用于安全食物保存的S-亚硝基硫醇化合物及其与亚硝胺阻断剂的组合的制作方法

背景技术：

在肉类工业中，传统上一直使用亚硝酸盐作为添加剂，以达到多重目的：肉类保存(由于亚硝酸盐具有防止肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)的生长的独特能力)、从肉类的粉红到红色的特征发展和对味道的贡献。

亚硝酸盐尽管具有有用的性能，但却臭名昭著，因为它会与肉类(例如蛋白质)中发现的仲胺发生反应。亚硝酸盐和仲胺的反应导致形成被认为是致癌物的n-亚硝胺。术语“亚硝胺”是指具有n-亚硝基(-n-n＝o)基团的通式i化合物(r¹和r²表示有机部分)：

在一定条件下(包括强酸性环境和高温，例如，在肉类工业进行的烹饪和油炸过程中)使亚硝酸盐和仲胺接触时，会形成亚硝胺。

因此，通常将旨在抑制n-亚硝胺形成的辅助添加剂(例如，主要是抗坏血酸、异抗坏血酸或其盐)掺入亚硝酸盐腌制的肉类制品中，以用作亚硝胺阻断剂。但是这些辅助添加剂只能在一定程度上降低亚硝酸盐腌制的肉类制品中n-亚硝胺形成的水平。

解决n-亚硝胺形成问题的较好方法当然是找到亚硝酸盐替代物，该替代物将表现出与亚硝酸盐相当的防腐作用，但对仲胺和n-亚硝胺形成的反应性较低。但是到目前为止，亚硝酸盐的任何替代品都无法获得商业认可，这显然是由于亚硝酸盐具有无与伦比的作用，特别是作为针对上述毒素形成细菌的有效防腐剂。例如，在us3,966,974中，已提出使用有机亚硝酸盐代替亚硝酸钠。在us4,346,117中，测试了金属次磷酸盐，例如，na(h2po2)作为亚硝酸钠的替代品。us4,559,234报道了，借助包含二亚硝酰基铁血红素(dinitrosylferrohemochrome)即铁-硫-亚硝酰基(fe-s-no)配合物、抗氧化剂和抗菌剂的腌制组合物，可获得与亚硝酸盐腌制的肉类没有区别的无亚硝酸盐的肉类制品。

有关食物保存中亚硝酸盐和亚硝酰基化合物的综述[canmmacketal.inbiochimicaetbiophysicaacta1411p.475-488(1999)]中提到了不同类型的与亚硝酸盐有关的抑菌化合物，包括s-亚硝基硫醇。s-亚硝基硫醇是最通常形式为式ii的化合物：

其中r为有机部分。inczeetal.[appliedmicrobiologyp.202-205(1974)]报道，其中r是半胱氨酸的式ii的化合物对各种细菌显示出比亚硝酸盐更高的抗菌活性。随后该论文的作者继续提出：基于与直接使用亚硝酸盐相比，当使用s-亚硝基半胱氨酸作为添加剂时，n-亚硝胺的形成可能会更少的假设，所考虑的化合物，即具有如下所示的化学结构的s-亚硝基半胱氨酸：

有可能在肉类保存中取代亚硝酸盐。

但以下报道的实验结果表明，亚硝酸钠和s-亚硝基半胱氨酸在n-亚硝胺形成方面是相当的，且在某些条件下，使用s-亚硝基半胱氨酸可甚至导致n-亚硝胺的大量产生。在支持本发明进行的实验工作中，在用于模拟胃部的酸性ph条件和用于刺激肉类的接近中性的ph条件下，研究了在亚硝酸钠和s-亚硝基半胱氨酸存在下将特征性仲胺(n-甲基苯胺)向相应的亚硝胺的转化。还研究了添加剂浓度和反应温度的影响。下示的结果表明，s-亚硝基半胱氨酸不能真正取代亚硝酸盐作为食物防腐剂，似乎与dennisetal.[journalofthescienceoffoodandagriculture(1980),31(11),1195-2000]报道的数据相符，其中亚硝酸盐和s-亚硝基半胱氨酸在亚硝胺形成方面显示出产生相似的作用。

技术实现要素：

下面报道的研究表明，s-亚硝基-半胱氨酸的修饰形式(例如，n-酰基衍生物)可有效替代食物中的亚硝酸盐。已显示这些衍生物从与仲胺的反应中产生出乎意料的微量亚硝胺，即，显著小于仲胺与目前使用的防腐剂亚硝酸钠或s-亚硝基-半胱氨酸的平行反应所测得的量。

