蛋白质分离物及其产生方法与流程

本发明涉及从油籽，如油菜籽和向日葵种子中提取和/或分离蛋白质，特别是芸苔籽蛋白(napins)的方法。本发明还涉及由此获得的产物。
背景技术：
：油种子如大豆、油菜籽(也称为芥花籽)和向日葵种子是具有高营养价值的重要蛋白质来源。特别地，油菜籽中包含的蛋白质属于白蛋白类型并且允许乳液和泡沫的稳定。油菜籽中的两种主要贮藏蛋白质是十字花科蛋白(12s球蛋白)和芸苔籽蛋白(2s白蛋白)，它们分别占成熟种子总蛋白质的50重量％和30重量％。十字花科蛋白是具有两条多肽链的至少6个亚基的寡聚蛋白质。十字花科蛋白的分子量约为300kda，尽管其范围可为230至360kda。十字花科蛋白具有乳化和形成凝胶的性质。芸苔籽蛋白是小得多的蛋白质，其分子量范围为12至15kda。它们由分别为4(α)和9(β)kda(β)的两条多肽链组成，该两条多肽链在其天然构象中通过二硫键连接。芸苔籽蛋白具有优异的起泡性质，类似于或优于卵白蛋白。此外，芸苔籽蛋白具有平衡的氨基酸组成，并且包含所有必需氨基酸。因此，提取蛋白质，如芸苔籽蛋白和最终的十字花科蛋白对于在食品工业中的用途尤为重要。然而，油菜籽提取物可能含有不可接受的抗营养成分，如植酸、芥子油苷和芥子酸。此外，植酸((1r,2r,3s,4s,5r,6s)-环己烷-1,2,3,4,5,6-己基六[二氢(磷酸盐)])是一种当存在时对蛋白质以相当低的浓度溶于水的能力产生不利影响的组分。相对于蛋白质的总重量，植酸的重量浓度高于10或甚至5wt％将基本上阻止芸苔籽蛋白溶解在水中，并且使其尤其不适合作为食品成分。植酸也是抗营养化合物，因为它降低矿物质的生物利用度，并且由于它与蛋白质形成会被消化酶稍微降解的复合物。出于所有这些原因，去除所有或大部分天然存在的植酸是为了获得具有高营养和经济价值的基于芸苔籽蛋白的提取物、分离物或组合物的重要步骤。为了从液体提取物中纯化蛋白质，可以通过添加高浓度的作为促溶剂的硫酸铵来使蛋白质沉淀。这样做，可用于蛋白质溶剂化的水量急剧减少，从而引起择性的蛋白质沉淀。结果，然后可以将蛋白质与植酸(连同其他抗营养化合物)分离。然而，当考虑到芸苔籽蛋白时，沉淀蛋白质所需的硫酸铵浓度接近6m。因此，由于使用如此高浓度的沉淀剂带来的成本和污染，这类方法不适用于大规模的提取过程。nioi等人的“《选择性提取、结构表征和抗真菌活性(selectiveextraction,structuralcharacterizationandantifungalactivity)》”，《食品化学(foodchem.)》，134(2012)2149-2155]描述在实验室规模下获得芸苔籽蛋白的方法。观察到油菜籽粕在ph2下，在水中12％(w/w)，在室温下提取15分钟的最佳提取条件。在这些条件下，提取是选择性的。将芸苔籽蛋白从在65％硫酸铵饱和度下离心后获得的提取液相中沉淀出来，然后以初始体积的三分之一重新悬浮在水中。所得芸苔籽蛋白分离物的纯度为92％。然而，为了获得芸苔籽蛋白沉淀物所需的高浓度硫酸铵在工业规模上是不合适的。此外，当将工业上已知的纯化技术，即微滤和超滤应用于nioi替代沉淀剂的使用时，相对于粉末所含有蛋白质的总重量，所得粉末中植酸的含量为8.4wt％。如前所述，这类量对于可行的商业产品而言太高。因此，非常希望提供获得包含、由或基本上由具有低或可忽略量的植酸和/或在水中的高增溶性质的低分子量芸苔籽蛋白型蛋白质组成的组合物的高收率方法以及这类组合物。替代地，或另外地，也非常希望提供基本上由低分子量芸苔籽蛋白型蛋白质组成的组合物，其具有可忽略不计量的植酸和/或在水中的高溶解性质。akbar,j.wu/lwt-《食品科学与技术(foodscienceandtechnology)》，64(2015)308-315描述使用酸洗(ph4)、碱萃取(ph12.5)、等电沉淀(ph4)和超滤从己烷脱脂的芥花籽粕获得的芸苔籽蛋白和十字花科蛋白提取物。尽管在芸苔籽蛋白提取物中实现低含量水平的植酸，但芸苔籽蛋白含量相对较低(81.9％±1.2w/w)。cheung等人在《ph和nacl对芸苔籽蛋白分离物的乳化性质的影响(effectofphandnaclontheemulsifyingpropertiesofanapinproteinisolate)》(《食品生物物理(foodbiophysiscs)》，(2015)10:30-38)中描述由己烷脱脂的芥花籽粕提取芸苔籽蛋白和十字花科蛋白的方法，其包括在约2.5至约5.0的ph下对十字花科油籽粕进行水提取以获得可溶性富含芸苔籽蛋白的蛋白质提取物和十字花科蛋白残基的步骤。使用少量盐(0.75％w/v)进行此步骤，并且不知道芸苔籽蛋白的浓度。技术实现要素：本发明的一个目的是克服此缺点，并提供用于从油籽粕中提取/纯化蛋白质，特别是低分子量蛋白质的方法，该方法产生几乎没有或没有植酸的蛋白质提取物。有利地，该方法还可以实现蛋白质提取物的高产率和/或高纯度。根据本发明的一个方面，提供由油籽粕产生蛋白质分离物的方法，所述分离物包含蛋白质和含量为4wt％或更少、优选为3wt％或更少、最优选2wt％或更少的植酸，所述植酸的量按所述蛋白质的总重量计。此方法包括以下步骤：a.提供油籽粕；b.将油籽粕与第一水性溶剂混合以形成ph范围为6至7.8的浆料，所述浆料具有固相；c.从所述浆料中分离所述固相，d.在范围为1至3.5、优选2至3的ph下，将所述分离出的固相与第二水性溶剂混合以形成混合物，所述混合物具有液相；e.从步骤d)中形成的所述混合物中分离所述液相；f.f1)在适于植酸酶活性的温度和ph下，将分离出的液相与植酸酶混合，以获得具有液相和固相的混合物；和/或f2)在范围在40℃至70℃的温度下，将分离出的液体与盐混合，以获得所述盐的摩尔浓度范围为0.01m至0.5m的所得液体组合物，从而获得具有液相和固相的混合物；g.例如通过将混合物冷却至30℃或更低的温度的冷却步骤来从步骤f)的液体中沉淀出固相；h.将所述固体沉淀物与步骤g)的液体分离，所述液体包含富水液相和富油液相；i.将所述富水液相与所述富油液相分离，j.使步骤i)中获得的所述富水液相经受一次或多次膜过滤，以获得蛋白质分离物；和k.任选地，干燥所述蛋白质分离物以获得干燥的蛋白质分离物。步骤a)所用的油籽粕可以是下文所述和/或制备的任何一种。步骤b)步骤b)的第一水性溶剂是能够提取水溶性蛋白质的液体，并且其基本上由水构成，即其至少包含占水性溶剂总重量的80wt％的水。有利地，水性溶剂由水组成或基本上由水组成。水性溶剂可以由任何类型的可用水如自来水组成。它可以进一步包含小比例(例如小于20wt％、15wt％、10wt％、5wt％、2wt％或1wt％)的至少另一种组分。这类其他组分可以是天然存在于水中或故意添加以调节步骤b)的浆料的ph的化合物。例如，它可以是矿物或盐，例如naoh。