一种辣木茎叶粉固态发酵方法与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种辣木茎叶粉固态发酵方法。

背景技术：

2018年4月，辣木茎叶粉被列入《饲料原料目录》，这是因为辣木具有抗逆性强，适应性广，栽培简单以及生物量大的优势，而且辣木茎叶粉营养价值高。叶子的粗蛋白水平在10.7％～30.3％，富含维生素，矿物质和不饱和脂肪酸。另外，辣木叶含有丰富的生物活性物质，作为畜禽饲料资源具有巨大的潜力。但是，不同来源的辣木茎叶粉营养成分差异很大，质量不稳定。受产地来源，气候环境，生长年龄，加工方式以及贮存条件等多方面因素的影响。而且能量浓度低，适口性差，纤维含量高，使用过量有毒副作用。基于上述特性原因，亟需开发改善辣木食品或饲料的营养品质的方法。

固态发酵技术是利用微生物在基本没有游离水的固有基质上的发酵方式。自然界大多数发酵过程都是在有氧条件下进行的，好氧固态发酵很好地模拟了自然环境，还原了微生物在自然界中的原始生长状态。混菌发酵在生产实践中应用更广，它不仅可以替代许多情况下单菌发酵所不能进行的生产，而且不同菌株混合培养过程中会产生新的物质。多菌发酵是一个生物混合体系，体系中的微生物之间大多具有生长代谢协调作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中直接应用辣木作为畜禽饲料存在的不足，提供一种辣木茎叶粉固态发酵方法，以提高蛋白含量，降低纤维及抗营养因子含量，改善风味，提升辣木饲料的适口性和品质。

本发明的辣木茎叶粉固态发酵方法，包括以下步骤：

将黑曲霉gim3.576、产朊假丝酵母cicc31188、枯草芽孢杆菌gim1.427种子液接种到辣木茎叶粉发酵基质中进行发酵。

优选，所述的接种到辣木茎叶粉发酵基质中的种子液的总接种量为0.12-0.24ml种子液/g发酵基质，其中，黑曲霉gim3.576种子液的浓度为1x10⁷cfu/ml，产朊假丝酵母cicc31188种子液的浓度为1x10⁸cfu/ml，枯草芽孢杆菌gim1.427种子液的浓度为1x10⁸cfu/ml，黑曲霉gim3.576种子液、产朊假丝酵母cicc31188种子液、枯草芽孢杆菌gim1.427种子液的体积比为1-2:1:1-2。

更优选的，所述的接种到辣木茎叶粉发酵基质中的种子液的总接种量为0.16ml种子液/g发酵基质；所述的黑曲霉gim3.576种子液、产朊假丝酵母cicc31188种子液、枯草芽孢杆菌gim1.427种子液的体积比为1:1:2。

优选，在接种时先接种黑曲霉gim3.576种子液，然后在0-24h内接种产朊假丝酵母cicc31188种子液，在24-48h内接种枯草芽孢杆菌gim1.427种子液。

更优选的，在接种时先接种黑曲霉gim3.576种子液，然后在24h接种产朊假丝酵母cicc31188种子液和枯草芽孢杆菌gim1.427种子液。

优选，所述的辣木茎叶粉发酵基质的含水量为50％-70％，发酵温度为30-36℃，发酵时间为6-6.5d；更优选的，所述的辣木茎叶粉发酵基质的含水量为60％，发酵温度为32℃，发酵时间为6.5d。

优选，所述的发酵体系中还添加有蔗糖，其终浓度为质量分数2％-4％；更优选的，为质量分数3％。

本发明以辣木茎叶粉作为基质，采用黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌混合发酵并优化发酵工艺，从而降解辣木茎叶粉中的粗纤维、抗营养因子，合成微生物菌体蛋白，提高原料的有效营养素含量，优化组成比例，增加活性物质含量，改善饲料适口性，提高饲料生物学价值和饲料的安全性。

