本发明涉及一种高产花香和果香的油腐乳的制备方法，属于豆制品发酵的技术领域。
背景技术
腐乳是以大豆为主要原料经加工磨浆、制坯、培菌、发酵而制成的调味和佐餐制品。它是我国具有民族特色的传统发酵豆制品，具有营养丰富、质地细腻柔滑、滋味鲜美和诱人食欲的特点，是人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品，在发酵豆制品中占有十分重要的位置。
芳樟醇具有花香的香气，对腐乳的香气贡献大；研究表明红腐乳中芳樟醇的含量为738.24μg/kg，其对红腐乳的香气具有重大贡献(崔晓红,高柳,邓小飞,等.混合菌种发酵红豆腐特征香气成分的鉴定[j].食品与发酵工业,2017,43(2):185-190)。腐乳中毛霉、酵母菌等微生物的协同代谢产生的有机酸和酒精形成各种酯类，构成腐乳的特殊香气(程昌泽.腐乳毛霉的分离、鉴定、发酵性能及其菌丝自溶性研究[d].贵阳：贵州大学，2008)。研究表明从全豆腐乳和传统腐乳中提取和分析挥发性成分，乙酸芳樟酯的含量分别为641.2μg/kg和527.8μg/kg(冉春霞,阚建全.顶空固相微萃取-气质联用技术分析全豆腐乳中的挥发性成分[j].中国调味品，2014，39(12)：105-109)。论文“红豆腐发酵及其挥发性风味成分的研究”中对红豆腐乳和3种不同品牌的市售油腐乳进行风味分析，4种腐乳中芳樟醇的含量依次为303μg/kg、321μg/kg、115μg/kg和200μg/kg，乙酸芳樟酯的含量依次为0μg/kg、32μg/kg、0μg/kg和16μg/kg(卢靖.红豆腐发酵及其挥发性风味成分的研究[d].成都：西华大学，2015)。
云南牟定地区特殊的地理气候条件使得该地区形成了利于油腐乳发酵的独特微生物菌群，使得所生产的油腐乳品质优异而具有浓郁的花香和果香。但是云南牟定地区的油腐乳生产采用自然发酵，杂菌污染严重，产品香气不稳定。
技术实现要素：
为了解决目前存在的问题，本发明提供了一种高产花香和果香的油腐乳的制备方法，所述技术方案如下：一种高产花香和果香的油腐乳的制备方法，所述方法以酸豆腐为原料，喷洒总状毛霉孢子悬浮液至酸豆腐表面进行前发酵，再经过晾晒和盐渍，加入调料进行后发酵；其中所述总状毛霉于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.15264，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264菌丝体长且颜色洁白。
可选的，所述酸豆腐为通过将乳酸菌接种至豆浆中凝胶3-5小时后得到；制备步骤为：先将制成的大豆凝乳搅拌打碎，然后倒入豆腐成型槽中，压制成型。
可选的，所述的总状毛霉孢子悬浮液的浓度为100-110个/ml。
可选的，所述晾晒的时间为10-14小时，所述盐渍的参数为加入5％盐盐渍12-14小时，去除12-18％的水分。
可选的，所述加入调料进行后发酵是将调料与腐乳坯混合均匀，取12块放入玻璃瓶中，加入100ml菜籽油，后发酵90天。
可选的，所述调料包括辣椒和花椒。
可选的，所述压制成型之后还包括：将豆腐切成3.5cm×3.5cm×2.0cm大小。
本发明有益效果是：
通过喷洒总状毛霉孢子悬浮液至酸豆腐表面进行前发酵，其中总状毛霉为保藏编号为cgmccno.15264的总状毛霉，该菌株产芳樟醇和乙酸芳樟酯的能力高，后发酵90天可产9645.14μg/kg芳樟醇和1228.05μg/kg乙酸芳樟酯，使得所制备出的油腐乳具有花香和果香。
生物材料保藏信息：
总状毛霉(mucorracemosus)，于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.15264，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉在酸豆腐上的菌落形态；
图2为总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉在油腐乳发酵过程中芳樟酯含量的变化；
图3为总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉在油腐乳发酵过程中乙酸芳樟酯含量的变化；
图4为总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉制备的油腐乳的感官香气评定结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一：总状毛霉cgmccno.15264的菌种分离鉴定方法
(1)获得合适的稀释梯度并培养
从云南省楚雄州牟定自然发酵的油腐乳中称取25g，加入到装有225ml无菌水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min；然后依次取1ml菌液稀释在9ml无菌水中，将样品匀液(液体样品可包括原液)进行10倍递增稀释，使该样品浓度梯度稀释至10-5，取4个稀释度为102～105的样品匀液(液体样品包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌培养皿内，及时将20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，将培养皿倒置，28℃±1℃培养5d。
(2)分离纯化
用点接法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株。
(3)dna的提取
1)在酒精灯火焰旁取培养基上的菌株于研钵，液氮研磨。
2)将研磨好的菌转移至1.5ml离心管中，标记菌株名称，加入0.6mlte(ph8.0)，用移液枪吸打均匀，使菌体充分悬浮。
3)加入250μl10％sds，轻轻倒转混匀。
4)加入3μl蛋白酶k(20ng/μl)，轻轻混匀，37℃水浴1h。
5)加入150μl5mol/lnacl，轻轻混匀。
6)加入150μl2％ctab，轻轻混匀，65℃水浴20min。
7)12000rpm常温离心20min。
8)小心吸取上清至新的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30min,12000rpm下4℃离心10min。
9)吸掉上清，在吸水纸上空干液体，加入750μl70％乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm下4℃离心2min。