因此，本发明涉及一种用于处理食物(包括饮料)的方法，例如腌制肉类的方法，其包括向所述食物添加式iii的化合物的步骤：

其中x1和x2独立地选自氢、酰基基团(例如，低级酰基，如r1c(o)-，其中r1为c1-c5烷基，例如，乙酰基ch3c(o)-)以及烷基基团(例如，低级烷基，如c1-c5烷基，例如，-ch3)，其中x1和x2中的至少一者不为氢；

x3选自氢、非毒性金属阳离子(例如碱金属)以及c1-c5烷基基团(例如，-ch3、-c2h5)；和

x4和x5独立地选自氢和c1-c5烷基(例如，-ch3、-c2h5)。

应当注意，本发明考虑的式iii的s-亚硝基半胱氨酸的衍生物包括天然存在的l对映异构体、d对映异构体及其混合物的衍生物。因此，应相应地理解本文所示的各式。然而，优选地，式iii的化合物为l-半胱氨酸的衍生物。

尤其选优的是游离酸形式(即，x3为氢)的式iii的化合物，其中x4和x5均为的氢，其表示为式iii-a：

还可使用式iii-a的酸的无毒的、优选水溶性盐和酯衍生物，即式iii-a'的化合物：(on)-s-ch2-ch(nx1x2)-c(o)-ox3，其中x3为金属或低级烷基(-ch3、-c2h5)，但通常，式iii-a的游离酸在接近中性的ph值具有良好的水溶性，并且可通过注入如下所述的水溶液将其添加到肉类中。

优选地，在式iii或iii-a所述的化合物中，x1为氢且x2为酰基基团，例如，ch3c(o)-、ch3ch2c(o)-、ch3ch2ch2c(o)-。尤其优选的是乙酰基衍生物，即，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(s-亚硝基-n-乙酰基-l-半胱氨酸，本文中有时缩写为nac-sno)：

以下报告的试验还表明，在冰箱中的储存条件下，式iii的化合物(例如，iii-a，尤其是s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸)与通常用于抑制肉类中亚硝胺形成的添加剂(例如抗坏血酸)的混合物产生很好的效果。在4℃，与比较混合物(即，由亚硝酸钠/抗坏血酸和s-亚硝基半胱氨酸/抗坏血酸组成的混合物)相比，这些混合物已显示出可以更大程度地减少亚硝胺形成。

本发明的另一个方面是一种用于处理食物(包括饮料)的方法，例如，一种腌制肉类的方法，包括向所述食物或饮料中添加式iii的化合物(例如，iii-a)以及亚硝胺形成抑制剂或其它no氧化物质的清除剂的混合物的步骤，所述抑制剂例如为抗坏血酸、异抗坏血酸或其生理学上可接受的盐或酯。式iii的化合物和抗坏血酸、异抗坏血酸或其生理学上可接受的盐或酯的混合物，以及其作为用于抑制亚硝胺形成的食物添加剂的用途构成了本发明的其它方面。这些混合物的比例通常为约1:0.1至1:50，例如，1:1至1:10(重量比式iii-a：维生素c)。

式iii的化合物(例如，iii-a)可与其它添加剂一起以固体或液体形式掺入肉类中。因此，本发明还提供一种用于腌制肉类的组合物，该组合物包含式iii的化合物(例如，iii-a)以及至少一种肉类添加剂(例如氯化钠、氯化钾、糖、抗氧化剂、包含一种或多种抗坏血酸及其生理学上可接受的盐或酯的亚硝胺形成抑制剂、调味添加剂及其混合物)。肉类处理组合物，例如，包含水和溶解或分散于其中的式iii的化合物(例如，iii-a)的液体组合物，以及任选地与下文更详细描述的其它添加剂一起，也是本发明的一部分。

具体实施方式

式iii的化合物是可商购的或可通过本领域已知的方法合成。

式iii的化合物(例如，iii-a)通常在惰性气氛下的强酸性环境下由相应的硫醇与碱性亚硝酸盐的反应制得，如kannerj.andjuvenb.j.,1980,j.sci.45(5),1105-1108所示。该反应所需的硫醇原料，(例如，n-单酰化的半胱氨酸)是可商购的，或者可通过us3,184,505及其中提到的参考文献中描述的已知方法制备，us3,184,505及其中提到的参考文献说明了n-乙酰基-半胱氨酸、n-丙酰基-半胱氨酸和n-丁酰基-半胱氨酸的合成。

还可通过上述的方法制备s-亚硝基-n,n'-二乙酰半胱氨酸(式iii-a中的x1和x2均为ch3c(o)-)，其中该硫醇原料是通过pirieetal.bichemicaljournal27176(1933)]描述的方法获得的。

在us6,613,937和bonnettetal.journalofthechemicalsociety,perkintransactions1:organicandbio-organicchemistry(1972-1999)(1979),(8),

1069-7中描述式iii的酯衍生物，即式(on)-s-ch2-ch(nx1x2)-c(o)-ox3的式iii-a'的化合物，其中x3为低级烷基(-ch3、-c2h5)。

其中x4和x5均为甲基的式iii的化合物，例如s-亚硝基-n-乙酰基-青霉胺(x1为氢，x2为乙酰基，且x3为氢，通常缩写为"snap")可以粉末的形式在市场上购得。

