本发明涉及水产饲料
技术领域：
，具体而言，涉及一种富硒发酵型组合物以及制备方法、应用和饲料。
背景技术：
：目前，水产饲料中广泛使用的蛋白质饲料源除鱼粉、骨肉粉、蚕蛹等动物性蛋白外，还有菜籽粕、豆粕、棉籽粕、次粉等植物性蛋白。近年来，由于蛋白质饲料资源严重短缺，价格昂贵，已成为养殖业发展的主要制约因素。此外，现有的水产饲料在提高鱼体生长机能方面的性能还有待提高。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种富硒发酵型组合物，该富硒发酵型组合物可用于代替传统水产饲料中的鱼粉，节约成本，其采用该富硒发酵型组合物投喂鱼体，可以提高鱼体的生长机能。本发明的另一目的在于提供一种制备上述富硒发酵型组合物的方法，该方法可以制备出可代替传统水产饲料中的鱼粉的富硒发酵型组合物，采用该富硒发酵型组合物投喂鱼体，可以提高鱼体的生长机能。本发明的另一目的在于提供上述的富硒发酵型组合物在水产养殖中的应用。本发明的另一目的在于提供一种水产饲料或药物，采用该水产饲料或药物可用于水产养殖中，提高鱼体的生长机能。本发明是这样实现的：一方面，本发明提供了一种富硒发酵型组合物，其由富硒酵母培养液与植物叶发酵培养基混合经发酵后制得；其中，所述富硒酵母培养液含有：酿酒酵母和嗜酸乳杆菌；所述植物叶发酵培养基包括：含有植物叶粉末的植物叶发酵原料；所述植物叶粉末由辣木叶、银杏叶和构树叶混合经粉碎后制得。辣木(moringaoleifera)是一种有独特经济价值且尚未充分开发的多功能热带植物。辣木叶具有增强免疫力、调节血压、降低血糖、抑制病菌等功效。辣木食用历史悠久，营养丰富。辣木干叶粉中粗蛋白质含量为25％左右，约含有20种氨基酸，46种抗氧化剂，36-90种抗炎化合物，以及多种维生素(维生素a、b、c、e)和多糖，钙、镁、铁、钾等矿物质含量丰富，且抗营养因子少，低纤维，符合优质蛋白质饲料的标准。此外，由于辣木生长速度快、适应性广、抗逆性强，很少有病虫灾害发生。但是，目前应用于水产、畜牧养殖领域的辣木叶生物发酵饲料及添加剂相关产品还未见任何报道。银杏(ginkgobiloba)为我国特产植物，是一种重要的传统药用植物。世界上70％以上的银杏树生长于我国。据不完全统计，我国银杏叶年产量在4万吨以上。近年来，随着我国银杏产品的精深加工和开发利用，充分地带动了银杏产业的发展。研究表明，银杏叶拥有独特的多种活性成分。这些生物活性物质主要是黄酮类化合物和萜类化合物(银杏内酯b和白果内酯)。其中，黄酮类化合物含量较高，约为2.5％～2.9％，是银杏叶提取物(egb)的主要药用部分。黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，系植物体多酚类的代谢物，具有c3-c6-c3的基本结构，主要是单黄酮(monoflavones)、黄酮醇(flavonols)及其甙类；双黄酮(bioflavones)及儿茶素类(latechines)等。黄酮类有效成分为黄酮苷(flavonoidgycosides)，主要是山萘酚(kaempferol)和槲皮素(quercetin)的葡萄糖异鼠李糖甙(gucorhamnosideesters)。它们通常与糖苷结合，是极好的天然抗氧化剂。目前已从银杏叶中分离出了38种黄酮类化合物。lebars等研究表明，银杏叶中含有的黄酮类化合物、萜类化合物和有机酸类使其具有抗氧化的特性和清除自由基的药理活性。银杏叶作为一种新型饲料添加剂，以其绿色环保、使用安全等特点正逐步引起国际饲料和养殖界的广泛关注，显示出较大的研究开发前景。银杏叶发酵后的产物可以使原来不易消化吸收的大分子物质经微生物的转化变成小分子后易于肠粘膜吸收，使血液中的有效成分迅速达到有效浓度，可以更好的提高动物的生产性能和肉品质。构树为桑科构树属成员，广泛分布于我国华北、华中、华南、西南、西北各省区，尤其是南方地区极为常见。