10)每管加入30μl纯化水溶解沉淀(水中加rnase，终浓度10ng/μl)，用手轻弹管壁，4℃溶解过夜。
(4)dna的电泳检测
用1％琼脂糖凝胶和100v电压检测，样品上样量为3μl，marker条带组成：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；750bp条带浓度为60ng/3μl。
(5)pcr扩增
18s引物序列:
its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(seqidno:1)；
its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno:2)；
反应体系如表1所示，反应条件如表2所示：
表1：反应体系：
表2：反应条件：
(6)上机测序，输出峰图
(7)its序列分析鉴定
根据华大基因科技股份有限公司武汉分公司给出的测序报告，结合blast分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的毛霉its序列与genbank/embl/ddbj)数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，经分析鉴定为总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264。总状毛霉cgmccno.15264菌落为白色大菌落，菌落边缘呈绒毛状，表面干燥；菌丝形态特征：菌丝无假根，菌丝均无横隔，孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，单轴分枝，全部顶生孢子囊；孢子囊大，椭球形，含孢子甚多孢子；孢子近似圆形，大小为3-6μm。
实施例二：总状毛霉cgmccno.15264发酵油腐乳
总状毛霉cgmccno.15264能够用于油腐乳的发酵，可提高芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量，增强油腐乳花香和果香。
1、总状毛霉cgmccno.15264在油腐乳发酵过程中芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量变化
(1)gc-ms测定油腐乳发酵过程中芳樟醇及乙酸芳樟酯的含量
色谱条件为：rtx-wax毛细管柱；柱子规格：30m×0.25μm×0.25mm，进口温度为230℃，柱流速1ml/min，载气为氦气；程序升温：起始温度45℃(保持1min)，以5℃/min升至185℃(保持1min)，10℃/min升至240℃(保持8min)。
质谱条件为：离子化方式ei，电子能量为70ev，离子源温度230℃，接口温度240℃，质荷比30-440。
(2)油腐乳的发酵
1)总状毛霉cgmccno.15264孢子悬浮液的制备：将-80℃保存的本发明总状毛霉cgmccno.15264接种于pda培养基上，在28℃下培养3天，传代培养3次。取霉菌孢子制成105个/ml的孢子悬浮液(采用光学显微镜计数)，接种至pda的液体培养基中，在28℃下培养4天，；采用无菌的0.85％生理盐水将孢子悬浮液稀释为105个/ml。
2)酸豆腐的制备：选择干燥、颗粒饱满的新鲜大豆，除去杂质，加水量为大豆体积的2-3倍浸泡12小时；浸泡后的大豆沥水后洗净，将洗净的大豆另加净水碾碎，豆水比为1:8-1:10，磨浆过滤，收集豆浆；原豆浆进行加热至沸腾并保持5-10min。待豆浆冷却至58℃左右，江乳酸菌接种至豆浆中凝胶4小时，先将制成的大豆凝乳搅拌打碎，然后倒入豆腐成型槽中，压制成型。将豆腐切成3.5cm×3.5cm×2.0cm备用。
3)油腐乳的前发酵：将105个/ml总状毛霉cgmccno.15264孢子悬浮液喷洒至豆腐上，在25℃、相对湿度为90％左右的环境中培菌3天。
4)晾晒、盐渍：去除15％左右的水分。
5)油腐乳的后发酵：将辣椒、花椒等调料与腐乳坯混合均匀，取12块放入玻璃瓶中，加入100ml菜籽油，后发酵90天。
分别在前发酵0天、前发酵4天、晾晒、盐渍、后发酵0天、后发酵30天、后发酵90天取2瓶样品，测其挥发性风味物质含量变化。
(3)总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉在酸豆腐上前发酵4天的菌落形态；其中生产用总状毛霉，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc40491。
总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉在酸豆腐上前发酵4天的菌落形态见图1。
由图1可知，将总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264接种到酸豆腐上4天后，菌丝呈白色且密集；将生产用总状毛霉接种到酸豆腐上4天后，菌丝为大部分白色、部分为黄色，较为密集。
(4)油腐乳发酵过程中芳樟醇及乙酸芳樟酯的含量变化
油腐乳发酵过程中芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量变化分别见图2和图3。随着发酵时间的延长，芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量逐渐增加；且在后发酵90天后，总状毛霉cgmccno.15264发酵油腐乳中芳樟醇的含量为96454μg/kg，而和生产用总状毛霉的为3951μg/kg；总状毛霉cgmccno.15264发酵油腐乳中乙酸芳樟酯的含量1228μg/kg，而生产用总状毛霉的为322μg/kg。
2、总状毛霉cgmccno.15264在油腐乳的香气感官评定
对总状毛霉(mucorracemosus)cgmccno.15264和生产用总状毛霉制备的油腐乳进行定量的香气感官评定，香气感官评定标准见表3，结果见图4。
表3香气评分标准
实验结果表明cgmccno.15264发酵制备的油腐乳咸香、油香和果香显著；由于油腐乳的生产过程为纯菌发酵，具有显著的可控性，故降低了其过度发酵可能性，最终产品的霉味不显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110>江南大学
<120>一种高产果香和花香的油腐乳的制备方法
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