本发明属于饲料添加剂领域，特别涉及一种酸化剂、其复合菌一步发酵制备方法与应用。
背景技术：
酸化剂可有效提高动物的消化道适应能力和肠道健康，作为抗生素替代品，已被广泛地应用于家禽料、仔猪料及其他饲料中，成为一种高效无污染无残留的天然保健型饲料添加剂。
饲料酸化剂的作用机理主要包括降低饲料ph值，使胃内ph值下降，提高消化酶的活性；减慢胃排空的速度，促进消化；改善胃肠道微生物区系，发挥抑菌杀菌作用；促进矿物质和维生素的吸收；直接参与体内能量代谢，作为能量来源以及提高营养物质消化率。复合酸化剂的合理配比可以充分利用不同酸类之间的互补协同作用，能克服单一酸化剂的不足和缺陷，发挥互补效应。复合型酸化剂在饲料中添加量比单一型的要小，作用效果更显著，在动物体内残留更少。有机酸具有良好的风味，能改善饲料适口性，提高动物采食量，且含有一定能量，可参与体内营养物质的代谢，进而改善动物生长性能和健康状况，但使用成本较高。在生产中应用较广泛的有机酸主要有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、山梨酸等。
近年来由于人们生活水平的提高和产业结构调整，促进了水果和蔬菜集约化种植和加工业的发展，随之而来的是果蔬废弃物的大量产生和加工副产物的逐步增多，导致废弃物对环境的污染。果蔬废弃物含水量大，有机成分及营养物含量高，有机质部分含有75％的糖分，一般不含有毒有害物质，可有效的用于微生物产酸发酵。
现有的酸化剂的制备方法主要是简单的物理混合、颗粒化，这种制备方法往往成本高，不易保存，腐蚀性强且高剂量添加会降低饲料适口性或导致维生素损失。现有的专利文献中以微生物发酵制备酸化剂一般工艺复杂，一般包括多步发酵或多次发酵，发酵时间长，成本高。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服上述现有技术的缺点与不足，提供一种复合菌一步发酵果蔬废弃物制备酸化剂的方法。所述的方法简单有效，使用一步法，通过多菌种复合发酵，采用表层吹气策略发酵果蔬废弃物，可以高效地利用发酵原料中的营养成分，有效地提高发酵液中的有机酸种类和含量，缩短发酵时间，降低ph值。发酵工艺简单，成本低，可以确保制得的酸化剂中各主要有机酸的含量和种类，并且能有效地利用果蔬废弃物，有利于环境保护。
本发明的另一目的在于提供通过所述的制备方法制得的酸化剂，所述的酸化剂中有机酸种类多、含量高、ph值低，有益于提高动物的采食量和日增重，降低腹泻率。
本发明的再一目的在于提供所述酸化剂的应用，所述的酸化剂可根据需求应用于各种家畜、禽类水产养殖。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种复合菌一步发酵果蔬废弃物制备酸化剂的方法，包括以下步骤：
(1)将果蔬废弃物置于发酵容器中，加入糖源，静置出汁，得到发酵原料；
(2)发酵原料接种复合菌进行一步法发酵，以降低发酵液的酸度，所述的复合菌包括酵母菌、乳酸菌和醋酸杆菌；
(3)密闭发酵容器后，在发酵液面表层吹入无菌空气，同时确保不可吹破表层菌膜，发酵得到含多种有机酸、低ph值的发酵液，即为所述的酸化剂。
步骤(1)中所述的果蔬废弃物可以是果皮、果肉、果核，以及果蔬发酵渣，例如，生产其他果蔬加工产品后的剩余残渣；果蔬种类不限。
所述的果蔬废弃物优选进行如下前处理：果蔬废弃物可以是不同来源，经适当分类或者不分类，洗净后切割成片状物；所述的片状物的厚度优选为0.5cm。
步骤(1)中所述的糖源为蔗糖；所述的糖源的添加量优选按果蔬废弃物质量的5～15％进行添加；所述的糖源更优选为按果蔬废弃物质量的8～12％进行添加。
步骤(1)中所述的静置出汁的时间优选为8～16h。
步骤(2)中所述的复合菌的接种量以发酵原料的质量百分数计，优选地，所述的酵母菌的接种量优选为2‰～8‰，所述的乳酸菌的接种量优选为1‰～5‰，所述的醋酸杆菌的接种量优选为1％～5％；进一步优选为2％～4％。
步骤(2)中所述的接种优先分两次接种，先将酵母菌和乳酸菌混合后接种于发酵原料中，轻微搅拌，然后将醋酸杆菌泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。
步骤(2)中所述的酵母菌优选为啤酒酵母；所述的乳酸菌包括但不限于植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的至少一种；所述的醋酸杆菌包括但不限于巴氏醋酸杆菌和氧化醋酸杆菌的至少一种。