作为动物饲料而言，构树叶的优势十分突出：蛋白质含量高达20％-30％，氨基酸、维生素、碳水化合物及微量元素等营养成分也十分丰富；采用构树叶为主要原料发酵制成的饲料，绿色环保，不含农药或激素，适口性好，清香味正，猪采食后饲料消化率达80％以上；提高肉猪的生长速度，增强其抗病力，缩短饲养周期，此外，还能改善猪肉的肉质。本发明提供的富硒发酵型组合物，其由富硒酵母培养液与植物叶发酵培养基混合经发酵后制得，植物叶发酵培养基的植物叶中含有优质蛋白和植物功能因子例如多酚和黄酮类化合物，再通过微生物发酵、现了复合益生菌、植物性多酚和黄酮类化合物与硒元素三者的有机组合，充分发挥了增强鱼体生长机能的特点例如增强免疫力和抗氧化能力、促进消化、降低了发病率和死亡率等，从而有利于提高养殖的鱼体的生产性能和养殖效益。进一步地，在发明的一些实施方案中，按重量份计，所述植物叶粉末由40-50份辣木叶、20-30份银杏叶和30-40份构树叶混合经粉碎后制得。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述植物叶粉末通过如下方法制成：按重量份计，将40-50份辣木叶、20-30份银杏叶和30-40份构树叶分别于50～60℃下烘干1～2个小时后，粉碎，过40-80目筛网后混合制得。进一步地，在发明的一些实施方案中，植物叶发酵原料还含有麸皮和玉米芯。进一步地，在发明的一些实施方案中，植物叶发酵原料由植物叶粉末、麸皮和玉米芯按质量比为(7-9):(1.2-1.8):(0.3-0.7)的比例混合得到。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述植物叶发酵培养基还包括营养盐溶液；所述营养盐溶液含有：葡萄糖、尿素、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁以及硫酸铵。进一步地，在发明的一些实施方案中，按质量百分比计，所述营养盐溶液含有：葡萄糖1.5-2.5％(wt/v)、尿素0.8-1.2％(wt/v)、蛋白胨0.3-0.7％(wt/v)、磷酸二氢钾1.5-2.5％(wt/v)、硫酸镁0.3-0.7％(wt/v)以及硫酸铵2.5-3.5％(wt/v)，所述营养盐溶液的ph为6-7。进一步地，在发明的一些实施方案中，植物叶发酵培养基由上述植物叶发酵原料与上述营养盐溶液按质量体积比(g:ml)为(0.8-1.2):(1.6-2)的比例混合后经灭菌制得。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述植物叶发酵培养基中还添加有混合菌液，所述混合菌液含有：黑曲霉菌、里氏木霉菌和产朊假丝酵母菌。在植物叶发酵培养基中添加黑曲霉菌、里氏木霉菌和产朊假丝酵母菌等三种菌，通过微生物发酵处理后，这些微生物在代谢过程中产生的纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶进入培养基，从而引起植物细胞破裂，其有效成分得以暴露出来，而且发酵过程中，微生物产生的各种酶能将不易为人体吸收的大分子有效物质降解为易为人体吸收的小分子有效物质，同时能去除多种大分子杂质，从而增强药效；甚至经微生物的发酵作用产生新的活性物质，使得鱼体食用后，其生长机能能够得到有效提高。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述混合菌液中的黑曲霉菌、里氏木霉菌和产朊假丝酵母菌的菌体数量比(各菌种的总菌体数量比)为(1-2):(1-2):(2-4)，所述植物叶发酵培养基添加的所述混合菌液的量为8-12％(wt)即每100g植物叶发酵培养基添加8-12g混合菌液。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述混合菌液由黑曲霉菌发酵液、里氏木霉菌发酵液和产朊假丝酵母菌发酵液按菌体数量比为(1-2):(1-2):(2-4)的比例混合制成。进一步地，在发明的一些实施方案中，上述曲霉菌发酵液、上述黑曲霉菌发酵液、里氏木霉菌发酵液和上述产朊假丝酵母菌发酵液的活菌数均为2.0×1010个/ml。