如果存在盐，则其有利地是nacl、kcl或cacl2，优选nacl。如果需要，可以通过添加1mnaoh水溶液进行ph调节。优选不使用溶剂，如甲醇、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等。特别地，优选在步骤b)中使用的水性溶剂中不使用有机溶剂。然而，如果要使用有机溶剂(即具有碳链的化合物)，则其存在量应仅低于20wt％、15wt％、10wt％、5wt％、2wt％或1wt％，因此它们在最终产品中的存在可以减少到可接受或可忽略的量。使用常规方法将油籽粕和第一水性溶剂混合在一起以形成含有溶解的蛋白质的浆料，并且可以进一步包含蛋白质、油和任选的纤维以及抗营养化合物的悬浮液。(优选部分脱脂)的油籽粕/第一水性溶剂(优选水)的重量比范围通常为1:5至1:20(w/w)，优选为1:6至1:10(w/w)，甚至更优选约1:8(w/w)。浆料的温度优选高于室温。特别地，温度范围可为40至70℃，优选50至60℃(例如约55℃)。使用例如氢氧化钠的浓溶液，将浆料的ph调至范围在6至7.8的ph，优选从6.8至7.5一旦调节ph，通常在搅拌或搅动下进行步骤b)，持续时间范围为10分钟至2小时，优选30至70分钟(例如约45分钟或约1小时)。步骤b)可以在有或没有植酸酶消化的初始步骤的情况下通过添加植酸酶来进行。如果首先使用植酸酶，则首先将混合物放置一定的时间段，以进行消化步骤。这可以持续40分钟到90分钟，最好是一个小时。在这个时间段之后，然后优选将ph调节至6.8±0.1。另外，当使用植酸酶时，进行液/固萃取步骤，如下文步骤c)中所述的步骤，并且在执行步骤c)之前，优选在室温下(或考虑到微生物问题时在范围为52至60℃的温度下)用水洗涤获得的固体级分(湿饼)。如果不使用植酸酶，则优选将施加的ph调节至约7.2±0.3。据认为，不需要这类植酸酶初始步骤来获得所需的低分子量蛋白质(lmwp)提取物。然而，在从油籽粕中提取和/或分离lmwp和高分子量蛋白质(hmwp)的过程中可为有利的。步骤c)一旦进行了步骤b)(有或没有植酸酶消化步骤，以及有或没有固体的水洗步骤)，就从浆料中分离固相。进行这种分离的工具在本领域中是众所周知的，并且包括离心工具，如倾析器离心机、过滤工具、压榨工具如螺旋压榨机、压滤机、带式压榨机、法式压榨法、倾析工具和/或将浆料分离成固相和液相的任何其他工具。可以使用倾析器离心机，例如在范围为2000至6000g、优选3000至5000g，例如约4600g的g力下进行此分离。如本领域技术人员将直接理解，固相含有小比例的液体，并且相对而言，液相将包含小比例的固体或固体颗粒。因此，在本发明的具体实施方案中，含有残余固体的液相进一步经受使用例如至少一个叠盘离心机的另一分离步骤。此离心的g力的范围可以为6000至20000g，可选地为17000g。根据一个优选的实施方案，通过液相的此离心分离获得的富固体的沉积物被添加到在步骤c)中获得的固相中，以便进行萃取步骤d)。步骤d)固相富含水不溶性蛋白质，并且可以包含或可以不包含富含固体的沉积物，其由对步骤c)中获得的液相进行进一步处理而获得。步骤d)的第二水性溶剂是能够提取水溶性蛋白质的液体，并且其基本上由水构成，即其至少包含水性溶剂总重量的80wt％的水。有利地，水性溶剂由水组成或基本上由水组成。水性溶剂可以由任何类型的可用水如自来水组成。它可以进一步包含小比例(例如小于20wt％、15wt％、10wt％、5wt％、2wt％或1wt％)的至少另一种组分。这类其他组分可以是天然存在于水中或故意添加以调节步骤d)的混合物的ph的化合物。例如，它可以是矿物或盐，如可用于食品或饲料的酸，例如盐酸、磷酸、硫酸、乳酸、柠檬酸，优选磷酸。如果存在盐，则其有利地是nacl、kcl或cacl2，优选nacl。如果步骤d)包括ph调节，则可以通过添加所述酸的水溶液或其混合物来进行。优选不使用溶剂，如甲醇、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等。特别地，优选在步骤d)中使用的第二水性溶剂中不使用有机溶剂。然而，如果要使用有机溶剂(即具有碳链的化合物)，则其存在量应仅低于20wt％、15wt％、10wt％、5wt％、2wt％或1wt％，因此它们在最终产品中的存在可以减少到可接受或可忽略的量。将固相和第二水性溶剂混合在一起以形成含有溶解蛋白质的混合物，并且可以进一步含有蛋白质、油和任选的纤维以及抗营养化合物的悬浮液。该混合物的ph调节至范围为1至3.5，优选为2至3的ph使用常规方法将富固体相和第二水性溶剂混合在一起以形成含有溶解的蛋白质的混合物或浆料，并且可以进一步含有蛋白质、油和任选的纤维以及抗营养化合物的悬浮液。固相/第二水性溶剂(优选水)的比例范围通常为1:2至1:12，例如约1:3(w/w)，或者优选地干物质含量范围为4％至15％。混合物的温度优选为室温。特别地，其范围可以为15至60℃，优选为15至25℃(例如约18℃)。使用例如磷酸的浓溶液(例如，浓度为1m或2m的水溶液)或hcl(例如，浓度1m的水溶液)，将浆料的ph调节至范围为1至4、优选1.5至3的ph，例如约2的ph一旦调节ph，通常优选在搅拌或搅动下进行步骤d)，持续范围为5分钟至2小时，优选10分钟至60分钟(例如20至30分钟)的时间段。步骤e)然后分离浆料的液相。进行这种分离的工具在本领域中是众所周知的，并且包括离心工具，如倾析器离心机、过滤工具、压榨工具如螺旋压榨机、压滤机、带式压榨机、法式压榨法、倾析工具和/或将浆料分离成固相和液相的任何其他工具。可以例如以在范围为2000至20000g、优选3000至17000g，特别是在约4600g或15000g的g力下使用倾析器离心机进行此分离。可以施加几分钟至长达1或2个小时的这种力。如本领域技术人员将直接理解的，液相可以包含小比例的固体或固体颗粒。因此，在本发明的具体实施方案中，含有残留固体的液相可以进一步经受使用例如至少一个叠盘离心机的另一分离步骤。根据本发明的另一个实施方案，可以进行从步骤e)的第一分离获得的上清液的过滤固体/液体(例如使用whatman过滤器)。滤液可进一步经受进一步的离心步骤(如上述步骤(例如15000g))。在步骤f)中回收并处理液体上清液经。由此获得的液相富含水溶性蛋白质。步骤f)然后此液相经受植酸去除步骤f)，其可以是描述为f1)和/或f2)的步骤。步骤f1)根据本发明的特别优选的变型，然后可以在步骤f1)中适于植酸酶活性的温度和ph下使分离的液体与ec3.1.3.x类型的植酸酶(磷酸单酯水解酶磷酸酶)接触。这类酶是可商购的，并且可以来自微生物或酵母，如黑曲霉。例如，以phytasemaxamyltm(参见下文)的名称出售的植酸酶适合于实施本发明。为了增强植酸酶活性，温度可以有利地调节在40℃至70℃、优选50℃至60℃、更优选53℃至57℃的范围内并且最优选在55℃。