应该指出的是，式iii的合物可以以水溶液或固体形式(例如结晶或冷冻干燥的粉末)使用。

式iii的化合物，或更优选地，式iii的化合物与一种或多种亚硝胺形成抑制剂(尤其是维生素c)的混合物可用于禽类制品(例如，熏制禽类，例如熏制禽类胸部和熏制禽肉卷)；腌牛肉；和其他肉类制品，例如火腿或培根，以及肉类香肠。当然，这是主要肉类制品的非限制性列表。要提到的其他制品包括鱼、奶酪、啤酒和其他目前用亚硝酸盐浸渍溶液保存的制品。式iii的化合物(例如，iii-a)以足以发挥其有用作用的浓度添加到所述食物制品中，例如，将至少20ppm，例如30至1000ppm，更特别是50至500ppm，例如，100至400ppm，例如100至200ppm的式iii的化合物(例如，iii-a)添加到肉类中。本发明所述的方法能够减少向肉类中添加亚硝酸盐：亚硝酸盐的添加量可低于工业上目前可接受的量，例如，在肉类中的含量低于150ppm，即0-150ppm，优选低于120ppm，例如，低于75ppm。本发明的方法可不添加亚硝酸盐。

在本领域中称为“亚硝胺形成抑制剂”、“亚硝胺形成的阻断剂”、“亚硝胺清除剂”等的添加剂是能够防止或阻断或减少亚硝胺形成或活性的化合物，尤其是防止或阻断或减少食物，例如腌制食物，例如但不限于肉类、奶酪、鱼、麦芽啤酒制品中亚硝胺形成或活性的化合物。适用于本发明的亚硝胺形成的这类阻断剂的实例包括维生素c(抗坏血酸及其衍生物(例如，棕榈酸抗坏血酸酯)，它们已显示出与式iii的化合物一起发挥令人惊讶的作用)、维生素e及其衍生物、异抗坏血酸的钠盐、苯酚、多酚，例如没食子酸、单宁酸和含硫醇的化合物。亚硝鎓清除剂的其他实例包括苯甲酸酯、生育酚、生育三烯酚、硫氰酸酯、bht、bha、tbhq及其衍生物、亚硫酸酯(sulphites)、甜菜碱和衍生物、类胡萝卜素、视黄醇、硫代葡萄糖酸盐、麦芽酚以及一般单独的还原剂或不同量的一起产生协同作用的还原剂。

如上所述，式iii的化合物(例如，iii-a)可以以固体形式添加至肉类中，即，可将包含式iii的化合物、亚硝胺形成抑制剂以及常规添加剂(例如，氯化钠和糖)的混合物添加至肉类中而不添加水，例如，可通过用固体组合物摩擦肉类并使该成分在适当的时间段内扩散到肉类中。因此，本发明还提供固体肉类处理组合物，其包含式iii的化合物(例如，iii-a)、氯化钠和/或一种或多种糖。例如，本发明提供腌制盐混合物，其包含0.5至20％按重量计的式iii的化合物+80至99.5％按重量计的氯化钠，例如，2至20％按重量计的式iii的化合物+80至98％按重量计的氯化钠。所述腌制盐混合物可进一步含有亚硝酸盐，其含量低于目前在商业掺合物中使用的，例如，0至5％按重量计的亚硝酸盐。

将式iii的化合物掺入肉类中的另一种方法是借助包含水、式iii的化合物、氯化钠和任选的糖(葡萄糖、果糖、蔗糖，即单糖或二糖)以及任选地一种或多种上述亚硝胺形成抑制剂(例如，抗坏血酸)的液体肉类处理组合物。例如，合适的盐水按重量计包含水和足以在肉中提供约20至1000ppm的式ⅲ的化合物(如ⅲ-a)的量的式ⅲ的化合物，以及以下成分(％按重量计(g/100g)：

从0.05％至氯化钠的溶解度极限，例如5至25％nacl(更具体地说，调整盐水中的盐的浓度以在肉类中提供不超过10％的nacl，通常提供不超过肉类中含水量的约2％盐w/w)；

任选地0.05至15％按重量计的糖，例如，1至10％按重量计的糖，和

0.05至5％按重量计的抗坏血酸、异抗坏血酸酯或其盐(将盐水中抗坏血酸的浓度调整为每公斤肉类提供约400至500mg抗坏血酸)。

使用常规技术施加肉类处理液体组合物。例如，可在适合的针的帮助下将组合物注射或泵入肉类中。替代地或另外地，将肉类浸入液体组合物中以浸泡，即浸泡足够的时间以使液体能够扩散到整个肉类中。在us4,346,117中可找到生产肉类制品的详细程序，例如使用腌制溶液的全熏制火鸡和熏制切碎的鸡肉(当然，用本发明的式iii添加剂代替us4,346,117的腌制溶液中的次磷酸钠)。