步骤(3)中所述的表层吹入无菌空气的通气量优选为0.1～1vvm；进一步优选为0.3～0.5vvm。
步骤(3)中所述的发酵液面表层吹入无菌空气优选为在发酵液面表层切向流吹入无菌空气。
步骤(3)中所述的发酵的温度优选为30～37℃；进一步优选为33℃。
步骤(3)中所述的发酵的时间优选为4～8天；进一步优选为6天。
所述的复合菌一步发酵果蔬废弃物制备酸化剂的方法还可以包括过滤除渣等后处理步骤；还可以进一步减压浓缩，制得浓缩型酸化剂。
所述减压浓缩优选浓缩至原液体积的20～50％；更优选为浓缩至原液体积的30％。
一种酸化剂，通过所述的复合菌一步发酵果蔬废弃物制备酸化剂的方法制备得到。
所述的酸化剂的ph优选为1.5～3。
所述的酸化剂包括种类不少于6种的有机酸，包括但不限于乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、甲酸、正丁酸；其中以乙酸、乳酸、柠檬酸为主。
所述的酸化剂在动物饲料领域中的应用；例如，作为饲料添加剂与饲料混合喂养动物。
所述的应用的具体方法为：未浓缩的酸化剂按添加量为8～12kg/吨与饲料混合均匀，或浓缩酸化剂按添加量为2～6kg/吨与饲料混合均匀后，喂养动物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用切向流表层吹气，避免了机械搅拌，能耗低。
(2)微生物发酵产生有机酸的种类和含量受菌种和发酵策略影响，本发明中采用表层吹气发酵，既保证了底层酵母菌无氧发酵产酒精，同时保证表层醋酸杆菌的有氧转酸发酵，发酵工艺流程简单，发酵时间短，同时可将酒精含量控制在5‰以下。
(3)本发明能够有效地利用果蔬废弃物，果蔬废弃物含水量大，有机成分及营养物含量高，有机质部分含有75％的糖分，一般不含有毒有害物质，可有效的用于微生物产酸发酵。通过本发明的方法，绿色环保，能最大效率的利用发酵原料中的营养成分，同时低ph值能有效地抑制有害微生物的生长，无需严格高温高压灭菌，易于保存。
(4)本发明制备的酸化剂，有机酸种类多，含量适中，避免了单一酸含量过高产生的问题，因此本发明制备的酸化剂具有更广泛的用途。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不局限于所述内容。
本发明的方法对酵母菌、乳酸菌和醋酸杆菌具有通用性，实施例中所使用的菌种为市售菌粉，其中梅山即发高活性干酵母(saccharomycescerevisiae)购自英联马利食品销售有限公司、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp45购自河北一然生物科技有限公司，醋酸杆菌(acetobacterpasteurianus，产品货号cb969)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus，产品货号la-660)和干酪乳杆菌(lactobacilluscasei，产品货号lc-630)购自仙农生物科技(上海)有限公司，实施例中所使用的市售酸化剂购自青岛柯能动物营养品有限公司。实施例中方法若无特殊说明，均为常规方法，使用的试剂若无特殊说明，均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1
1.果蔬废弃物处理：果蔬废弃物取自农贸市场和果园，主要原料为当季水果和蔬菜，本实施例中用到的原料为来自果园的部分腐烂和放置5天以上不适合销售的火龙果，分选去除大面积腐烂和切除小部分腐烂的部位后，切制成0.5cm左右厚度小块，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入8％的蔗糖，静置出汁8h。
3.发酵剂制备：发酵菌种为市售酵母菌，醋酸杆菌和乳酸菌的菌粉，本实施例中乳酸菌为植物乳杆菌。发酵剂分两次接种，先将酵母菌和植物乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；后将醋酸杆菌泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌2‰，乳酸菌1‰和醋酸杆菌2％。
4.发酵：密闭容器后，在发酵液面切向流表层吹入过滤后的无菌空气，通气量0.3vvm，同时确保不可吹破表层菌膜。发酵温度30℃。
5.发酵8天后，经放料口放出上层发酵液。
6.发酵液经减压浓缩，浓缩至原液体积的20％，得到浓缩发酵液。
