一种高效水产糖代谢调控组合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种高效水产糖代谢调控组合物及其制备方法与应用。

背景技术：

三大营养物质中，糖类最为廉价。在饲料中添加适量糖类不仅可以节约蛋白质和脂肪的用量，降低饲料成本，还可以降低蛋白质的分解代谢，减少鱼类的氨氮排放量，进而减轻对水体的污染。然而与哺乳动物相比，鱼类利用糖类作为能源物质的能力是有限得。饲料中过高的糖水平不仅会对其生长性能造成严重的负面影响，还会导致代谢功能障碍，进而损伤免疫机能。鉴于此，探讨其糖代谢障碍机制并寻求科学有效的手段改善鱼类糖代谢机能，将有助于提高生产饲料中糖的利用率。前期的研究表明，鱼类糖代谢功能障碍可能是由其胰岛β细胞功能受损、胰岛素与其受体亲合力低下以及组织胰岛素敏感性低下等因素综合所致。基于此，开发相应的糖代谢调控剂将会在一定程度上改善鱼类的糖代谢机能进而提高其对饲料中糖类的利用率，降低饲料成本。

目前，有关鱼类糖代谢调控剂的开发报道甚少，且大多集中于西药的降糖效果研究上，对营养素、营养素配体以及植物活性成分等的研究尚较缺乏。然而，西药在使用过程中易产生耐药性、毒副残留和食品安全等问题，限制了其在饲料中的应用。白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，被认为是植物受到病原性进攻或环境胁迫时产生的一种抗毒素物质。诸多研究表明，其可通过激活沉默信息调节因子2相关酶1(sirt1)来改善胰岛素磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)-蛋白激酶b(akt)信号转导通路，从而增强胰岛素靶组织对葡萄糖的处理，降低血糖。此外，白藜芦醇还可以通过促进活化的腺苷酸激活蛋白激酶(ampk)与解偶联蛋白2(ucp2)启动子区域结合，直接抑制ucp2活性，从而增加由葡萄糖刺激的胰岛素的分泌量。沙棘籽黄酮是从胡颓子科植物沙棘种子中获得的一种富集黄酮类成分的活性提取物。其被证实可通过激活ampk信号通路，提高机体内细胞对葡萄糖的处理能力。另外，它还能通过抑制核因子κb(nf-κb)，丝裂原活化蛋白激酶(p38mapk)信号通路以及cxc趋化因子配体10(cxcl10)，白介素6(il-6)炎症因子mrna的表达，缓解体内组织的胰岛素抵抗作用。与此同时，作为重要的饲料原料，小麦麸皮不仅含有丰富的膳食纤维和蛋白质等，而且还具有多种酚酸类活性物质成分。经证实，其充分酶解后的活性产物对生物体的糖脂代谢活动有诸多益处。例如，哺乳动物摄食一定量的甘露糖后可显著增加葡萄糖激酶(gk)的活性，从而有效地改善糖代谢紊乱及胰岛素抵抗症状。由此可见，尽管以上三种生物活性物质存在结构差异，但均能通过不同的生物途径来调控机体的糖代谢机能。如果能够开发出一种高效水产糖代谢调控组合物，发挥它们之间的协同作用，将会大大降低鱼类饲料中蛋白及脂肪物质的使用量，进而有利于促进低蛋白高能量饲料的生产。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，以白藜芦醇、沙棘籽黄酮及小麦麸皮等为对象，充分结合酶解技术，开发出一种高效水产糖代谢调控组合物，以提高鱼类胰岛β细胞功能，促其胰岛素分泌及改善组织胰岛素敏感性，进而有效地增强鱼类对饲料中糖类的利用率。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种高效水产糖代谢调控组合物，它包括如下重量份数的组分：

白藜芦醇3～25份；

沙棘籽黄酮2～20份；

小麦麸皮酶解产物470～490份。

优选地，所述高效水产糖代谢调控组合物包括如下重量份数的组分：

白藜芦醇8～15份；

沙棘籽黄酮2～10份；

小麦麸皮酶解产物475～490份。

最优选地，所述高效水产糖代谢调控组合物包括如下重量份数的组分：

白藜芦醇10份；

沙棘籽黄酮4份；

小麦麸皮酶解产物486份。

其中，所述小麦麸皮酶解产物通过如下方法制备：

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:2～8:2～10混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比1～5:8～20均匀混合，密封经35～40℃水浴酶解8～24h；酶解液经120℃灭菌后离心，取上清液旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。

其中，β-甘露聚糖酶的酶活范围是40000～50000u/g，酶活定义：在37℃，ph值为5.5的条件下，每分钟从浓度为9mg/ml的甘露聚糖溶液生成1umol甘露糖所需要的酶量。

阿魏酸酯酶的酶活范围是70～90u/g，酶活定义：在40℃，ph值为4.4条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量。