附图说明

图1是不同发酵处理对发酵产物的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的影响，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

图2是不同菌种比例对发酵辣木茎叶粉真蛋白的影响。

图3是不同发酵温度对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响。

图4是初始含水量对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响。

图5是接种量对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响。

图6是蔗糖含量对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响。

图7是接种量、发酵时间和发酵温度的响应面图和等高线图。

图8是辣木茎叶粉发酵前后的感官评价。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

一、不同菌种发酵对辣木茎叶粉的营养价值的作用

1材料与方法

1.1材料与试剂

辣木(moringaoleiferalam.)茎叶粉由广东省湛江市徐闻县辣木种植专业合作社提供，具体制备方法为：待辣木长至1.5米左右时从茎基部收割，收割的鲜样进行烘干处理，然后进行粉碎，过40目筛，制备得到辣木茎叶粉。黑曲霉gim3.576(aspergillusniger,a；以下简述为黑曲霉)，枯草芽孢杆菌gim1.427(bacillussubtilis,b；以下简述为枯草芽孢杆菌)购自广东省微生物菌种保藏中心，产朊假丝酵母cicc31188(candidautilis,c；以下简述为产朊假丝酵母)购自中国工业微生物菌种保藏中心。

单宁酸，植酸钠，薯蓣皂苷元，无水葡萄糖标准品购自上海源叶生物科技有限公司。可溶性糖试剂盒购自苏州科铭有限公司。胰蛋白酶，胃蛋白酶，氯霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。。3,5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，苯酚，三氯化铝，氯化亚铁，香草醛，磷酸等均为分析纯试剂。

1.2仪器与设备

vaioskanlux连续波长多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；sb-5200d超声波清洗机，宁波新芝；cu600b水浴锅，上海福玛；dhp-9162恒温培养箱，上海一恒；optimaxpn-100超高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特；zwy-240恒温摇床，上海智城；k9860全自动凯氏定氮仪，济南海能；ankoma200i型半自动纤维分析仪，美国ankom公司。

1.3方法

1.3.1菌种活化和微生物种子液的制备

pda培养基：称取200g去皮土豆，切碎，加入800ml蒸馏水，煮沸30min，用8层纱布过滤，收集滤液，加入20g葡萄糖，定容至1000ml(固体培养基加入20g琼脂)，121℃高压灭菌20min。

lb培养基：称取胰蛋白胨20g，酵母粉20g，氯化钠7g，加蒸馏水至1000ml，调ph至7.2～7.4(固体培养基加入20g琼脂)，121℃高压灭菌20min。

菌种活化：将保藏完好的黑曲霉、产朊假丝酵母分别接种于pda培养基上，于28℃恒温培养3d，将枯草芽孢杆菌接种于lb培养基上30℃条件下恒温培养24h。

微生物种子液的制备：黑曲霉用pda固体培养基28℃培养至菌丝铺满整个培养皿，用适量无菌水冲洗孢子，4层擦镜纸过滤，用血球计数板计算黑曲霉孢子悬液的浓度，稀释至1x10⁷cfu/ml作为种子液。产朊假丝酵母用pda液体培养基28℃，150r/min摇瓶培养3d，测定种子液浓度约为1x10⁸cfu/ml，而枯草芽孢杆菌用lb培养基30℃，250r/min培养48h，用无菌水稀释浓度约为1x10⁸cfu/ml作为种子液。

1.3.2辣木茎叶粉固态发酵的制备

称取40g辣木茎叶粉作为发酵基质，分别以0.12ml菌液/g发酵基质(12％，v/w)的接种量添加黑曲霉(a)、枯草芽孢杆菌(b)或产朊假丝酵母(c)，或同时将这三种菌两两组合，按0.12ml菌液/g发酵基质(12％，v/w)的总接种量加入双菌组合(接种比例为1:1)或三菌组合(接种比例为1:1:1)混合发酵，对照组则添加等量的无菌水，其他条件保持一样，每24h搅拌一次。以2:3料水比在30℃恒温培养箱中发酵6d后取样。