合适的ph可以在3.8至5.5、优选4至5的范围内选择。即使建议的ph通常较高(约ph5)，也意外地发现4.3±0.2的ph可以提供良好的结果。可以通过添加碱的溶液如1m的naoh水溶液来调节ph。步骤f1)使得能够消化植酸并且可以持续任何合适的时间段，如15至240分钟，优选60分钟。通常，施加连续搅拌。步骤f1)通常需要40到90分钟，优选一个小时。相对于步骤e)中获得的液相干物质的重量，所使用植酸酶的量优选为约1wt％。在一个有利的实施方案中，温度范围为40℃至70℃、优选50℃至60℃、更优选53℃至57℃，并且最优选在55℃下，并且ph范围为3.8至5.5(用碱时，例如1m的naoh)，优选4至5的范围。步骤f2)替代地，根据本发明的另一个变型，可以在步骤f2)中将分离的液体与盐如nacl、kcl或cacl2(优选nacl)混合，以获得所述盐的摩尔浓度为从例如饱和溶液起或为0.01m至0.5m、优选0.05m至0.5m，或0.05m至2m、优选0.1m至1m(特别是约0.5m)的水溶液的所得液体组合物。约0.5m±10％的浓度已示出特定功效。0.2m至0.5m的范围，或更特别地0.3m至0.5m的范围对于实施本发明的方法特别有益。温度有利地设置在范围为40℃至70℃、优选50℃至60℃、更优选55℃的温度下。约55℃(即±2℃)的此温度已示出特定功效。可以将混合物搅拌任何合适的时间，例如15至240分钟、优选60分钟。最终，可以有利地将介质的ph范围调节至1至3.5，优选2至3。为了设置ph，可以使用步骤d)中使用的酸的一种。根据本发明的另一个变型，可以组合使用可选步骤f1)和f2)。包括步骤f1)和/或f2)的步骤f)允许植酸的降解和/或所述酸与芸苔籽蛋白分离。步骤g)此步骤使步骤f)中获得的混合物中的一些沉淀。由于此步骤优选在高于环境温度的温度下进行，因此合适的沉淀剂是温度降低。在这类步骤中，将温度降低(例如，使其冷却)至约30℃或更低，优选降低至范围10℃至25℃的温度。沉淀物形成固相。步骤h)使用先前在步骤c)或步骤e)中描述的离心工具之一，从液体中分离固体沉淀物。优选地，首先使用施加范围可为15000g至20000g，特别是约17000g的g-力的倾析器离心机来进行这类分离。从介质中除去固相，并且然后处理液相以获得富油相和富水相。互溶性低的这两个液相可以自发地分离。因此，允许相分离的处理(步骤i))可以是简单的倾析。然而，可以使用本领域技术人员众所周知的并且相对于步骤c)和e)描述的分离液相的其他处理。在此步骤中，分离包括例如离心。步骤i)如果回收的液相含有两种不混溶的液相，则可以对其进行处理，以便将富含油的“轻”或更高级的液相与水或富蛋白质的“重”或更低级的液相分离。当然，术语“富油”或“富蛋白质”是相对的，并且仅意指相中的一个比另一相在油或蛋白质的重量含量中具有较高比例。此步骤或撇渣步骤可以使用撇渣器例如撇渣离心机、2相离心机或3相离心机来进行。最好使用3相叠盘撇渣器。步骤j)从步骤i)萃取的“重”或含水液相为富含蛋白质的并且经受微滤(和渗滤)、超滤和/或在超滤后经受渗滤以回收纯化的蛋白质溶液。通常做法是，可以有利地使用多个(即两个以上)渗滤体积。过滤除去由增溶的植酸、植酸衍生物、糖、酚类化合物、游离氮、矿物化合物及其混合物构成的一组化合物中的大多数或至少一种。优选的是使用微滤的第一步过滤步骤。这类微量过滤可以通过使用具有标称孔径范围为0.1μm至2μm、优选为0.1μm至1μm的过滤膜来进行。通常，在用水的情况下，微滤可以包括一个或多个渗滤体积。此外，对于一些或所有过滤和/或渗滤步骤，可以有利地控制和/或调节ph。为了调节ph，可以向水中添加ph调节剂，例如磷酸。这类受控ph可以有利地选择在约4.5，例如4.3。随后或替代地，可以使用超滤/渗滤。优选使用由合适材料如具有高蛋白质保留率的聚砜(ps)或聚醚砜(pes)制成的过滤装置进行超滤。过滤材料的截留分子量(mwco)的范围可以为3kda至10kda，优选为3kda至5kda。此外，对于一些(例如第一或几个第一)或所有过滤和/或渗滤步骤，可以有利地控制和/或调节ph，例如约4.5，例如4.3。为了调节ph，可以向水中添加ph调节剂，例如磷酸。在一个优选的实施方案中，温度也可以稍微升高(例如约30℃)或更高地升高(例如约55℃)。步骤k)为了保存通过本发明的方法分离出的白蛋白型蛋白质，有利地是冷冻干燥或冻干或喷雾干燥所纯化的蛋白质溶液以获得干燥粉末。事先将纯化的蛋白质在-80℃至-20℃之间冷冻，直至完全冷冻。然后，使用标准的冷冻干燥设备在约-20℃的升华温度下，或使用配有喷嘴的立式喷雾干燥器在入口温度范围为150℃至200℃和出口温度范围为70至90℃的情况下进行冷冻干燥，以使水含量低于7wt％，优选4至6wt％。本发明的方法进一步涵盖可以重复步骤c)、e)、h)、i)和/或j)中的任何一个的方法。根据本发明的另一个实施方案，步骤a)至e)、i)和j)中的任一个和所有可以在室温下进行，即范围为15℃和30℃的温度。根据本发明的一个变型，本发明的方法不必包括上述步骤b)和c)。在没有这些步骤的情况下，可以获得低植酸含量。在此实施方案中，可以将油籽粕直接经受上述步骤d)。根据此变型，关于以上步骤a)和d)至k)以上描述的所有优选实施方案和特征可以用于该特定过程或应用于该特定过程。此外，根据此变型的特别优选的实施方案，步骤f1)是在此方法中使用的步骤。因此，根据此特别优选的实施方案，其可提供用于由油籽粕产生蛋白质分离物的方法，所述分离物包含蛋白质和4％或更少、优选3wt％或更少、更优选少于2％的植酸，植酸的所述量是按所述分离物中蛋白质的重量计，所述方法包括以下步骤：i.提供油籽粕；ii.将所述油籽粕与处于范围为1至3.5、优选2至3的ph下的水性溶剂混合以形成混合物，所述混合物具有液相；iii.从步骤ii)中形成的所述混合物中分离所述液相；iv.在适于植酸酶活性的温度和ph下，将分离出的液相与植酸酶混合，以获得具有液相和固相的混合物；和/或v.通过将混合物冷却至30℃或更低的温度来从步骤iv)的液体中沉淀出固相。vi.将所述固体沉淀物与步骤v)的液体分离，所述液体包含富水液相和富油液相；vii.将所述富水液相与所述富油液相分离，viii.使步骤vii)中获得的所述富水液相经受一次或多次膜过滤，以获得蛋白质分离物；和ix.任选地，干燥所述蛋白质分离物以获得干燥的蛋白质分离物。根据本发明的另一个变型，本发明的方法包括以下步骤：a.提供油籽粕b.将油籽粕与第一水性溶剂混合以形成ph范围为6至7.8的浆料，所述浆料具有液相；c.从所述浆料中分离所述液相，d.将所述分离出的液相的ph调节至范围为2至4、优选3至3.8的ph，以形成具有液相和固体沉淀物的混合物。e.将所述液相与所述固体沉淀物分离；f.使步骤e.