7.浓缩发酵液经离心除去沉淀后得到所述的酸化剂，即可直接应用于动物保健饲料的添加剂。
8.使用时，将本发明所得的酸化剂按添加量为2kg/吨与饲料混合均匀，将混合猪饲料对断奶20天，生长健康的仔猪进行喂养。对照组为未添加酸化剂组和添加市售酸化剂组。喂养30天后，检测记录平均增重、平均日增重、日采食量和腹泻率；结果见表2。
实施例2
1.果蔬废弃物处理：本实施例中用到的原料为来自农贸市场的部分腐烂水果和放置超过2天的蔬菜，包括苹果、梨、橘子、提子、火龙果、大白菜、小白菜、生菜、油麦菜等，分选切除部分腐烂的部位后，水果切制成0.5cm左右厚度小块，蔬菜切制成0.5cm左右长度的小块，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入12％的蔗糖，静置出汁16h。
3.发酵剂制备：发酵菌种为市售酵母菌，醋酸杆菌和乳酸菌的菌粉，本实施例中所用乳酸菌为发酵乳杆菌。发酵剂分两次接种，先将酵母菌和嗜酸乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；后将醋酸杆菌泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌8‰，嗜酸乳杆菌5‰和醋酸杆菌4％。
4.发酵：密闭容器后，在发酵液面表层切向流吹入过滤后的无菌空气，通气量0.8vvm，同时确保不可吹破表层菌膜。发酵温度33℃。
5.发酵6天后，经放料口放出上层发酵液。
6.发酵液经减压浓缩，浓缩至原液体积的30％，得到浓缩发酵液。
7.浓缩发酵液经离心除去沉淀后得到酸化剂，即可直接应用于动物保健饲料的添加剂。
8.使用时，将本发明所得的酸化剂按添加量为4kg/吨与饲料混合均匀，将混合猪饲料对断奶20天，生长健康的仔猪进行喂养。对照组为未添加酸化剂组和添加市售酸化剂组。喂养30天后，检测记录平均增重、平均日增重、日采食量和腹泻率；结果见表2。
实施例3
1.果蔬废弃物处理：果蔬废弃物取自农贸市场和果园，主要原料为当季水果和蔬菜，本实施例中用到的原料为来自果园的部分腐烂和放置3天以上不适合销售的荔枝，分选去除大面积腐烂的荔枝后，将荔枝挤压破壳，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入10％的蔗糖，静置出汁10h。
3.发酵剂制备：发酵菌种为市售酵母菌，醋酸杆菌和乳酸菌的菌粉，本实施例中所用乳酸菌为发酵乳杆菌。发酵剂分两次接种，先将酵母菌和干酪乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；后将醋酸杆菌泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌5‰，干酪乳杆菌3‰和醋酸杆菌3％。
4.发酵：密闭容器后，在发酵液面表层切向流吹入过滤后的无菌空气，通气量0.5vvm，同时确保不可吹破表层菌膜。发酵温度35℃。
5.发酵4天后，经放料口放出上层发酵液。
6.发酵液经减压浓缩，浓缩至原液体积的50％，得到浓缩发酵液。
7.浓缩发酵液经离心除去沉淀后得到酸化剂，即可直接应用于动物保健饲料的添加剂。
8.使用时，将本发明所得的酸化剂按添加量为6kg/吨与饲料混合均匀，将混合猪饲料对断奶20天，生长健康的仔猪进行喂养。对照组为未添加酸化剂组和添加市售酸化剂组。喂养30天后，检测记录猪生产性能如平均日增重、日采食量、料肉比和腹泻率。结果见表2。
实施例4
1.果蔬废弃物处理：本实施例中用到的原料为来自农贸市场的部分腐烂水果和放置超过2天的蔬菜，包括苹果、梨、橘子、提子、火龙果、大白菜、小白菜、生菜、油麦菜等，分选切除部分腐烂的部位后，水果切制成0.5cm左右厚度小块，蔬菜切制成0.5cm左右长度的小块，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入15％的蔗糖，静置出汁16h。
3.发酵剂制备：发酵菌种为市售酵母菌，醋酸杆菌和乳酸菌的菌粉，本实施例中所用乳酸菌为发酵乳杆菌。发酵剂分两次接种，先将酵母菌和植物乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；后将醋酸杆菌泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌8‰，植物乳杆菌5‰和醋酸杆菌5％。