1.3.3发酵产物主要营养成分测定方法

粗蛋白含量的测定参照gb/t6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》(以饲料样品中的氮含量乘以系数6.25)；酸溶蛋白含量的测定参照gb/t22492-2008《大豆肽粉》；中性洗涤纤维(neutraldetergentfiber,ndf)和酸性洗涤纤维(aciddetergentfiber,adf)含量的测定参照gb/t20806-2006《饲料中中性洗涤纤维(ndf)的测定》和ny/t1459-2007《饲料中酸性洗涤纤维的测定》；还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法。

1.3.4发酵产物体外蛋白消化率(invitroproteindigestibility，ivpd)的测定

体外蛋白消化率的方法：准确称取1g样品于锥形瓶中，加入25ml磷酸盐缓冲液(0.1m，ph6.0)，混匀后向其中加入10ml0.2mhcl，并用1mhcl或1mnaoh溶液调节ph至2，然后向该混合物中加入1ml含有10mg胃蛋白酶的新鲜制备的胃蛋白酶溶液。为了防止细菌生长，加入0.5ml氯霉素溶液。封口后置于39℃摇床中温和振荡6h。然后向混合物加入10ml磷酸盐缓冲液(0.2m，ph6.8)和5ml0.6mnaoh溶液，再用1mhcl或1mnaoh溶液将ph调节至6.8，最后加入1ml胰酶溶液(含有50mg胰酶)，封好口，放入39℃摇床中恒温振荡18h。消化结束后，向所有锥形瓶中加入5ml20％磺基水杨酸，室温下静置30min，使溶解但未被消化的蛋白质沉淀出来。然后将未消化的残余物收集于布氏漏斗中，用去离子水反复冲洗三角瓶，直至残余物完全转移。将未消化的残余物在80℃下干燥过夜，然后通过凯氏定氮法测定未消化的蛋白质。计算公式如下：

辣木茎叶粉经黑曲霉(a)、枯草芽孢杆菌(b)、产朊假丝酵母(c)单一菌种或双菌组合发酵，或三菌混合发酵(a+b+c)，粗蛋白、酸溶蛋白、还原糖含量和体外蛋白消化率如表1所示，对照组的辣木茎叶粉粗蛋白含量为19.84％(以干物质计，下同)，不同菌种及其组合发酵均显著提高了辣木茎叶粉的粗蛋白含量(p<0.05)，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母分别发酵后的辣木茎叶粉粗蛋白含量之间无显著差异，但混菌组合发酵显著优于单一菌种发酵(p<0.05)，尤其是黑曲霉、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌三菌混合发酵，粗蛋白含量高达29.29％，显著高于两菌组合发酵及单一菌种发酵(p<0.05)。

酸溶蛋白含量也是重要的营养指标，发酵过程中微生物会分泌多种蛋白酶，将大分子蛋白降解为易于吸收的小肽或氨基酸，而且微生物自身代谢也能合成氨基酸。由表1可知，微生物发酵处理后的辣木茎叶粉酸溶蛋白含量均有所提高。三菌混合发酵的效果最好，酸溶蛋白含量为9.97％，显著高于对照组(p<0.05)。

另外，还原糖作为固态发酵过程中微生物生长代谢需要的重要碳源，能被微生物吸收利用。从表1可知，对照组的还原糖含量为0.70％。单一菌种发酵组的还原糖含量与对照组差异不显著。而混菌发酵后的还原糖含量均显著低于对照组(p<0.05)，特别是黑曲霉和产朊假丝酵母发酵组，以及枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母发酵组，还原糖含量均为0.07％，显著低于其他处理组(p<0.05)。这可能是因为黑曲霉，枯草芽孢杆菌产生的纤维素酶，淀粉酶等能将纤维素和淀粉等降解，产生的寡糖和单糖又被产朊假丝酵母利用，从而消除了葡萄糖阻遏效应的影响。