中获得的液相经受微滤步骤并回收渗透物；g.使步骤f的所述渗透物经受超滤步骤，随后进行至少一个用盐如nacl或cacl2、优选nacl的0.05m-0.5m、优选0.1m-0.3m的水溶液进行的渗滤步骤，以获得低分子量的蛋白质分离物，以及h.任选地，干燥所述蛋白质分离物以获得干燥的蛋白质分离物。此方法由油籽粕产生蛋白质分离物，所述分离物包含蛋白质和量为4wt％或更少、优选3％或更少、更优选2％或更少的植酸，植酸的所述量按所述分离物中蛋白质的重量计，所述方法包括以下步骤：步骤a.待使用的油籽粕可以是下文所述的任何一种。步骤b.步骤b.如上文步骤b)中所述，并且上文关于步骤b)所述的所有优选实施方案和特征可用于或应用于此特定过程。步骤c.在此步骤c.中，将浆料分离成液相和然后的(一种或多种)固体。一旦进行步骤b.)(有或无植酸酶消化步骤，以及有或无固体的水洗步骤)，就将浆料分离成液相和固相。进行这种分离的工具在本领域中是众所周知的，并且包括离心工具，如倾析器离心机、过滤工具、压榨工具如螺旋压榨机、压滤机、带式压榨机、法式压榨法、倾析工具和/或将浆料分离成固相和液相的任何其他工具。此分离可以使用倾析器离心机例如在范围为2000至6000g、优选3000至5000g例如约4600g的g力下进行。如技术人员将直接理解，固相包含小比例的液体，相对而言，液相将包含小比例的固体或固体颗粒。因此，在本发明的具体实施方案中，含有残余固体的液相进一步经受使用例如至少一个叠盘离心机的另一分离步骤。此离心的g力的范围可为10000至20000g，可选地为17000g。此外，还优选将液相重新加热，例如55℃。步骤d.在步骤d.中，调节ph以获得固体的沉淀。ph调节可以通过添加酸的水溶液或其混合物来进行。这类可用于食品或饲料中的酸可以为盐酸、磷酸、硫酸、乳酸、柠檬酸，优选磷酸。例如，浓度为例如1m的磷酸溶液。步骤e.在步骤e.中，除去固体沉淀物以获得液相。进行此去除的工具与关于上述步骤h)描述的工具相似。根据此变型，以上关于步骤h)描述的所有优选实施方案和特征可以用于此特定处理步骤或应用于此特定处理步骤。根据方法的一个实施方案，可以洗涤固体沉淀物(例如通过在诸如55℃的热水中稀释)以获得洗涤的沉淀物和稀释的液相。所述稀释的液相有利地添加到步骤e中获得的液相中。洗涤步骤优选在酸性ph(约3至约4，例如3.5)下进行。此外，可以在洗涤步骤之后进行额外的澄清步骤，以更好地将沉淀物(或沉积物)与稀释的液相分离。步骤f.液相(其可包含从沉淀物中提取的额外稀释液相)然后经受微滤步骤。这类微滤可以通过使用标称孔径范围为0.1μm至2μm、优选0.1μm至1μm(例如0.1μm)的滤膜来进行。微滤通常可以包括一个或多个用水的渗滤步骤。此外，对于一些或所有过滤和/或渗滤步骤，可以有利地控制和/或调节ph。为了调节ph，可以向水中添加ph调节剂，例如磷酸。这类受控的ph可以有利地选择为约3.5。液体可以浓缩几次，例如超过5次。步骤g.随后或替代地，可以使用超滤。优选使用由具有低蛋白质保留的合适材料如聚砜(ps)或聚醚砜(pes)制成的过滤装置进行超滤。过滤材料的分子量截留值(mwco)的范围可以为3kda至10kda，优选为3kda至5kda。通常，超滤可包括一个或多个随后的渗滤步骤。使用合适浓度的盐(例如nacl或cacl2，优选nacl)的水溶液进行至少一个和优选超过一个(例如2或3)的渗滤步骤。这类浓度可以在0.05m至0.5m的范围内，优选0.1m至0.3m。根据优选的实施方案，可以(可能在高温(55℃)下)在用水(且不是盐水)进行的超滤步骤(其可以包括几个透析-超滤步骤)之后进行用盐水进行的透析-超滤步骤。附加地或替代地，可以在用盐水进行透析-超滤之前进一步进行巴氏灭菌步骤。这类巴氏灭菌步骤可以在75℃下进行15分钟。在一个优选的实施方案中，温度也可以稍微升高(例如约30℃)或更高地升高(例如约55℃)。步骤h.步骤h.如上文步骤k)中所述，并且上文关于步骤b)所述的所有优选实施方案和特征可用于或应用于此特定工艺步骤。根据本发明的另一个实施方案，优选的是，本发明的方法均不包括以下步骤：使用硫酸铵或高浓度的蛋白质沉淀剂或凝结剂使待分离的蛋白质沉淀。高于5m的浓度通常对环境不利。本发明的另一目的是蛋白质分离物，其通过上述方法可获得或获得，且按所述分离物中的总蛋白质的重量计具有最多4wt％、优选小于3wt％和更优选小于2wt％的植酸。优选地，分离物还具有以干蛋白质分离物计至少85wt％、优选至少90％(n×6.25)的纯度。优选地，分离物由相对于总蛋白质的至少90wt％、优选至少95％的白蛋白(芸苔籽蛋白)组成。进一步优选蛋白质是芸苔籽蛋白(2s白蛋白)和/或分离物是芸苔籽蛋白分离物。根据非常优选的实施方案，分离物中所含的蛋白质是天然蛋白质(即处于天然构象)并且未经水解。根据本发明的方法如此获得的蛋白质分离物在水中的溶解度在ph5下至少为或大于等于90％，优选在ph5下大于或等于95％，甚至在ph5下大于或等于98％。替代地或另外地，根据本发明的方法如此获得的蛋白质分离物在水中的溶解度在ph7下至少大于或等于90％，优选在ph7下大于或等于95％，甚至在ph7下大于或等于98％根据本发明的这类分离物在食品工业中的用途，例如作为乳化剂或起泡剂或丰富蛋白质上的赖氨酸和/或半胱氨酸和/或蛋氨酸也是本发明的一部分。这类分离物可用于食品产品或食品成分中，优选用于饮料如ph值小于5的酸性饮料，蛋白质含量至少为1％的饮料，包括或不包括增白剂的咖啡制剂，也是本发明的一部分油籽粕如本文所用，术语“油籽粕”是指由油籽制备的粕，其中将油籽磨碎并压碎以形成粕。可以从油籽粕中部分或全部提取油，以形成本领域中称为“压饼”或(部分)“脱脂粕”。为了获得脱脂粕，可以使用溶剂，例如疏水溶剂，如戊烷、己烷和/或其他制冷剂，如碘三氟甲烷(itfm)和r134a(1,1,1,2-四氟乙烷)，以从种子粕中去除或减少残余物。当使用这类有机溶剂时，压滤饼中残留的油含量是残余量(例如，按压滤饼的总重量计范围为0.1至4wt％)。尽管如实施例中所示，可以使用这些粕中的任何一种，但是优选使用部分脱脂的冷榨粕。“冷榨”特别是指油籽粕已经在85℃或更低、更优选60℃或更低温度下被冷榨。脱脂粕通常包含相对于脱脂粕总重量范围为80wt％至98wt％的干物质。干物质含量将取决于用于油提取的方法。通常，冷榨脱脂粕的干物质含量为89至92wt％(例如91wt％)。当使用有机溶剂时，干物质含量通常增加并且可以在92wt％至96wt％的范围内。按脱脂粕的干物质的总重量计，压榨粕可包含约15wt％至约50wt％的蛋白质和约5wt％至约20wt％的油。通常，以脱脂粕的总重量计，这类粕可以含有约18wt％至约26wt％的蛋白质和约13wt％至约22wt％的油。特别优选不使用己烷从油籽粕中提取油。进一步优选不使用有机溶剂从油籽粕中提取油。