应当注意，本发明的方法包括将式iii的化合物掺入肉类中，优选将式iii的化合物与一种或多种亚硝鎓清除剂结合后掺入肉类中，所述方法还可包括提供低氧环境的步骤，例如，在食物制备、包装、储存和销售的所有阶段，通过建立真空或用氮气(或其他惰性气体)吹扫以用惰性气体代替氧气来提供低氧环境。即，添加式iii的化合物是在真空(或其他惰性气体)产生或低氧环境形成之前、同时或之后进行的。

本发明的另一方面提供了一种食物制品，其含有至少10ppm、例如20ppm的式iii的化合物(本身或no释放后获得的形式，即相应的游离硫醇，或这两种形式)，例如，30至1000ppm、更特别地50至500ppm，例如，至少100ppm(100至400ppm，例如，100至200ppm)的式iii的化合物；以及至少20ppm、至少30ppm、且还优选至少50ppm的抗坏血酸或其他阻断剂。该食物(例如，肉类)制品可不含亚硝酸盐，但应注意的是，式iii的化合物不一定用于完全消除亚硝酸盐，而是用于减少亚硝酸盐的添加量。因此，在一些实施方案中，还提供亚硝酸盐腌制的肉类制品，其包含浓度至多150ppm(0-150ppm)、例如5至120ppm、优选地低于75ppm的亚硝酸盐以及本发明的添加剂。

式iii的化合物(例如，iii-a)可与亚硝酸盐或s-亚硝基半胱氨酸组合以达到有益的效果。式iii的化合物和亚硝酸盐可一起施用以达到更好的效果的一个实例为通过向肉类注射亚硝酸盐以使亚硝酸盐在常规加热、烹饪和/或熏制步骤中存在。以相当低水平添加亚硝酸盐，以从亚硝酸盐独特的作用(颜色和抑菌作用)获益，但不允许在煮熟/熏制制品中残留亚硝酸盐。添加式iii的化合物(例如，iii-a)以补偿减少的亚硝酸盐的负载量；在加热之前、期间或之后，可在包装前通过喷涂、刷涂或使用第二注射步骤来添加式iii的化合物。

式iii的化合物(例如，iii-a)被用于处理食物的方法中以达到一种或多种目的，例如减少微生物(例如，减少微生物的数量，抑制(或减慢)微生物随时间的数量的增加、防止或消除微生物的生长，例如，本文所述的微生物的生长)，改善颜色并有助于风味。以下报道的实验结果表明，式iii的化合物(例如，iii-a，特别是s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸)具有一系列益处。在肉类模型系统中，其中在与通常添加到肉类制品中的氯化钠和抗坏血酸一起的亚硝酸钠、s-亚硝基-半胱氨酸或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的存在下，以n-甲基苯胺为基准评估n-亚硝胺(即，n-亚硝基-甲基苯胺)的形成，发现与亚硝酸钠和s-亚硝基-半胱氨酸相比，在s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸存在的情况下，n-甲基苯胺向相应的n-亚硝胺的转化发生的可能性更小。在模拟胃部条件的酸性环境中，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸优于亚硝酸钠的优势更为明显。在用真空包装袋存储肉类的过程中，与在添加s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的肉类中相比，在添加亚硝酸盐的肉类中或添加(s-亚硝基-半胱氨酸)的肉类中，n-甲基苯胺转化为相应的n-亚硝胺的可能性更大；在添加s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的肉类中这一情况下，发现n-亚硝胺的水平在测试的存储期内基本恒定。与有氧条件相比，在添加亚硝酸盐的肉类中和添加s-亚硝基-半胱氨酸的肉类中，在储存期间施加高真空条件会抑制n-甲基苯胺转化为相应的n-亚硝胺；但n-亚硝胺的水平仍高于添加s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的肉类中所测的n-亚硝胺的水平。因此，结果表明，亚硝酸盐和s-亚硝基-半胱氨酸对产品周围氧气的含量的敏感性：氧气含量越高，这些添加剂产生的n-亚硝胺越多。相反，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸对氧气含量的变化相当不敏感，且不会通过增加n-亚硝胺的产生而对氧气含量的增加(即，由于氧气渗透到包装中)做出响应。对于s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸，在无氧和有氧条件下，n-亚硝胺的产量仍然相当低且恒定。s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸在4℃的长时间存储期间下进一步显示出良好的稳定性。总之，在模拟肉类生产、包装和胃消化的条件下，与亚硝酸盐和s-亚硝基-半胱氨酸相比，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸表现出较低的正如亚硝基化剂对仲胺的反应性。

另外，下面报道的实验结果表明，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸显示出足够的抗菌活性，至少与亚硝酸盐相当。亚硝酸盐在肉类工业中发挥的其他重要功能(保持肉类的颜色和增强肉类的风味)，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸至少同样能发挥作用。实际上，如下所示，添加s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的肉类比添加亚硝酸盐的肉类在更长的时间段内保留了出色的颜色特性。