纤维素酶的酶活范围是40～80u/g，酶活定义：在37℃，ph值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量。

优选地，所述小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖含量在35％以上，阿魏酸含量在28％以上。

所述离心的转速为3000～5000r/min，离心时间为30～60min。

所述旋转蒸发的温度为80～110℃。

本发明还提供上述高效水产糖代谢调控组合物的制备方法，将配方量的白藜芦醇、沙棘籽黄酮和小麦麸皮酶解产物分别预先经粉碎过120目筛，然后混合均匀即得。需要指出的是，本发明制备方法不需要限定混合顺序和混合方式，只要保证该三种物质混合均匀即可。

其中，所述沙棘籽黄酮在粉碎和混合时避免光照和高温，所述高温是指大于50℃。

上述高效水产糖代谢调控组合物在水产养殖中的应用也在本发明的保护范围中，尤其是在鱼类养殖中的应用，特别是团头鲂鱼和鲤鱼。该高效水产糖代谢调控组合物在饲料中添加量比为0.6～1.5wt％，可根据鱼类的生长阶段、规格和养殖方式等的不同略有更改。

有益效果：

1、该饲料添加剂以白藜芦醇、沙棘籽黄酮及小麦麸皮酶解产物为原料，充分利用不同生物结构的植物活性成分进行科学配伍以发挥协同作用，通过深入研究掌握了其的适宜作用剂量以及其对团头鲂和鲤鱼糖代谢机能的调控作用和机制，具有较强的针对性；

2、本发明结合相关养殖试验的生长及理化指标结果，证明了该饲料添加剂可显著改善鱼类胰岛β细胞功能，进而提高胰岛素的分泌和释放；可显著降低鱼类餐后血糖水平，并缩短高血糖症状持续，减轻或避免胰岛素抵抗的出现，降低机体代谢负担；可显著提高鱼类的糖耐受性，提高其对饲料中糖类的利用率，进而提高饲料利用率并降低饵料系数；可显著降低鱼类组织糖原合脂肪含量，避免因糖原和脂肪过度积累引起代谢紊乱；可降低饲料中脂肪和蛋白质用量，进而降低饲料生产成本。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是不同饲料对团头鲂幼鱼的增重率的影响；

图2是不同饲料的团头鲂幼鱼饵料系数；

图3是不同饲料对鲤鱼肝脏atp含量的影响；

图4是不同饲料对鲤鱼肝脏amp含量的影响；

图5是不同饲料对鲤鱼肝脏ampkα1表达水平的影响；

图6是不同饲料对鲤鱼肝脏ampkα2表达水平的影响；

图7是不同饲料对鲤鱼葡萄糖耐受的影响，其中，小写字母表示同一日粮组，不同采样时间点间的统计学差异。*表示同一采样时间点，不同日粮组之间的统计学差异。nsp>0.05,*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

以下实施例中，除小麦麸皮酶解产物外，植物提取物白藜芦醇和沙棘籽黄酮均为市售产品。β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶各自的酶活是40000u/g、74u/g和53u/g。

实施例1

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:2:10混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比1:20均匀混合，密封经40℃水浴酶解24h；酶解液经120℃灭菌后经转速5000r/min，时间为60min离心，取上清液在温度为110℃旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。通过液相色谱方法测得小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖质量含量大于35％，阿魏酸质量含量大于28％。

实施例2

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:3:8混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比2:18均匀混合，密封经35℃水浴酶解24h；酶解液经120℃灭菌后经转速5000r/min，时间为30min离心，取上清液在温度为100℃旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。通过液相色谱方法测得小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖质量含量大于38％，阿魏酸质量含量大于30％。

实施例3

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:5:6混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比2:15均匀混合，密封经40℃水浴酶解12h；酶解液经120℃灭菌后经转速3000r/min，时间为60min离心，取上清液在温度为100℃旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。通过液相色谱方法测得小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖质量含量大于42％，阿魏酸质量含量大于33％。

实施例4

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:7:4混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比4:10均匀混合，密封经40℃水浴酶解12h；酶解液经120℃灭菌后经转速3000r/min，时间为30min离心，取上清液在温度为110℃旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。通过液相色谱方法测得小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖质量含量大于41％，阿魏酸质量含量大于32％。

实施例5

将β-甘露聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶按照质量比1:8:2混合，制成混合酶制剂；随后与去淀粉小麦麸皮按照质量比5:8均匀混合，密封经40℃水浴酶解8h；酶解液经120℃灭菌后经转速3000r/min，时间为30min离心，取上清液在温度为80℃旋转蒸发后即得小麦麸皮酶解产物。通过液相色谱方法测得小麦麸皮酶解产物中，甘露聚糖质量含量大于37％，阿魏酸质量含量大于31％。