本发明的方法特别适合于通常被认为较难加工的冷榨油籽粕的提取。存在于待在根据本发明的方法中使用的油籽粕中的植酸的量通常高于粕内含有的蛋白质总重量的4wt％。通常植酸的量要高得多，通常其可以在8至30wt.％的范围内，例如10至20wt.％。根据本发明的一个实施方案，油籽粕是部分脱脂的粕，脱脂的粕或富含蛋白质的粕。本发明还涵盖油籽粕的用途，该油籽粕已被加工以提取除其油以外的其他物质。然而，此实施方案不是特别优选的。举例来说，根据本发明的方法，可以使用已经从中提取一些蛋白质的油籽粕。根据一个优选的实施方案，来自本发明的油籽粕可以是(部分)脱脂的油籽粕，从其中已经提取高分子量蛋白质(hmwp)，如十字花科蛋白。这类粕将被称为具有高“低分子量蛋白质”(lmwp)蛋白质含量的油料粕。在本发明的意义上的高分子量蛋白质可以被定义为分子量大于200kda、优选地在220至400kda范围内的油种子蛋白质。在本发明的意义内，低分子量蛋白质可以定义为通过sds-page分析评估的分子量低于20kda，优选地在4至15kda范围内的油种子蛋白质。这类lmwp优选是储备蛋白质，特别是白蛋白型蛋白质。在lmwp中，最优选的是芸苔籽蛋白型蛋白质。根据本发明的优选实施方案，在将油籽转化成油籽粕之前，首先将其(至少部分(例如80％))脱壳。已示出使用脱壳种子对提取高含量水平蛋白质特别有效。尽管方法在油菜籽和油菜籽粕的加工过程中被例示，但其他油种子及其粕(包括但不限于芥菜种子、西兰花种子、亚麻种子、棉种子、麻种子、葵花种子、芝麻种子和豆粕)可以通过相同的方式来加工，以提供高蛋白质含量的最终产品。油菜籽(芥花籽)以及向日葵种子是特别优选的。术语“油菜籽”一词涵盖甘蓝型油菜的所有亚种，其包括阿根廷芥花籽、芥花籽、油菜、油菜花和菜花等。分离物蛋白质可以水解产物、浓缩物和分离物的形式获得。水解产物是通过暴露于热、酸或酶中以分解连接氨基酸的某些键并使它们更易于消化的部分分解和解折叠的蛋白质。许多蛋白质提取物是浓缩物，其含量约为蛋白质总重量的80％。本发明的分离物优选是天然蛋白质分离物，其蛋白质含量按蛋白质总重量计为至少85wt.％，通常至少为90wt％，和更有利地大于93wt％。通过使用凯氏定氮法(见下文)测定氮含量并将其乘以6.25的标准转化因子(即，n×6.25转化因子)来针对干物质测量蛋白质含量。尽管这是本领域广泛接受的测量，但它确实包括一些不确定性。因此，可以测量出高于或超过100％的蛋白质含量。然而，由于这是本领域中的标准措施，因此这是在本发明的意义内将采用以定义表达“蛋白质含量”的措施。通过由sds-page测定的14kda分子量来鉴定芸苔籽蛋白。根据本发明的一个具体实施方案，可以通过本发明的方法获得的分离物将具有至少90wt％的芸苔籽蛋白。本发明的方法特别适合于提取从油菜籽中提取lmwp贮藏蛋白质，如芸苔籽蛋白。然而，本发明的方法可以直接应用于其他油籽如向日葵，以提取白蛋白类型的类似lmwp贮藏蛋白质。根据一个优选的实施方案，本发明的蛋白质分离物具有浅米色。实施例将实施例中所述的以下分析结果(蛋白质含量、植酸、溶解度、se-hplc的测定)至少重复两次。因此，提供的结果为其平均值。实施例1至3：通过球蛋白贫乏的油菜籽粕的芸苔籽蛋白产生这两个实施例是针对部分脱脂的脱壳油菜籽粕进行的，如下获得该粕：1)脱壳油菜籽冷榨粕的产生对于脱壳油菜籽冷榨粕产生，首先将整个种子用波流机脱壳以打开种子。用流化床分离器分离含有自由壳体的混合物以除去壳体。用denisd50分离器分离富仁相中残留的完整种子，然后将完整种子再循环至波流机进行脱壳。denisd50分离后，通过图像分析来表征脱壳水平。油菜籽冷榨粕产生的脱壳目标设置为80％。用mbu20压榨机(olexa)压榨富仁粕，以得到脱壳的油菜籽冷榨粕，其中在不超过60℃的情况下在压榨步骤结束时残余油含量约为15％。2)实施例1-3的原材料产生为了产生油菜籽粕，将150kg的油菜籽冷榨粕(表1)与55℃的自来水以1:8的粕:水比(w/w)混合以形成浆料。在10分钟内以160rpm的速度搅动该浆料，并在不调节ph的情况下添加植酸酶maxamylp(dsm)(以粕的1％的比例)。植酸酶消化一小时后，用naoh(1m)将浆料的ph调节至6.8，并再次以160rpm的速度搅动。在ph6.8下20分钟后，用离心倾析器以4600g(z23，flottweg)对浆料进行倾析。在以下实施例中，将来自倾析的不溶级分用于芸苔籽蛋白提取并称为“湿饼”。表1将湿饼(干物质含量32％)在室温下(湿饼:水比为1:3.5)在160rpm下在15分钟内与水再次混合。用离心倾析器以4600g(z23，flottweg)对悬浮液进行倾析。用叠盘分离器以17000g(easyscale，gea)澄清液相。被称为d2(悬浮液的25％)的第二次倾析的固相和称为c2(倾析萃取物的7％)的来自叠盘澄清的沉积物构成实施例1-3中所述的芸苔籽蛋白分离过程的原料。原料d2和c2的组成在表2中给出。表2d2c2干物质含量27％7％蛋白质含量7％3％植酸/蛋白质24.3％20.6％实施例1：用于植酸去除的实验室规模的实施例和比较例将质量120g冻干湿饼d2混合在1.6l水中。用浓度为1m的盐酸hcl调节ph值为2。最终的固液比为1:7。将ph在2保持30分钟。然后，进行离心步骤(thermoscientificlynx6000离心机)，然后进行过滤步骤(whatman过滤器n°1)。下一步包括调节ph值\离子强度和/或添加植酸酶和/或在55℃下加热。使用氢氧化钠naoh1m调节ph。通过添加氯化钠至所需浓度获得离子强度。所使用的植酸酶是以下实施例中描述的植酸酶。所选条件如表3所示。如果施加植酸酶或加热，则将水提取物保持在所选条件下30分钟或60分钟。第二离心步骤可以除去在调节步骤中形成的不溶性颗粒。然后，使用超滤系统(gehealthcareflux6，3kda截留ps膜-4500cm2–中空纤维)纯化预纯化的提取物。进行三个渗滤体积，以保持提取液的ph值和离子强度，然后在超纯水中进行3个渗滤体积。将最终的渗余物冻干并进行表征，表3。表3*＝对于添加的[naoh]从这些实施例可以看出：-所选条件1和2的比较示出，离子强度0.5m可使白蛋白中的植酸减少，而在ph5下白蛋白溶解度增加-所选条件1和3以及2和4的比较示出，调节ph值不会影响植酸含量或纯度-所选条件3和5的比较示出，在55℃下加热可以允许在植酸含量略有下降的情况下大大提高的白蛋白纯度，和在ph5下溶解度增加。-所选条件5和6的比较示出，在55℃的加热下添加植酸酶可允许在植酸含量大幅降低的情况下大大提高的白蛋白纯度，和在ph5下的良好溶解度-所选条件2和7的比较示出，0.5m的离子强度以及加热可以允许白蛋白的纯度大大提高，并且植酸含量则大大降低。此外，对于所有选定条件，观察到的白蛋白比例均高于90％。