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述富硒酵母培养液中的酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的菌体数量的比例为(2-3):1。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述富硒酵母培养液通过如下方法制成：将麦芽和水按质量比1:3～1:5的比例混合，然后在55-60℃下保温糖化3-4h，过滤后，煮沸滤液，冷却至室温并澄清，得到麦芽汁；在麦芽汁中，按9～11％(wt)、的比例加入浓度为4～6mg/ml亚硒酸钠浓溶液，再加入含有酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的混合菌液，即得富硒酵母培养液。进一步地，在发明的一些实施方案中，接种后酿酒酵母在富硒酵母培养液的菌体终浓度为1～3×1010个/ml，嗜酸乳杆菌的菌体终浓度为1～3×1010个/ml。另一方面，本发明提供了一种制备上述富硒发酵型组合物的方法，其包括：将富硒酵母培养液与植物叶发酵培养基混合，进行发酵，得到的发酵产物经干燥、粉碎后，即得富硒发酵型组合物。进一步地，在发明的一些实施方案中，富硒酵母培养液与植物叶发酵培养基混合的体积质量比(ml:g)例为(1-2):(8-12)。进一步地，在发明的一些实施方案中，发酵条件为：于28～30℃条件下厌氧发酵70-74h。进一步地，在发明的一些实施方案中，干燥的温度为35～50℃。另一方面，本发明提供了上述富硒发酵型组合物在制备用于提高鱼体生长机能的饲料添加剂或药物或饲料中的应用。进一步地，在发明的一些实施方案中，提高鱼体生长机能是指提高鱼体以下能力中的一种或几种：提高鱼体的生长速度、提高鱼体的肝脏抗氧化能力、提高鱼体的免疫力和提高鱼体的肠道消化能力。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述鱼体为异育银鲫、罗非鱼、鲤鱼、草鱼或黑鱼。另一方面，本发明提供了一种水产饲料或药物，其包括上述的富硒发酵型组合物。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述富硒发酵型组合物在的水产饲料中的含量在5％以上。进一步地，在发明的一些实施方案中，所述富硒发酵型组合物在的水产饲料中的含量为5％-15％。综上，本发明的富硒发酵型组合物将富含优质蛋白的植物叶资源通过科学复配后进行微生物发酵，实现了复合益生菌、植物性多酚和黄酮类化合物与硒元素三者的有机组合，充分发挥了增强机体的免疫力和抗氧化能力的特点，促进消化、降低了发病率和死亡率，从而提高异育银鲫的生产性能和养殖效益。且不存在耐药性问题，降低了饲料成本。本发明组方合理，制备方法简单，该组合物无毒副作用、无污染、无药物残留、无耐药性，提高硒的生物利用效率。能够节约昂贵的鱼粉用量，提高鱼体例如异育银鲫的生长机能例如免疫力和抗氧化功能；通过复合有益微生物、有机硒与植物性原料中多酚和黄酮类化合物等活性物质，将三者有机结合，进行无机硒和黄酮类等化合物的生物转化，使得产品多种活性成分合一，富硒发酵型组合物中可利用的蛋白含量高达28％，应用于水产养殖领域，不但可以减少鱼粉用量，还可同时发挥多重作用例如提高鱼体的生长速度、提高鱼体的肝脏抗氧化能力、提高鱼体的免疫力和提高鱼体的肠道消化能力等，是一种安全、无残留、节约型的新型绿色饲料添加剂，符合现代养殖的需求。