实施例6

将白藜芦醇、沙棘籽黄酮和实施例3制备得到的小麦麸皮酶解产物分别粉碎并过120目筛，备用；然后采用逐级混匀的方式将过筛后的白藜芦醇4g、沙棘籽黄酮20g和小麦麸皮酶解产物476g混合均匀，混合时要保证混合物的均一稳定，即制得500g该饲料添加剂。

实施例7

将白藜芦醇、沙棘籽黄酮和实施例3制备得到的小麦麸皮酶解产物分别粉碎并过120目筛，备用；然后采用逐级混匀的方式将过筛后的白藜芦醇8g、沙棘籽黄酮16g和小麦麸皮酶解产物476g混合均匀，混合时要保证混合物的均一稳定，即制得500g该饲料添加剂。

实施例8

将白藜芦醇、沙棘籽黄酮和实施例3制备得到的小麦麸皮酶解产物分别粉碎并过120目筛，备用；将过筛后的白藜芦醇10g与沙棘籽黄酮4g混合均匀后，逐渐添加到486g过筛后的小麦麸皮酶解产物中，添加的同时不断搅拌，混合，保证混合物均一稳定，即制得500g该饲料添加剂。

实施例9

将白藜芦醇、沙棘籽黄酮和实施例3制备得到的小麦麸皮酶解产物分别粉碎并过120目筛，备用；然后采用逐级混匀的方式将过筛后的白藜芦醇15g、沙棘籽黄酮10g和小麦麸皮酶解产物475g混合均匀，混合时要保证混合物的均一稳定，即制得500g该饲料添加剂。

实施例10

将白藜芦醇、沙棘籽黄酮和实施例3制备得到的小麦麸皮酶解产物分别粉碎并过120目筛，备用；将过筛后的白藜芦醇25g与沙棘籽黄酮2g混合均匀后，逐渐添加到473g过筛后的小麦麸皮酶解产物中，添加的同时不断搅拌，混合，保证混合物均一稳定，即制得500g该饲料添加剂。

实施例11

团头鲂幼鱼(50～150g)养殖试验及结果分析：

养殖试验在南京农业大学特种经济动物与水产系的室内循环养殖系统中进行，所用动物为团头鲂幼鱼。试验团头鲂取自江苏扬州国家级水产原种场。挑选240只体格健壮、规格整齐的幼鱼(初重：62.41±0.53g)随机分入12个室内可循环水箱(规格:480l)中，每箱20尾。其中，1)对照组投喂基础饲料，糖含量为33％；2)高糖组投喂高糖饲料，糖水平为45％；3)高糖+添加剂组，投喂高糖饲料+1.0％实施例8制作的饲料添加剂。饲料配方如表1所示。

试验期为7月初至10月初，共12周。试验期间观察团头鲂幼鱼的摄食和生长情况，养殖试验结束后采集样品进行下一步的分析测定，具体结果如图1、2和表2所示。

表1试验饲料配方

表2不同饲料对团头鲂幼鱼组织和血液生化指标的影响

注：同行数据上标含相同字母者差异不显著。

由图1、2和表2可知，高糖组的增重率与对照组之间均无显著差异(p>0.05)，但其肝体比、腹脂率、肝和肌糖原含量、血糖水平、胰岛素含量、胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗指数均显著高于对照组(p<0.05)。且高糖+添加剂组进一步增加了胰岛素含量和胰岛β细胞功能，但饵料系数、肝体比、腹脂率、肝糖原含量、血糖水平和胰岛素抵抗指数显著低于高糖组。这表明，使用添加有实施例1制备的糖代谢调控物的饲料不会对鱼类的生长性能造成负面影响，而且会提高其对饲料中糖类的利用率，进而降低了饵料系数。此外，使用糖代谢调控物显著降低肝脏糖原沉积，并防止了肝脏肿大现象的产生。此外，通过血浆生化指标结果表明使用添加有实施例8制备的糖代谢调控物的饲料养殖后，可以显著改善鱼体胰岛β细胞功能、促进胰岛素的分泌和释放、提高机体胰岛素敏感性并降低胰岛素抵抗程度，最终降低了血糖水平并提高机体的葡萄糖耐受性。

实施例12

鲤鱼养殖试验及结果分析：

养殖试验在南京农业大学水产教学科研基地(南京市浦口区星甸镇)开展。经过暂养后，360尾体格健壮规格整齐的鱼(初重：65.3±0.67g)随机分为三个实验组，即对照组、高糖组和高糖+添加剂组(与实施例11相同)。每组4个网箱(规格：2.0m×1.0m×1.0m)，每个网箱30尾鱼。饲料配方同表1所示。经过3个月的网箱养殖，采集血液及肝脏样品进行指标测定，结果见表3和图3～6。随后用7个循环养殖缸进行葡萄糖耐受试验，结果见图7。相关流程如下：每个缸四位鱼分别称重后注射1.67mg/kg体重的葡萄糖溶液，分别在1，2，4，8和12小时进行血液样品采集。