因此，以下处理步骤特别有利，以便显著提高纯度并大大降低植酸含量：(1)提取后在55℃、ph4.5下使用植酸酶；或者(2)提取后在55℃、0.5m下使用盐。实施例2：使用植酸酶进行植酸还原的中试规模的芸苔籽蛋白分离物产生将来自第二倾析步骤(d2)的质量244kg湿饼与来自澄清步骤(c2)的50kg沉积物混合。以湿饼d2计，以1:3的比例添加环境温度下的自来水。将浆料以160rpm搅动，并用磷酸(1m)将ph调节至2。在ph2下20分钟后，在室温下用离心倾析器(z23，flottweg)以4600g将浆料倾析。用热水(60℃)将倾析后的液相再加热至55℃。加入植酸酶maxamylp(dsm)(倾析液的干物质的1％)，并用naoh(1m)将ph调节至4.3。植酸酶消化一小时后，将溶液冷却至30℃，以形成沉淀。将沉淀的溶液在30℃下澄清(17000g)(easyscale，gea)，并且将澄清的萃取液在55℃下用3相叠盘撇渣器(ase40，gea)撇取，以除去部分油。使用mf系统(pall，0.8μm截留陶瓷gp膜-4.56m2)以1±0.2bar的tmp将经撇渣脱脂的液相(重相)微滤。将重相浓缩11.2倍，并将渗余物用酸性水(通过ph4.3的磷酸调节)以4.3个渗滤体积渗滤，以保持渗透物ph恒定。将总的微滤和渗滤渗透物合并，并将其用uf系统(koch，5kda截留pes膜-32m2)以1±0.2bar的tmp超滤。mf渗透物经浓缩6.6倍，并且uf渗余物用55℃的水以7个渗滤体积渗滤。在渗滤期间，渗余物的ph值不受控制，并且从4.3增加到7.3。超滤/渗滤步骤后的最终渗余物在55℃和1±0.2bar的tmp下使用第二较小超滤橇(koch，5kda截留pes膜-4.3m2)进行浓缩。将渗余物浓缩5.2倍，并用55℃水以2.4个渗滤体积进行渗滤。将来自第二较小超滤撬的渗余物冷冻干燥(delta2,24lsc,christ)。冷冻干燥后，总共获得2170g粉末。所得粉末的颜色为浅棕色(图1)。此深颜色是由于渗滤步骤中ph值的增加所致。在实施例2、3、4中将改善渗滤期间的ph控制。粉末的最接近组成示于表4。表4芸苔籽蛋白分离物蛋白质(n×6.25)/干物质(％)103芸苔籽蛋白含量/蛋白质97％脂质/干物质(％)0.5灰分/干物质(％)0.9多酚/干物质(％)1.4植酸(g/100g蛋白质)–如下所述进行测量2组氨酸(g/100g蛋白质)4.1(粮农组织：1,5)异亮氨酸(g/100g蛋白质)2.9(粮农组织：3)亮氨酸(g/100g蛋白质)6.8(粮农组织：5.9)赖氨酸(g/100g蛋白质)8.4(粮农组织：4.5)蛋氨酸+半胱氨酸(g/100g蛋白质)7.9(粮农组织：2.2)苯丙氨酸+酪氨酸(g/100g蛋白质)4.5(粮农组织：3.8)苏氨酸(g/100g蛋白质)3.3(粮农组织：2.3)色氨酸(g/100g蛋白质)1.3(粮农组织：0.6)缬氨酸(g/100g蛋白质)4.5(粮农组织：3.9)中试规模的过程(无论ph值如何)允许蛋白质上的植酸含量为2％时达到纯度>100％，和非常高的溶解度(92-95％)，其中氨基酸分布均衡。通常的氮到蛋白质转化因子为6.25(n×6.25)。但是这个因子取决于氨基酸的组成，并且因此基于蛋白质的来源。对于油菜籽，更准确的转换因子在5.2和5.7之间。但是，表达蛋白质含量的商业方法仍然是使用6.25因子(如在用于油菜籽分离物的新型食品–2014中使用的)，并且这是用于测定蛋白质含量的因子。实施例3：使用用于植酸还原的植酸酶的实验室规模的芸苔籽蛋白分离物产生对于此实施例，使用与实施例1相同的原料。将来自d2的1.5kg湿饼与418g来自c2的沉积物混合。以湿饼d2计，以1:3的比例添加环境温度的水。在1l锥形瓶中以160rpm的速度搅动浆料，并用磷酸(2m)将ph调节至2。在ph2下30分钟后，在30分钟内将浆料在15000g下离心(thermoscientificlynx6000离心机)。使用whatman过滤器过滤上清液，并在15分钟内将滤液再次以15000g离心。将来自第二次离心的上清液加热至55℃。用naoh(2m)将加热液体的ph重新调节至4.5。加入植酸酶maxamylp(占湿饼d2和沉积物c2总量的1％)。在1l锥形瓶中以160rpm的速度搅动浆料。植酸酶消化一小时后，将溶液冷却至30℃，并观察到沉淀。将经沉淀的溶液在15000g下离心15分钟，并且再次使用whatman过滤器过滤上清液。用超滤系统(gehealthcareflux6，3kda截止ps膜-4500cm2–中空纤维)对植酸酶消化后的滤液进行超滤。进料流量设置为1.5l/min，并且tmp设置为1.5bar。将液体浓缩13.5倍，并用水将uf渗余物以7个渗滤体积渗滤。将渗滤后的最终渗余物冷冻干燥，其获得19.7g粉末。表5蛋白质/干物质芸苔籽蛋白含量/蛋白质植酸/蛋白质99％99％2.0％如表5所示，粉末的纯度(蛋白质在干物质上的百分比)高(99％)，并且相对于蛋白质的植酸含量低(2.0％)。粉末的溶解度高于99％。冷冻干燥的芸苔籽蛋白的颜色非常浅(图1)。实施例4：在无植酸酶和有用于植酸还原的盐的情况下用己烷提取的油菜籽粕进行的中试规模的芸苔籽蛋白分离物产生在此实施例中，由用于芸苔籽蛋白分离物产生的脱壳冷榨粕来制造由己烷萃取的脱脂(脱壳)油菜籽粕。起始粕组成列于表6。表6下文所述的过程产生两种蛋白质级分：一方面，通过等电沉淀获得的十字花科蛋白级分，和另一方面，通过膜纯化获得的芸苔籽蛋白级分。重点将放在芸苔籽蛋白级分产生上。在环境温度下，将数量为111kg的脱脂油菜籽粕以粕:水的比例为1:8与水混合。将浆料以160rpm搅动10分钟，并用naoh(1m)将ph调节至7。在ph7下萃取45分钟后，在室温下用离心倾析器以4600g(z23，flottweg)对浆料进行倾析。将经倾析的液相加热至55℃，并用叠盘式澄清器(easyscale，gea)以17000g澄清。在160rpm下搅动下，通过添加磷酸(1m)将经澄清的液相的ph调节至3.5以沉淀出十字花科蛋白级分。再次用叠盘式澄清器以17000g对大体积液体进行澄清，以从液相中分离出沉淀物(沉积物)。沉积物相中富含十字花科蛋白，而液相中则富含芸苔籽蛋白(c2)。通过在ph3.5的热水(55℃)中稀释来洗涤沉积物相，然后再次澄清以产生包含十字花科蛋白级分和稀释液相(c3)的经洗涤沉积物。c2和c3液相构成芸苔籽蛋白工艺的原料。合并澄清的液相(c2和c3)，并使用mf系统(pall，0.1μm截留陶瓷gp膜-6.65m2)以1±0.2bar的tmp对该液相进行微滤。将液体在3.5的控制ph下浓缩9.6倍。用第一超滤系统(koch，5kda截留pes膜-32m2)在tmp1±0.2bar下将微滤渗透物超滤。将mf渗透物浓缩6.2倍，并将uf渗余物用55℃的水以4个渗滤体积进行渗滤。