附图说明

附图1为示出了在37℃通过n-甲基苯胺与下文实施例1中所述的不同试剂的反应(30分钟反应)产生的n-亚硝基-甲基苯胺的柱状图。箭头指示含量低于检测限。

附图2为示出了在37℃通过n-甲基苯胺与下文实施例2中所述的不同试剂的反应(30分钟反应)产生的n-亚硝基-甲基苯胺的柱状图。

附图3显示由n-甲基苯胺与s-亚硝基-半胱氨酸(2.5mm)在ph6.2下的反应形成n-亚硝基-甲基苯胺的动力学(上曲线)和n-甲基苯胺与s-亚硝基-n-乙酰基-半胱氨酸(2.5mm)在ph6.2下的反应形成n-亚硝基-甲基苯胺的动力学(下曲线)。

附图4为示出了在4℃通过n-甲基苯胺与下文实施例3中所述的不同试剂的反应(24小时反应)产生的n-亚硝基-甲基苯胺的柱状图。

附图5a-5f示出了在不同的条件下通过n-甲基苯胺与肉类系统中的不同试剂反应形成n-亚硝基-甲基苯胺的研究结果。

附图6a-6c示出添加剂对肉类的颜色的影响。

附图7为柱状图，其示出在用亚硝酸盐或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸制备的熏制牛肩熏牛肉(smokedbeefshoulderpastrami)中，天然存在的细菌的三个月后有氧菌落计数(板在30℃温育24小时，然后对菌落计数并计算cfu)。

附图8为柱状图，其示出在经亚硝酸盐、s-亚硝基-半胱氨酸(cys-sno)或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(nac-sno)处理的绞牛肉肩中，天然存在的细菌的0-4周后有氧菌落计数(板在30℃温育24小时，然后对菌落计数并计算cfu)。

附图9是显示在37℃24小时后细菌生长的柱状图，该细菌生长是通过测量在595nm下用2.5mmnac-sno或作为对照的ddw处理的产气荚膜梭菌(c.perfringens)悬浮液的od来确定的。

实施例

材料

柠檬酸三钠、37％盐酸(hcl)、n-甲基苯胺、l-抗坏血酸(aa)、亚硝酸钠、l-半胱氨酸和n-乙酰基-l-半胱氨酸购自sigma-aldrich(美国)。乙腈、水和氯化钠购自j.t.baker(美国)。柠檬酸购自bio-labltd.(以色列)。通过混合适量的0.1m柠檬酸和适量的0.1m柠檬酸三钠制备柠檬酸缓冲液，用hcl调节ph。所有溶剂均为hplc级。新鲜绞牛肉在当地一家超市购买。

方法

hplc分离是在由lachroml7100泵和lachromdadl7450检测器组成的merck/hitachihplc系统上进行的。该系统使用带有lachrom界面d7000和ezchromelite3.3.1软件的数据处理器进行操作。使用梯度洗脱体系在kinetexevoc18柱(250×4.6mm,5μm)上分离混合物，溶剂a为5％乙腈水溶液(v/v)，以及溶剂b为乙腈。梯度条件为：初始＝0％b，25分钟＝70％b和30分钟＝100％b。流速恒定在1.0mlmin^-1。进样定量环体积(injectionloopvolume)为20μl，在272nm处监测吸光度。

制备1

制备s-亚硝基硫醇

通过使等摩尔量的亚硝酸钠与相应的硫醇(即，l-半胱氨酸或n-乙酰基-l-半胱氨酸)在hcl(1m)中进行反应来合成s-亚硝基硫醇。反应在氮气下在室温进行5分钟，此时出现了特征性的红色。

通过测量334nm处的uv吸光度来定量如此形成的s-亚硝基硫醇：s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-乙酰基-半胱氨酸。根据反应中所用硫醇的量并假设反应已完成，由未提纯的s-亚硝基硫醇的uv光谱估算消光系数。s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-乙酰基-半胱氨酸没有从反应混合物中分离出来并且以溶液的形式用于下面报道的实验中。

实施例1

在37℃，由n-甲基苯胺与亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)的反应形成n-亚硝基-n-甲基苯胺

在柠檬酸盐缓冲液中，在ph＝3.0模拟胃部条件以及在ph＝6.2模拟肉类条件下，使用n-甲基苯胺(0.25mm)和nacl(2.5mm)以及如下所示的等摩尔量的所测试的亚硝基化剂(单独使用或与抗坏血酸组合使用)来制备反应混合物：

1.亚硝酸钠(0.25mm)；

2.亚硝酸钠(0.25mm)+抗坏血酸(1mm)；

3.s-亚硝基-半胱氨酸(0.25mm)；

4.s-亚硝基-半胱氨酸(0.25mm)+抗坏血酸(1mm)；

5.s-亚硝基-半胱氨酸(0.25mm)+抗坏血酸(2mm)；

6.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(0.25mm)