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了制备富硒发酵型组合物的方法，其包括如下步骤：(1)富硒酵母培养液制备：将麦芽和水按质量比(g：g)1:4混合，然后在55℃保温糖化4h，再过滤煮沸滤液，最后冷却至室温并澄清；在麦芽汁中加入10％(wt)(100g麦芽汁加入10g亚硒酸钠浓溶液)的预杀菌的亚硒酸钠浓溶液，该亚硒酸钠溶液浓度为5mg/ml，然后接入含有酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的混合菌液(酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的菌体数量比例为2:1)，接种后酿酒酵母的终浓度为2×1010个/ml，嗜酸乳杆菌的终浓度为1×1010个/ml。(2)植物叶发酵培养基的制备：将植物叶发酵原料与营养盐溶液按1.0g:1.8ml的配比混合后，在121℃下灭菌50min，得到植物叶发酵培养基。植物叶发酵原料的制备方法为：按质量份计，取辣木叶45份、银杏叶25份和构树叶30份分别于60℃下烘干2个小时后，粉碎，过60目筛网混合备用，得到植物叶粉末；按植物叶粉末:麸皮:玉米芯＝8:1.5:0.5的质量(g；g:g)比混匀得植物叶发酵原料。所用的营养盐溶液的制备方法如下：按葡萄糖2.0％(wt/v)、尿素1.0％(wt/v)、蛋白胨0.5％(wt/v)、磷酸二氢钾2.0％(wt/v)、硫酸镁0.5％(wt/v)、硫酸铵3.0％(wt/v)、依次称取各组分，并溶解于水中，配成ph7的营养盐溶液。(3)植物叶发酵培养基接种以黑曲霉、里氏木霉和产朊假丝酵母菌为菌种，将菌种用液体种子培养法分别进行扩大培养，方法：30℃、150rpm下震荡培养，28℃±1℃下培养30h；将培养好的一级种子液接种到二级种子发酵罐中进行扩大培养，达到32h停止培养，备用；扩大培养后，调整各菌液的活菌数至2.0×1010个/ml，按照黑曲霉：里氏木霉：产朊假丝酵母菌的菌体数量比为1:1:2的比例制成混合菌液即混合菌液中的黑曲霉菌、里氏木霉菌和产朊假丝酵母菌的菌体数量比为1:1:2，按10％(wt)的比例接种到植物叶发酵培养基中；(4)富硒发酵：将富硒酵母培养液和接种的植物叶发酵培养基进行混合，比例(ml:g)为1:10，然后在30℃密闭厌氧发酵70h，每隔24小时搅拌一次；(5)发酵产物后处理；将厌氧发酵完成后的发酵物在50℃条件下干燥后，粉碎，检验合格、包装即得本实施例的富硒发酵型组合物。(6)检测结果经检测，富硒发酵型组合物含有：粗蛋白含量28％，有机硒含量为7.55mg/kg，总有益菌数4.66×1011个/ml，黄酮类化合物含量为2.4％。试验例验证实施例1制得的富硒发酵型组合物提高鱼体生长机能1材料与方法1.1试验分组动物与饲养管理试验用鱼为异育银鲫鱼苗，正式试验开始前，饲喂与基础日粮成分相近的商业饲料，进行为期十天的驯养。本试验的条件贴近实际养殖条件，试验场地位于人工湖的工作平台上，采用1*1*1米的网箱养殖，养殖用水为湖里的天然水体，每隔一周进行消毒一次。试验开始时，选取健康，体重接近的异育银鲫300尾，采用单因子随机区组试验设计，分成四个处理组，1组为基础日粮组，2，3和4组分别在基础日粮的基础上添加比例为5％、10％和15％的本发明所述的发酵型高蛋白富硒植物性饲料，并逐渐减少鱼粉的用量，每个试验组均有3个重复的网箱，每个网箱投放25尾鱼苗。投料时间为每天上午8:30，中午12:30，下午16:30，投料量为初体重的2％，随饲养时间增加。试验期为60天。1.2试验日粮配制试验日粮采用全价配合料，各组日粮组成见表1，各种原料分别粉碎过60目筛，把所有原料(包括本发明所述的发酵型高蛋白富硒植物性饲料)按照顺序逐级充分混匀，最后加入油脂，充分混匀后，加适量水，用小型制粒机制成2.0mm的颗粒饲料，避光通风晾干，保存于-20℃冰箱中备用。表1饲料配比及营养水平1.3测定指标及方法1.3.1鱼体生长指标的测定养殖试验结束后，鱼体空腹24h，称量终末体重，计算增重率。每个重复随机选取6条鱼，测量其体长与体重，计算肥满度。每个重复随机选取6尾鱼，称量其内脏和肝脏重量，计算脏体比和肝体比，样品存于-20℃冰箱待用。收集肠道样品，存于-20℃冰箱待用。1.3.2鱼体肝脏抗氧化能力的测定肝脏样品在冰浴条件下以1:9的比例加入生理盐水进行匀浆，3000r/min离心10分钟，收集上清液，存于-20℃冰箱待用。