4.发酵：密闭容器后，在发酵液面表层切向流吹入过滤后的无菌空气，通气量0.8vvm，同时确保不可吹破表层菌膜。发酵温度37℃。
5.发酵8天后，经放料口放出上层发酵液。
6.发酵液经过滤或离心后即得所述的酸化剂，即可直接应用于动物保健饲料的添加剂。
7.使用时，将本发明所得的酸化剂按添加量为10kg/吨与饲料混合均匀，将混合猪饲料对断奶20天，生长健康的仔猪进行喂养。对照组为未添加酸化剂组和添加市售酸化剂组。喂养30天后，检测记录猪生产性能如平均日增重、日采食量、料肉比和腹泻率。结果见表2。
对比例1
1.果蔬废弃物处理：果蔬废弃物取自农贸市场和果园，主要原料为当季水果和蔬菜，本实施例中用到的原料为来自果园的部分腐烂和放置5天以上不适合销售的火龙果，分选去除大面积腐烂和切除小部分腐烂的部位后，切制成0.5cm左右厚度小块，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入8％的蔗糖，静置出汁8h。
3.发酵剂制备：发酵菌种为市售酵母菌，醋酸杆菌和乳酸菌的菌粉。发酵剂分两次接种，先将酵母菌和植物乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；后将醋酸杆菌表层泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌2‰，植物乳杆菌1‰和醋酸杆菌2％。
4.发酵：用4层纱布密封容器，静置发酵。发酵温度33℃。
5.发酵25天后，上层发酵液有机酸含量和种类，ph值以及酒精浓度达到稳定值(检测方法同效果实施例)，基本不再变化，经放料口放出上层发酵液，即为本对比例制得的酸化剂。
对比例2
1.果蔬废弃物处理：果蔬废弃物取自农贸市场和果园，主要原料为当季水果和蔬菜，本实施例中用到的原料为来自农贸市场的部分腐烂水果和放置超过2天的蔬菜叶，包括苹果、梨、橘子、提子、火龙果、大白菜、小白菜、生菜、油麦菜等，分选切除部分腐烂的部位后，水果去杂后切制成0.5cm左右厚度小块，蔬菜切制成0.5cm左右长度的小块，称量后置于发酵容器中。
2.出汁：按质量计加入15％的蔗糖，静置出汁16h。
3.一次接种：发酵菌种为市售酵母菌和乳酸菌的菌粉。先将酵母菌和植物乳杆菌混合后接种，轻微搅拌；接种量以果蔬原料质量百分数计，酵母菌8‰，植物乳杆菌5‰和醋酸杆菌5％。
4.一次发酵：密闭容器，保持无氧环境，发酵温度35℃，发酵48h。
5.二次接种：后将醋酸杆菌表层泼洒接种于发酵原料表层，无需搅拌。
6.二次发酵：用4层纱布密封容器，静置发酵。发酵温度33℃。
7.发酵25天后，上层发酵液有机酸含量和种类，ph值以及酒精浓度达到稳定值(检测方法同效果实施例)，基本不再变化，经放料口放出上层发酵液，即为本对比例制得的酸化剂。
效果实施例
1.对实施例1～4、对比例1～2得到的酸化剂中的有机酸种类和含量百分数、残留酒精含量百分数以及ph值进行检测。
用hplc-uv-ri检测酸化剂中有机酸含量，检测方法如下：
(1)色谱分离条件：
色谱柱：aminexhpx-87h有机酸分析柱(300mm×7.8mm:bio-rad.hercules)流动相：0.005mol/lh2so4溶液，流速0.6ml/min，进样量20μl，柱温50℃。
检测器参数：紫外检测器波长210nm，示差折光检测器温度50℃。
(2)样品预处理：发酵液稀释适当的倍数后经0.22μm膜过滤，进样20μl。
(3)标准品制备：精确称取标准品，稀释为不同浓度，使用0.22μm膜过滤进样，进样量：20μl。
结果如表1所示，本发明制备的酸化剂相较于对比例中通过普通发酵方法制得的发酵液，各有机酸含量明显提高、ph值更低，乙醇含量较低。经过浓缩步骤，可进一步提高有机酸含量，降低ph值，并且可完全除去乙醇。酸化剂的浓缩还可以降低喂养过程中的添加量，方便运输。本发明制备的酸化剂不需要额外添加其他有机酸或无机酸，可直接用于饲料添加。
表1酸化剂中有机酸种类和含量百分数、酒精含量百分数以及ph值
2.将实施例1～4得到的酸化剂、对照组、市售酸化剂对仔猪进行喂养实验的结果如表2所示。结果表明，本发明方法制备的酸化剂用于仔猪饲料添加，可显著提高仔猪的日增重和日采食量，并且显著降低料肉比和腹泻率；尤其是使用实施例2中的制备方法和添加量，仔猪喂养30天内未出现腹泻情况。
表2不同酸化剂对断奶仔猪生产性能的影响
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。