辣木茎叶粉由于存在含量较高的粗纤维，阻碍了消化酶与底物的充分接触，导致内在的营养物质不能完全释放，本研究中对照组的体外蛋白消化率只有14.34％。由表1可知，各发酵处理组均显著提高了辣木茎叶粉的体外蛋白消化率(p<0.05)，体外蛋白消化率最高的一组是a+b+c组，较对照组而言，提高了10.61％。微生物发酵的过程中不仅会降解大分子蛋白成小肽或氨基酸，而且产生的菌体蛋白更利于消化吸收。

表1不同发酵处理下辣木茎叶粉营养成分及体外蛋白消化率的变化

％dm

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，无字母或相同字母表示差异不显著(p>0.05)，下同。

1.3.5发酵产物的中性洗涤纤维(ndf)和酸性洗涤纤维(adf)含量

由图1可知，黑曲霉、枯草芽孢杆菌单一菌种以及双菌组合，甚至加上产朊假丝酵母三菌混合发酵后的ndf和adf含量均显著低于对照组(p<0.05)。枯草芽孢杆菌单一菌种发酵后的辣木茎叶粉ndf和adf含量均显示最低，说明在这样的发酵条件下枯草芽孢杆菌能分泌较强的纤维素酶。而混菌发酵中，a+b组和a+b+c组的ndf含量比较低，a+b组和a+c组的adf含量较低。

1.3.6抗营养因子含量的测定

参考makkar报道，采用folin-ciocalteu法测定总酚，水解单宁和缩合单宁含量。根据leone等描述的方法测定植酸盐含量，皂苷含量的测定参考贾秀峰等^]和hiai等人文献。称取发酵后的辣木茎叶粉2g，置于100ml锥形瓶中，加入30ml80％甲醇溶液，置于微波炉中，低火连续加热3min，静置至室温得到提取液。吸取0.2ml提取液，加入0.2ml香草醛-冰醋酸，1.0ml高氯酸，密封摇匀，70℃水浴30min后，冰浴10min中止反应，加冰醋酸至10ml，空白试剂作为对照，于540nm处测定吸光度，皂苷含量以薯蓣皂苷元当量(diosgeninequivalent，de)表示。总酚，水解单宁含量以单宁酸当量(tannicacidequivalent，tae)表示，单位均是g/kg，以干物质计。

发酵产物的抗营养因子含量变化如表2，可知，微生物发酵后的辣木茎叶粉总酚含量均有所提高。而a组、b组、a+b组、a+b+c组的总酚含量显著高于其他处理组，说明黑曲霉和枯草芽孢杆菌发酵能够释放更多的酚类物质。另外，不同处理组的辣木茎叶粉水解单宁含量均有所下降，黑曲霉发酵组、黑曲霉和其他菌种组合发酵的处理组，水解单宁含量显著低于对照组(p<0.05)。各处理组的皂苷含量虽与对照组无显著差异，但从表2可以看出，皂苷含量在发酵的过程中也是在减少。植酸含量方面，混菌发酵中a+b+c组的植酸含量最低，较对照组减少了8.24g/kg。

表2发酵辣木茎叶粉抗营养因子含量的变化

通过从多方面评价单一菌种和混菌组合发酵的方式对辣木茎叶粉效果的影响，发现混菌组合发酵优于单一菌种，综合考虑，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母三菌混合发酵效果最佳，但仍需进一步探讨混菌发酵发酵辣木茎叶粉的最适环境条件。

二、辣木茎叶粉固态发酵工艺优化

在确定选用黑曲霉，产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌混合发酵辣木茎叶粉的基础上，设计了接种顺序，辣木茎叶粉发酵基质含水量，接种量，发酵时间，发酵温度，发酵体系添加蔗糖含量七个单因素研究，以真蛋白(trueprotein，是指除去非蛋白质氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白)含量作为营养指标，最后通过响应面设计得到最优的发酵工艺参数。1、固态发酵辣木茎叶粉的制备