7.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(0.25mm)+抗坏血酸(1mm)

8.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(0.25mm)+抗坏血酸(2mm)

将反应容器置于37℃的水浴中30分钟。随后将反应混合物转移至hplc中以分析反应产物n-亚硝基-甲基苯胺。在附图1中以柱状图的形式示出了ph3.0的反应和ph6.2的反应的hplc分析的结果(箭头表示结果低于检测限)。

hplc分析表明，与亚硝酸钠或s-亚硝基半胱氨酸相比，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(单独使用或与抗坏血酸组合)能够更有效地抑制亚硝胺(即，n-亚硝基-甲基苯胺)的形成。

实施例2

在37℃，由n-甲基苯胺与亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)的反应形成n-亚硝基-n-甲基苯胺

重复实施例1的实验，使反应物的浓度增加十倍。即，通过在ph＝3.0和ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中混合n-甲基苯胺(2.5mm)和nacl(2.5mm)以及如下所示的等摩尔量的所测试的亚硝基化剂(单独使用或与抗坏血酸组合使用)来制备反应混合物：

1.亚硝酸钠(2.5mm)；

2.亚硝酸钠(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)；

3.s-亚硝基-半胱氨酸(2.5mm)；

4.s-亚硝基-半胱氨酸(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)；

5.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)

6.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)。

在图2中以柱状图的形式表示了ph3.0的反应和ph6.2的反应的hplc分析的结果。s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸也从这项研究(即在高浓度条件下进行的实验)中取得胜利。

附图3显示在ph6.2下由s-亚硝基-半胱氨酸(2.5mm)与n-甲基苯胺(2.5mm)的反应形成n-亚硝基-甲基苯胺的动力学(上曲线)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)与n-甲基苯胺(2.5mm)在ph6.2下的反应形成n-亚硝基-甲基苯胺的动力学(下曲线)，如通过测量在270nm处的uv吸光度所监测的。

从吸光度对时间的关系图中可以看出，s-亚硝基-半胱氨酸与n-甲基苯胺快速反应，以生成逐渐增加的量的亚硝胺。相反，对于s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸和n-甲基苯胺的反应，亚硝胺的形成要少得多，并且在短时间后保持不变。

实施例3

在4℃，由n-甲基苯胺与亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)的反应形成n-亚硝基-n-甲基苯胺

重复实施例2的实验，但是这次反应在4℃进行24小时，ph为6.2，以模拟用于长期储存肉类的条件。即，通过在ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中混合n-甲基苯胺(2.5mm)和nacl(2.5mm)以及如下所示的等摩尔量的被测试的亚硝基化剂(单独使用或与抗坏血酸组合使用)来制备反应混合物：

1.亚硝酸钠(2.5mm)；

2.亚硝酸钠(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)；

3.s-亚硝基半胱氨酸(2.5mm)；

4.s-亚硝基半胱氨酸(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)；

5.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)

6.s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)+抗坏血酸(2.5mm)。

将反应容器在4℃保持24小时。n-亚硝基-甲基苯胺水平的hplc分析结果以柱状图的形式示于附图4中。显然，在储存条件下，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸与维生素c的结合表现出人意料地好，这可以看出该组合能够非常有效地减少n-亚硝基-甲基苯胺的形成。

(在所附的柱状图中，柱状的位置从左到右对应于所报告的实验顺序)。

实施例4

在肉类模型系统中，由n-甲基苯胺与亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)的反应形成n-亚硝基-n-甲基苯胺

肉类中含有可影响n-亚硝胺形成的物质(例如，抗坏血酸、游离l-cys和肌红蛋白)。本文报道的研究目的是测量由添加到绞牛肉中的仲胺n-甲基苯胺与被测试的硝基硅烷化剂一起形成的n-亚硝胺。

如下具体所述的，进行了一组标记为a、b、c、d、e和f的实验。通常，将n-甲基苯胺(0.25mm)和nacl(0.25mm)混合到1克绞牛肉中。然后添加测试的添加剂：亚硝酸钠、s-亚硝基-半胱氨酸或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(2.5mm)。使用kg＝l，将浓度计算为每公斤肉类中的最终浓度。在一个实验(f)中，将实验条件扩展到模拟实际的肉类加工(增加氯化钠的量并添加抗坏血酸)。

根据可接受的工业用肉类制备规范(gmp–良好生产规范)加工肉类，即，将肉类加热至72℃(在水浴中加热2分钟，以在产品中心达到该温度)，然后转移至4℃进行冷却(30分钟)或存储(24至216小时)。为了评估氧气对肉中n-亚硝胺形成的影响，一些样品使用multivacc100装在真空袋中(参见实验d和e)，而其余样品则放入4ml密闭的玻璃小瓶中。