将超滤的渗余物在4℃下储存过夜，并且第二天用连续管状巴氏灭菌器在75℃下进行巴氏杀菌(actini)15秒。加热管段中的热水温度低于76℃。超滤/渗滤步骤后，将巴氏消毒的渗余物在20℃下和在1±0.2bar的tmp下使用第二较小的超滤橇(koch，5kda截留pes膜-4.3m2)浓缩。将渗余物浓缩3.6倍，并用0.1mnacl溶液以2个渗滤体积进行渗滤，然后用20℃的水进行2个渗滤体积。将来自第二较小超滤撬的渗余物冷冻干燥(delta2,24lsc,christ)。在此步骤结束时，总共获得970g粉末。粉末的颜色为浅米色，如图2所示。表7蛋白质/干物质芸苔籽蛋白含量/蛋白质植酸/蛋白质92％92％3.6％如表7所示，粉末的纯度高(92％)，并且由92％的白蛋白组成，并且植酸含量稍高。在ph5下的溶解度为78％。实施例5：使用盐和加热进行植酸还原的实验室规模的芸苔籽蛋白分离物产生起始原料将是脱壳的冷榨粕。此实施例的目的是描述植酸酶步骤的替代方法。可以使用盐代替植酸酶来显著降低植酸的含量。酸性提取直接针对冷榨粕进行，而无需事先在6至7.8的ph值下进行提取。将饼与水混合以形成浆料，并用1m磷酸(或1mhcl)将ph调节至2。将浆料在1l锥形瓶中用磁力搅拌器混合30分钟。在15000g下将悬浮液离心(thermoscientificlynx6000离心机)30分钟，并且使用whatman过滤器过滤上清液。在15000g下进行第二次离心步骤以澄清提取物15分钟，并再次过滤。将nacl添加到澄清的提取物中以达到0.5m的nacl浓度。将混合物在1l锥形瓶中用磁力搅拌器加热至55℃。这些条件保持60分钟。然后，将混合物冷却至室温。在15000g下进行离心步骤15分钟。在此步骤期间形成固体残余物。过滤上清液，然后在室温下在来自通用电气医疗集团(gehealthcare)配有3kda截留ps中空纤维膜4800cm2的uf系统(gehealthcareflux6)上进行渗滤。进料流量设置为1.5l/min，并且tmp设置为1.5bar。前三个渗滤体积是用氯化钠浓度为0.5m的盐化超纯水来实现的，并且用1mhcl将ph保持在2。仅在不控制ph的情况下，用超纯水可以完成9个渗滤体积将获得的渗余物冷冻干燥。将冷冻干燥后获得的产物放入钵中，并用研钵产生细粉，然后对其进行分析。如表8所示，最终粉末的特征在于测得的纯度高于100％(蛋白质/干物质百分比)和至少94％(可能为96.7％)的相对于蛋白质的2.7％的低植酸含量的芸苔籽蛋白。在ph5下的溶解度也很高，为97％。粉末的颜色非常浅，如图3所示。表8蛋白质/干物质芸苔籽蛋白含量/蛋白质植酸/蛋白质在ph5下的溶解度>100％94％2.7％97％比较例1：根据cheung等人(2015)(参阅同上)的实验室规模芸苔籽蛋白分离产物产生起始原料是脱壳冷榨粕，不使用己烷。如cheung等人所述应用此过程。将180g粕与1.8l水和0.75％(w/v)的氯化钠混合。用浓度为1m的盐酸将ph值调节为3。将这些条件保持90分钟。悬浮液在4℃和17500g下离心(thermoscientificlynx6000离心机)20分钟，并使用whatman过滤器过滤上清液。通过用1m氢氧化钠将ph值调节在6.8和7之间来进行等电沉淀。这些条件保持20分钟。悬浮液在4℃和17500g下离心(thermoscientificlynx6000离心机)20分钟，并使用whatman过滤器过滤上清液。浓缩所得提取物，并在室温下用来自通用电气医疗集团的带有5kda截留ps中空纤维膜2000cm2的uf系统(gehealthcareflux6)进行渗滤。进料流量设置为1l/min，并且tmp在1.5和2bar之间。仅在不控制ph的情况下，使用超纯水进行3个渗滤体积以除去盐和多酚。将获得的渗余物冷冻干燥。将冷冻干燥后获得的产物放入钵中，并用研钵产生细粉，然后对其进行分析。如表9所示，最终粉末的特征在于测量的纯度为68％(蛋白质/干物质百分比)和比例为94％的芸苔籽蛋白，其植酸含量高于对蛋白质要求的9.3％。在ph5下的溶解度很高，超过100％。表9蛋白质/干物质芸苔籽蛋白含量/蛋白质植酸/蛋白质在ph5下的溶解度68％94％9.3％>100％此比较例示出，现有技术尤其不适用于处理(尤其)冷榨油籽粕。这是由于(如实施例1所示)在适当阶段(例如，渗滤阶段)使用不足量的盐或植酸酶，特别是为了减少最终产品中的植酸含量。比较例2：根据akbari和wu(2015)(参阅同上)的实验室规模的芸苔籽蛋白分离物产生起始原料是脱壳冷榨粕，不使用己烷。如akbari和wu(《食品科学与技术(foodscienceandtechnology)》，2015年)所述应用该过程。第一提取步骤是将150g粕与1.3l水混合。用浓度为1m的盐酸将ph调节至值4。将这些条件保持120分钟。悬浮液在5℃和15000g下离心20分钟(thermoscientificlynx6000离心机)，并使用whatman过滤器过滤上清液。进行第二提取步骤。向湿粉中加入1.2l水并混合。用浓度为1m的氢氧化钠将ph调节至12.5。将条件保持60分钟。悬浮液在5℃和15000g下离心20分钟(thermoscientificlynx6000离心机)，并使用whatman过滤器过滤上清液。然后用浓度0.1至1m的盐酸将萃取液的ph调节至值4至4.5。将悬浮液在5℃和15000g下离心(thermoscientificlynx6000离心机)20分钟，并使用whatman过滤器过滤上清液。合并这两种提取物，并用浓度为1m的盐酸将ph调节至值4。将获得的提取物浓缩至fcv值为10.6，并在室温下在来自通用电气医疗集团的带有10kda截留ps中空纤维膜140cm2的uf系统(gehealthcarefluxs)上进行渗滤。进料流量设置为50ml/min，而tmp设置为1.5至2bar。用超纯水进行一个渗滤体积。然而，由于形成沉淀而停止纯化。将获得的渗余物冷冻干燥。将冷冻干燥后获得的产物放入钵中，并用研钵产生细粉，然后对其进行分析。如表10所示，最终粉末的特征在于纯度为68％(蛋白质/干物质百分比)，和比例为80％的芸苔籽蛋白，其具有很高植酸含量且蛋白质含量为19.6％。在ph5下的溶解度较低，为66％。表10蛋白质/干物质芸苔籽蛋白含量/蛋白质植酸/蛋白质在ph5下的溶解度56％80％19.6％66％在此比较例中，由于在渗滤步骤期间蛋白质的沉淀，所应用的方法并不成功。可以从所用原料的差异来解释这种结果：在akbari和wu(2015)的文章中，使用己烷脱油的粕，而在本实施例中，主要原料是冷榨粕。这示出从冷榨粕进行提取的本发明的方法的特别适用性。植酸的测定确定蛋白质提取物或分离物中植酸百分比的方法改编自garcía-estepa等人(1999年，《国际食品研究(foodinternationalresearch)》)，并直接应用于固体样品，如芸苔籽蛋白分离物和粕。