辣木茎叶粉用121℃高温灭菌20min。称取40g辣木茎叶粉于500ml烧杯中，调整水分含量，然后后接种一定量的微生物种子液。将发酵罐置于一定的温度下发酵一段时间，检测不同条件下发酵辣木茎叶粉的真蛋白含量。

2、辣木茎叶粉固态发酵的单因素试验

2.1黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌三菌比例的确定

设计黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为(1:1:1)、(1:2:1)、(1:1:2)和(2:1:1)，混合菌种的接种量为0.12ml菌液/g发酵基质(12％，v/w)，发酵时间6d，发酵温度30℃，初始含水量60％。

由图2可知，不同的菌种比例固态发酵对辣木茎叶粉的真蛋白含量影响不显著，黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:1:2和2:1:1时均高于其他两组。选取1:1:2作为菌种比例，其真蛋白含量达28.23％。

2.2黑曲霉，产朊假丝酵母，枯草芽孢杆菌三菌接种时间顺序及发酵时间的确定

以总接种量12％(v/w)，黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:1:2，温度30℃，初始含水量60％，时间6d的参数固态发酵辣木茎叶粉，按照接种黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌的时间间隔(h)顺序设计了九组试验分别是0→0→0、0→0→24、0→0→48、0→24→0、0→24→24、0→24→48、0→48→0、0→48→24、0→48→48。

如表3所示，对表中的数据进行双因素的方差分析，发现接种顺序，发酵时间以及两者的互作效应对真蛋白含量的影响均差异显著(p<0.05)。接种顺序0→0→24、0→24→24、0→24→48组均显著高于其他组别(p<0.05)。发酵第6d也均显著高于其他组别(p<0.05)。

表3不同接种顺序下辣木茎叶粉发酵后真蛋白含量的变化

2.3发酵温度、初始含水量、接种量、蔗糖含量的确定

以上述最优的菌种比例(黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:1:2)及最优的接种时间顺序作为试验组，设计发酵温度(24℃、27℃、30℃、33℃、36℃)，发酵基质初始含水量(30％、40％、50％、60％、70％)、总接种量(8％、12％、16％、20％、24％(v/w))以及蔗糖浓度(质量分数1％、2％、3％、4％、5％)的单因素指标。

发酵温度对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响情况见图3。由图3可知，随着发酵温度的升高，发酵辣木茎叶粉的真蛋白含量呈现先增加后减少的趋势，在发酵温度为30-36℃时真蛋白含量较高，其中，当温度达到33℃，发酵辣木茎叶粉的真蛋白含量最高，为24.73％。

初始含水量对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响情况见图4。由图4可知，在30％、40％、50％、60％、70％的含水量范围内，随着含水量的提高，发酵辣木茎叶粉的真蛋白含量先上升后下降。含水量为50-70％时真蛋白含量较高，其中，含水量为60％时，真蛋白含量最高，达到27.18％。

总的接种量对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响情况见图5。由图5可知，不同接种量下对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响较大，随着接种量的提高，真蛋白含量随之增加，在接种量为12％-24％时，真蛋白含量较高，其中，接种量16％时，真蛋白含最高。之后，随着接种量的提高，真蛋白含量逐渐下降。

蔗糖浓度对发酵辣木茎叶粉真蛋白含量的影响情况见图6。由图6可知，蔗糖含量也是影响辣木茎叶粉发酵品质的一个重要因素，随着蔗糖含量的增加，发酵辣木茎叶粉的真蛋白含量呈现先上升后下降的趋势，发酵体系中蔗糖含量为质量分数2％-4％间时较好，为质量分数3％时最好，因此选取3％的蔗糖含量作为最适的浓度。

