活性显著高于试验组1（p<0.05），但随着投喂时间增长，在28天后，试验组2和试验组1血细胞吞噬率差异不显著（p>0.05）。

2.3抗菌活性

由图3可见：在投喂对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的7天后，试验组1和试验组2的对虾抗菌活性均显著高于对照组（p<0.05）。随着投喂时间增长，试验组抗菌活性始终保持在较高的水平，试验组2的抗菌活性高于试验组1，但是差异不显著（p>0.05）。

2.4溶菌活性

由图4可见：在投喂对虾中草药复合多糖免疫增强饲料添加剂的7天后，试验组对虾溶菌活性均显著高于对照组（p<0.05）。在投喂14天后，试验组1和试验组2溶菌活性分别达到最大值，在28天养殖试验结束后，试验组2的溶菌活性高于试验组1，但是差异不显著（p>0.05）。

2.5累计死亡率

结果见图5：对照组对虾累计死亡率明显高于各试验组（p<0.05），在前3天，各组死亡数较高并在4天后趋于稳定，攻毒实验结束后，对照组累计死亡率最高达83.2%,试验组1累计死亡率为43.2%，试验组2累计死亡率39.8%，表明投喂添加黄芪多糖、白术多糖和防风多糖的饲料能提高凡纳滨对虾抗弧菌能力。