表3不同饲料对鲤鱼生长性能和血液生化指标得影响

注：同行数据上标含相同字母者差异不显著。

由表3可知，经过3个月的养殖试验后，高糖组鲤鱼的增重率显著低于正常组(p<0.05)，而高糖组肝体比、肝糖原和肌糖原含量、血糖水平和血糖半衰期等均显著升高(p<0.05)，表明长期饲喂高糖饲料可导致其肝脏肿大、组织糖原沉积、血糖升高而血糖调节能力降低。然而，高糖+添加剂组的生化指标均显著优于高糖组(p<0.05)，且其血糖清除能力也显著提高(p<0.05)，并和正常组相比无显著差异(p>0.05)。此外，添加1.0wt％调控物可以显著提高血浆胰岛素水平(p<0.05)。这表明，在高糖饲料中添加由实施例1制备的糖代谢调控物可以在一定程度上改善高糖胁迫鲤鱼的生长性能、显著降低其的血糖水平、改善机体血糖清除能力、降低其血糖半衰期、促进胰岛素分泌、降低由高糖饲料导致的代谢紊乱，最终提高水产养殖的经济效益。

由图3～6可知，高糖组的肝脏中atp和amp含量显著高于对照组(p<0.05)，但ampkα1和ampkα2表达水平与其相反。高糖+添加剂组进一步增加了肝脏中amp含量及ampkα1和ampkα2表达水平，但atp含量显著低于高糖组(p<0.05)。说明，高糖组显著抑制了ampk的活性，而添加剂的补充激活了ampk。

由图7可知，葡萄糖负荷后，各组血液中葡萄糖含量的最大值均在2小时处出现，且随注射时间的增加呈现下降趋势。在2小时，高糖+添加剂组的血糖含量显著低于其他组，且12小时回到基础值。说明高糖+添加剂组具有较高的葡萄糖耐受能力。

实施例13

团头鲂幼鱼(70～180g)养殖试验及结果分析：

将单一白藜芦醇15g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂i；

将单一沙棘籽黄酮10g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂ii；

将单一小麦麸皮酶解产物483g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂iii；

将白藜芦醇15g和沙棘籽黄酮10g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂iv；

将白藜芦醇15g和小麦麸皮酶解产物483g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂v；

将沙棘籽黄酮10g和小麦麸皮酶解产物483g粉碎并过120目筛，即制得饲料添加剂vi。

实施例8制备得到的饲料添加剂vii。以上七种均为后续验证试验使用添加剂。

养殖试验在南京农业大学特种经济动物与水产系的室内循环养殖系统中进行，所用动物为团头鲂幼鱼。试验团头鲂取自江苏扬州国家级水产原种场。挑选210只体格健壮、规格整齐的幼鱼(初重：102.31±1.42g)随机分入21个室内可循环水箱(规格:240l)中，每箱10尾。其中，1)高糖+添加剂i组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂i；2)高糖+添加剂ii组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂ii；3)高糖+添加剂iii组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂iii；4)高糖+添加剂iv组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂iv；5)高糖+添加剂v组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂v；6)高糖+添加剂vi组，投喂高糖饲料+1.0％制作的饲料添加剂vi；7)高糖+添加剂vii组，投喂高糖饲料+1.0％实施例8制作的饲料添加剂vii。饲料配方如表1所示。

试验期为8月初至10月，共12周。试验期间观察团头鲂幼鱼的摄食和生长情况，养殖试验结束后采集样品进行下一步的分析测定，具体结果如表4所示。

表4不同饲料对团头鲂幼鱼组织和血液生化指标的影响

注：同行数据上标含相同字母者差异不显著。

由表4可知，vii组的增重率、胰岛素含量、胰岛β细胞功能和胰岛素敏感性指数显著性高于其他试验各组(p<0.05)，但其饵料系数、肝体比、腹脂率、血糖水平及胰岛素抵抗指数均显著低于其他各实验组(p<0.05)。这表明，由三种物质组合而制得的饲料添加剂在提高鱼类生长性能方面，具有协同作用。同时，三种物质组合而制得的饲料添加剂能够显著性提高鱼类的饲料利用率。此外，使用三种物质组合而制得的饲料添加剂能够显著降低肝脏糖原沉积，其进一步防止由高碳水化合物饲料所引起的肝脏肿大现象。另外，通过血浆生化指标结果进一步明确了使用添加有实施例8制备的糖代谢调控物的饲料后，其在改善鱼体胰岛β细胞功能、促进胰岛素的分泌和释放、提高机体胰岛素敏感性并降低胰岛素抵抗程度方面，能够显著性优于优于单一或任意二种物质组合而制得的饲料添加剂。

本发明提供了一种高效水产糖代谢调控组合物及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。