样品待测超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽(gsh)、丙二醛(mda)等抗氧化指标的测定。1.3.3鱼体肠道消化酶活力的测定肠道样品在冰浴条件下以1:9的比例加入生理盐水进行匀浆，3000r/min离心10分钟，收集上清液，存于-20度冰箱待用。待测定肠道样品的消化酶活力。1.3.4血清免疫指标的测定采用试剂盒测定血清中碱性磷酸酶(akp)、髓质过氧化物酶(mpo)、溶菌酶(lzm)和血清免疫球蛋白m(igm)活力，参照相应说明书进行操作。1.4数据分析采用spss20统计软件对试验数据进行处理，对各组数据进行单因素方差分析，并对差异显著性进行多重比较，试验结果以平均值±标准差表示，p＜0.05表示差异显著。2试验结果与分析2.1异育银鲫生长性能从表2可以看出，与对照组相比，5％和10％添加组的增重率有显著提高(p＜0.05)，10％和15％添加组的饵料系数有显著改善(p＜0.05)，三个添加组的成活率比对照组有显著提高(p＜0.05)。表2异育银鲫生长性能的变化注：同列肩标上小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，肩标字母相同或没有肩标表示差异不显著(p＞0.05)。2.2鱼体肝脏抗氧化能力由表3可以看出，与对照组相比，10％和15％添加组的mda含量有显著降低(p<0.05)，同时，三个添加组的sod活性和mda含量均比对照组有显著提高(p＜0.05)。表3鱼体肝脏抗氧化能力注：同列肩标上小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，肩标字母相同或没有肩标表示差异不显著(p＞0.05)。2.3血清免疫指标的变化由表4可见，与对照组相比，10％和15％添加组鲫鱼的mpo和lzm的活性显著提高(p<0.05)，15％添加组鲫鱼的igm含量也有显著提高(p<0.05)。表4血清免疫指标组别mpo(u/l)igm(g/l)akp(u/l)lzm(u/ml)对照组1022±32.26b1.97±0.05b41.07±2.074.78±8.0b5％添加组1154±29.79ab2.01±0.04ab41.08±3.886.59±16.8ab10％添加组1267±34.01a2.03±0.06ab42.69±4.791.84±8.0a15％添加组1269±47.54a2.10±0.05a42.26±1.4105.62±6.4a注：同列肩标上小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，肩标字母相同或没有肩标表示差异不显著(p＞0.05)。2.4肠道消化功能由表5可见，与对照组相比，10％和15％添加组鲫鱼的淀粉酶和蛋白酶活力显著提高(p<0.05)，15％添加组鲫鱼的脂肪酶活力也有显著提高(p<0.05)。表5肠道消化功能注：同列肩标上小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，肩标字母相同或没有肩标表示差异不显著(p＞0.05)。综合上述试验数据来看，在基础日粮的基础上添加比例为5％、10％和15％的本发明实施例1提供的富硒发酵型组合物，分别减少了20.32％、40.64％和60.96％的鱼粉用量，且同时在不同程度上提高了异育银鲫的成活率、增重和饵料系数，免疫力、抗氧化能力和肠道消化功能均有显著提升。这说明，本发明的富硒发酵型组合物可以作为用于提高鱼体生长机能的高蛋白饲料原料或添加剂或药物，将其添加到饲料中可提高养殖鱼体(例如异育银鲫)的生长机能(例如提高鱼体的生长速度、提高鱼体的肝脏抗氧化能力、提高鱼体的免疫力和提高鱼体的肠道消化能力等)，具有显著的经济价值和多重功效。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12