最终将肉在柠檬酸盐缓冲液中匀浆。向肉类中添加3ml柠檬酸盐缓冲液(ph6.2)，并使用kinematicapolytronpt3000将混合物匀浆。在一个旨在评估在酸性胃环境中消化后n-亚硝胺的形成的实验(c)中，用ph3的柠檬酸盐缓冲液使该肉类匀浆。然后将ph3.0的匀浆液在37℃的水浴中温育30分钟，以模拟胃的消化条件。

将乙腈(2ml)添加到匀浆液中并涡旋以萃取n-亚硝胺。然后使用thermoscientificheraeusmegafuge16r将混合物以4696xg的速度离心10分钟。使用13mm,0.45μm,ptfe注射过滤器过滤上清液，以进行hplc分析。

更具体地说，根据具有一些变化的上述步骤进行了六种不同类型的实验，结果分别示于附图5a-5f中：

a)将所述肉类在72℃加热，冷却至4℃(30分钟)，然后立即在ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中匀浆。

b)将所述肉类在72℃加热，冷却至4℃，在4℃储存二十四小时，然后在ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中匀浆。

c)将所述肉类在72℃加热，冷却至4℃，在4℃保存24小时，在ph＝3.0的柠檬酸盐缓冲液中匀浆，然后在37℃温育30分钟。

d)用真空袋包装(真空至100mbar)后，将所述肉类加热至72℃，在4℃保存不同的时间段，然后在ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中匀浆。

e)用真空袋包装(真空至8mbar)后，将所述肉类加热至72℃，冷却至4℃，然后立即在ph＝6.2的柠檬酸盐缓冲液中匀浆，或在不同时间段储存后匀浆。

f)也用2％(w/w)nacl和3.27mm抗坏血酸(aa，576ppm)处理所述肉类。将肉类制品在75℃的水浴中加热5分钟(在制品中心测得的温度为72℃3分钟)，然后在4℃保存216小时。储存后，将所述肉类匀浆而不温育，或将所述肉类匀浆且在37℃的柠檬酸缓冲液ph3.0(胃介质)中温育30分钟。

这些实验的结果分别示于附图5a-5f中；在图中，cys-sno表示s-亚硝基-半胱氨酸，nac-sno代表s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸。

实验a-c：柱状图表明立即加热和冷却(附图5a)后，主要由s-亚硝基-半胱氨酸立即形成～28μm的n-亚硝胺，而亚硝酸钠和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸均能将n-亚硝胺形成水平保持低于10μm。在4℃保存24小时(图5b)后，亚硝酸盐和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的形成分别增加到15μm和13μm。s-亚硝基-半胱氨酸形成的n-亚硝胺明显高于亚硝酸盐和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸。在消耗后，肉类在酸性胃液ph中被消化。模拟这些条件的实验结果示于附图5c中。亚硝酸盐形成的n-亚硝胺的数量增加了7倍，达到115μm。通过s-亚硝基-半胱氨酸的形成增加至47μm。但是，通过s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的形成继续保持在15μmna的较低水平。结果表明，在酸性环境中，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸比亚硝酸盐具有更好的抑制n-亚硝胺形成的能力。

实验d-e：通过在加热之前将处理过的肉类包装在真空袋中来评估氧气的影响。然后将抽真空的肉类加热至72℃并在4℃保存，并测量n-亚硝胺的形成。在100mbar的真空(附图5d)下储存24小时后，所有三种处理均形成19μm。但是，在储存期间，经亚硝酸钠和s-亚硝基-半胱氨酸处理过的肉类样品中的n-亚硝胺水平在192小时后增至～50μm，而添加了s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的样品中n-亚硝胺的形成没有变化，并保持在～20μm。在8mbar的更高真空条件(附图5e)下，在216小时后，亚硝酸盐形成的n-亚硝胺是其它试剂的两倍。与有氧条件相比，在无氧条件下，亚硝酸盐和s-亚硝基-半胱氨酸形成的n-亚硝胺形成减少～40％，而s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸形成的n-亚硝胺保持较低且不变。

实验f：模拟肉类加工条件(包括向肉类中添加抗坏血酸和氯化钠)的实验结果(图5f)表明，仅在30分钟内，将肉类转移到ph3.0的模拟胃介质中，在抗坏血酸的存在下，亚硝酸盐产生高浓度的n-亚硝胺：在模拟的胃介质中，n-亚硝胺的水平增加至超过四倍，从～20μm增至90μm。在转移至ph3.0的模拟胃介质后，s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸在肉类制品中产生的n-亚硝胺浓度几乎没有改变。

总之，从抑制n-亚硝胺形成的角度来看，s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸显然是在肉类模型系统中进行的研究中的最佳添加剂。

实施例5

亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)对肉类的颜色的影响

已知亚硝酸盐是与腌制肉类制品相关的特征性粉红色和风味稳定性的原因。将s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸处理的绞牛肉在加热到72℃后的显色和颜色稳定性与用亚硝酸盐处理的绞牛肉的颜色进行比较。使用便携式色度计(x-rite)测量用不同添加剂处理并在微波炉(dow,南韩,800w)中加热至中心72℃的绞牛肉样品的hunter色亮度、红度和黄度(l*,a*,b*)值。使用白色和黑色标准板将仪器标准化。