2.4响应面试验优化发酵条件

利用designexpertv.8.0.6，根据box-behnken中心组合设计原理，采用响应面分析，建立发酵辣木茎叶粉真蛋白含量与各关键因素的数学模型，通过计算分析优化发酵辣木茎叶粉的最佳发酵条件，以确定关键发酵因素的最佳发酵条件。

为了获得更为准确的辣木茎叶粉固态发酵参数，结合上述单因素，选取影响较为明显的三个因素(接种量、发酵温度和发酵时间)作为响应面的考察因素，以真蛋白含量为响应值，进行三因素三水平的响应面分析(如表4)，其他因素统一设置：接种黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌的时间顺序为0→24→24(h)，黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:1:2，发酵体系中蔗糖浓度质量分数3％，发酵基质初始含水量60％。每个发酵试验重复3次。通过dsignexpertv.8.0.6统计软件，设计box-behnken中心组合设计，结果见表4。

表4响应面因素水平及设计

由多元线性和二项式拟合得到各因素对应的发酵辣木茎叶粉真蛋白含量(表5)的数学模型：

y＝30.24+0.68*a-0.69*b-1.69*c+0.22*a*b+0.94*a*c-0.91*b*c-2.06*a2-2.38*b2-2.87*c2，由方差分析可知(见表6)，该回归模型p＝0.0002,方程模型达到极显著，失拟项p＝0.1015，差异不显著。另外该回归模型的总决定系数r²＝0.9686，说明模型能够较好地预测响应面值与自变量的关系，回归方程有效。调整决定系数r²adj＝0.9282，变异系数c.v.％＝2.81.以上参数均说明该模型拟合程度和可信程度很高，试验误差小。故该回归方程模型成立，可以用此模型对辣木茎叶粉发酵进行分析及预测。

表5发酵条件的响应面优化结果

表6响应面模型的方差分析

由图7可知，在不同接种量，发酵温度和发酵时间条件下，真蛋白含量都出现先增后见减的趋势。通过软件获得最佳发酵条件：接种量16.79％，发酵温度31.55℃，发酵时间6.47d，真蛋白预测值30.53％。

2.5辣木茎叶粉固态发酵的最适条件验证

采用响应面试验所获得的最佳发酵条件进行发酵饲料的制备，于50℃烘干，粉碎过40目筛待测营养指标。

在辣木茎叶粉发酵基质含水量60％，发酵体系中蔗糖浓度为质量分数3％，黑曲霉：产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌种子液体积比为1:1:2，黑曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌依次接种顺序为0→24→24(h)的条件下，为方便实际操作，修正接种量16％，发酵温度32℃，发酵时间6.5d，在此条件下重复进行3次平行试验，实际测得真蛋白含量为28.37％，与理论值相差2.16％，认为该工艺参数合理可靠，具有实际应用价值。2.6最优条件下辣木茎叶粉发酵前后的营养价值评估

按照最优参数发酵辣木茎叶粉，对其营养指标及其抗营养指标进行检测，如表7所示，发酵后的辣木茎叶粉粗蛋白、粗灰分、钙、磷含量有所提高，抗营养因子单宁和植酸的含量减少，粗纤维含量也下降，其中木质素和纤维素的含量减少，半纤维素含量稍微增加了。如表8所示，发酵后的辣木茎叶粉的氨基酸总量比未发酵的提高了1.89％，辣木茎叶粉经发酵处理后，除了赖氨酸外，其他16种氨基酸含量均有所提高。从感官上可以看出(图8)，辣木茎叶粉呈淡黄色，闻起来有抹茶味；而发酵后的颜色呈暗褐色，有另外一种淡淡的芳香味。

综上，本实施例的方法能成功制备一种发酵辣木茎叶粉，改善辣木茎叶粉的营养品质。

表7辣木茎叶粉发酵前后的营养成分含量分析

表8辣木茎叶粉发酵前后氨基酸含量的变化