结果在附图6a和6b中以柱状图的形式给出。用s-亚硝基半胱氨酸或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸处理的肉类和用亚硝酸钠处理过的肉类之间的总色差(δe*)(附图6a)和红度(δa*)(附图6b)存在显著差异。用s-亚硝基-半胱氨酸或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸处理的肉类的红度是用亚硝酸钠处理的肉类的两倍，且颜色更好(处理之间的黄度(δb*)没有区别，因此未显示这些结果)。在有氧条件下的rsno处理(s-亚硝基-半胱氨酸或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸)中，颜色在24小时内保持稳定，而在经亚硝酸盐处理的肉类中颜色随时间而减少(参见附图6a)。该差异也很容易从如所附的附图6c的照片中看出。

实施例6

亚硝酸钠(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)在熏制牛肩中的抗菌活性

熏制牛肩的生产过程：盐水成分[水、改性淀粉(e-1442)、麦芽糊精、盐、增味剂(味精、酵母提取物)、防腐剂(乳酸钾和乙酸钾以及亚硝酸钠或s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸)、磷酸盐、角叉菜胶、调味料、抗氧化剂(牛至提取物、抗坏血酸)]混合以形成盐水溶液。将s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸以新鲜制备的水溶液的形式添加到盐水中(相当于最终产品中150ppm亚硝酸钠和2％nacl)。

接下来，将盐水以50％(w/w)添加至先前清除脂肪然后切成大块的牛肩肉中。然后在真空下将肉翻滚。为了乳化该肉，将约23％的肉转移到工业切割机上。之后，将乳剂在搅拌机中与其余的滚筒肉混合几分钟。然后将肉塞入纤维肠衣中，将其转移至蒸汽蒸煮直至制品的中心的温度达到72℃。然后将制品快速冷却至4℃，切片，然后在低氧气氛下包装。将熏牛肉在4℃保存三个月。

熏牛肩熏牛肉中天然存在的细菌的需氧菌落计数：将如上所述在肉类工厂生产的5克熏牛肉在无菌研磨机中用45ml无菌盐水匀浆，然后进一步用盐水稀释。将稀释液铺在bhi琼脂平板上，在30℃温育24小时，然后对菌落计数并计算cfu。

在附图7中以柱状图的形式显示的结果表明，亚硝酸盐和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸的抗菌活性是相当的，可看到在三个月后，在制品的保质期过期后，经处理的熏牛肉产生相似浓度的细菌：经亚硝酸盐处理的熏牛肉产生8*10³cfu/ml，经s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸处理的熏牛肉产生7*10³cfu/ml。

实施例7

亚硝酸钠(比较)、s-亚硝基-半胱氨酸(比较)和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸(本发明)在绞牛肉中的抗菌活性

将10克绞牛肉肩与1ml(25mm)的测试防腐剂(亚硝酸钠、s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸)或作为对照的ddw水溶液，以及1mlnacl溶液(10％w/v)混合。最终浓度为2.5mm防腐剂(其中kg肉＝l)和1％(w/w)nacl。将肉分成1克份，放入打开的真空袋中，然后在75℃的水浴中加热15分钟，并用multivacc100在8毫巴的真空下密封。将袋子转移到4℃进行冷却和储存。经过1小时、1周和4周的时间段后，将袋在通风橱中打开，并将1克肉在9ml无菌盐水的无菌研磨机中匀浆，然后将匀浆液进一步用盐水稀释，且将稀释剂铺在bhi琼脂板上。将板在30℃温育24小时，然后计数菌落并计算cfu。

结果以柱状图的形式示于附图8中。可看出，在4℃冷却1小时后，所有处理的细菌浓度均相似，为～10²-～10³。在4℃储存1周后，经亚硝酸盐处理的肉的细菌计数略有增加至5.8*10³cfu/ml，而s-亚硝基-半胱氨酸和s-亚硝基-n-乙酰半胱氨酸保持在约～2.0*10²，与对照(3.3*10⁶)相比，所有三种处理的细菌浓度均显著降低。4周后，亚硝酸盐处理的肉中细菌浓度为～10⁸，而cys-sno和nac-sno处理的肉中细菌浓度较低。

实施例8

nac-sno对产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)的作用

产气荚膜梭菌细胞在液体硫代乙醇酸盐培养基(ftm)中于37℃过夜生长。然后将细菌悬浮液在ftm中稀释，以在595nm处达到0.1a的光密度(od)。将悬浮液分到试管中(每个试管7ml)，然后将70μlnac-sno添加至试管中，最终浓度为2.5mm。添加ddw作为对照。将试管轻轻混合并在37℃温育24小时。通过测量595nm处的od值来确定细菌生长。结果以柱状图的形式示于附图9中。