对于每一批分析，除要测量的样品外，对所有反应物进行空白测量。1.萃取在25ml烧杯中称量250至500mg的样品。记录准确的质量。加入20mlhcl0.4m+10％na2so4溶液。在室温下搅拌至少2小时。将悬浮液在10000g下离心30分钟。过滤上清液。2.反应在15ml离心管中，混合以下溶液：○2.5ml过滤的上清液○2.5ml浓度为20mm的fecl3溶液○2.5mlhcl0.4m+10％na2so4溶液○2.5ml浓度为20％(质量/体积)的磺基水杨酸搅拌(混合物应为紫色/紫红色)。将离心管插入100℃水浴中，保持15至20分钟。在此步骤期间，磺基水杨酸、fe3+离子和植酸之间形成沉淀。让样品在室温下冷却。在10000g下离心30分钟。3.fe3+离子的回收以下步骤可用于回收最大量的自由离子fe3+。*将上清液在25ml容量瓶中在0.22μm过滤器上过滤。*向含有沉淀物的试管中加入4ml蒸馏水。*剧烈搅拌试管，以使沉淀物悬浮。可以使用涡旋。*样品在10000g下离心10分钟。对于每个样本，上述带有星号“*”的步骤以相同的顺序重复三次。加水以获得每个样品25ml的溶液。4.游离离子fe3+的剂量对于每个样品，将10ml先前的溶液放入25ml烧杯中。加入10ml水。通过添加甘氨酸(由sigmaaldrich(西格玛奥德里奇公司)提供，纯度至少为99％)将每种溶液的ph调节至2.5±0.5。然后将溶液在水浴中加热至范围在70至80℃的温度。通过加入预先放入滴定管中的2mm乙二胺四乙酸(edta)溶液来在水浴后直接完成剂量。当溶液的颜色从紫红色变为黄绿色时，达到当量体积。当量体积被尽可能精确地记录。计算方式edta剂量允许定量介质中的游离fe3+离子，也就是说，不包含与植酸一起沉淀的离子。n(fe3+)自由＝v当量*[edta]*2.5对于[edta]，以mmol/l为单位的浓度，veq，以l为单位的当量体积，并且2.5对应于从25ml容量瓶中取出的10ml(步骤4)。引入介质中的总fe3+量是通过空白的剂量获得的，也就是说，遵照所有步骤，但没有样品。下式给出沉淀物中fe3+的量。n(fe3+)沉淀＝n(fe3+)总-n(fe3+)自由此式也可以写成：n(fe3+)沉淀＝n(fe3+)空白--n(fe3+)在样品中自由在文献中，通常认为6个磷与4个离子fe3+结合。然而，据推测一分子植酸含有6个磷。最后两个式的组合为：因为从初始体积20ml中提取2.5ml(萃取步骤1)，所以提取物中植酸的摩尔浓度是沉淀物中fe3+离子浓度的8倍。n(植酸)提取物＝8*n(植酸)沉淀提取物中植酸的质量为：m(植酸)提取物＝n(植酸)*m(植酸)m(植酸)对应于植酸的分子量，在ip6形式下等于660g/mol。植酸含量通常以毫克/克蛋白质或毫克/克干物质表示，对应于：用于蛋白质含量测定的凯氏定氮法凯氏定氮法用于测定呈液体形式的样品中的蛋白质含量以评估分离物的溶解度，或呈固体形式的样品中的蛋白质含量以测定样品中的蛋白质含量，并且描述于nfeniso5983-2，2009年10月。1.分离物样品粉末的制备在25ml烧杯中称取250mg粉末；记录精确的质量。将20ml水添加到粉末，并将浆料在室温下搅拌30分钟。然后将溶液转移到25ml容量瓶中，加水以获得25ml溶液。将1ml样品放入凯氏烧瓶中。2.制备固体样品(粕)在由步琦公司(büchi)提供的kjeldahlweighingboatn-free中称量20至40mg粕。记录准确的重量。将舟皿和样品放在凯氏烧瓶中。3.一般程序在凯氏烧瓶中，加入96％的4ml硫酸和约0.2g来自applichem的催化剂cu-se。作为对照，准备至少一个不加样品但加硫酸和催化剂的烧瓶。然后，在büchispeeddigesterk-439(rungis,france)中分几个步骤进行矿化步骤：-预热到150℃-在150℃下加热15分钟-在450℃加热90分钟完成这些步骤是为了分解有机物质：特别是将氮还原为nh4+。将样品冷却30分钟。下一步是蒸馏：将32％的氢氧化钠添加到样品中，以将氮转化为其nh3形式，然后将其蒸馏，然后用3％的硼酸转化回nh4+，并且然后在与瑞士万通公司(herisau,suisse)的titrinoplus877结合的来自步琦公司的kjelflexk-360中用0.01mhcl和3％硼酸返滴定。当量体积用于以下计算中。4.蛋白质含量的计算因此，总氮含量(以g/l为单位的ntk)根据下式确定：v测试和v空白是用于返滴定的在等于0.01m(以ml为单位)的cn(盐酸盐)的浓度下的盐酸的体积。m(n)表示氮的分子量，其为14g/mol，并且v样品是用作分析样品的提取物的体积。对于粕分析，将v样品替换为引入烧瓶中的粕质量(以mg为单位)，并且结果变为以百分比为单位的氮的比率。然后，由于等于6.25的系数，所以总氮含量将转化为蛋白质。蛋白质含量＝ntk*6.25技术人员应理解，蛋白质含量的这种测量与样品中氮的含量成比例。蛋白质溶解度的测量为了测量溶解度，将样品以1％的蛋白质浓度悬浮在去离子水中。通过上述凯氏定氮法测量此溶液的蛋白质含量。分别制备4个等份试样，每个25ml，并用naoh[1m]或hcl[1m]的水溶液调节样品ph至所需ph。将这些等分试样搅拌至少20分钟，且然后离心(15000g，持续10分钟)。使用凯氏定氮法分析上清液。溶解度是在去离子水悬浮液中测量的蛋白质含量与在调节ph和离心后测量的蛋白质含量之间的比率。芸苔籽蛋白含量的测量介绍通过尺寸排阻高效液相色谱法(se-hplc)评估分离物中的芸苔籽蛋白含量。此分析技术用于分离和定量特定蛋白质。根据其分子大小，使用由多孔珠组成的凝胶作为筛分介质进行se-hplc中的分离。较小的分子将通过在小珠内扩散而在与分子的分子大小和珠子孔径有关的可通过体积进行运送，而较大的分子将仅通过小珠之间的洗脱液的对流流动进行运送。结果，较大的分子将首先被洗脱，而较小的分子将随后被洗脱。se-hplc装置和洗脱液制备使用飞诺美公司(phenomenex)提供的biosep-sec-s2000300x7.8mm。根据供应商，此色谱柱经选择为其分离范围在1至300kda之间，这涵盖所研究蛋白质的大小。在色谱柱内部，凝胶由粒径为5μm且孔径为的二氧化硅组成。色谱系统是来自岛津(shimadzu)的uflc机器，其配备光电二极管阵列(pda)检测器和设置在35℃的柱温箱。将检测设置为214nm，并使用labsolution软件处理数据。用biosolvebv(荷兰法尔肯斯瓦德(valkenswaard,thenetherlands)提供的45％乙腈和55％超纯水制备洗脱液。将0.1％的三氟乙酸(tfa)加入到混合物中。洗脱设置为0.6ml/min，且持续30分钟。水和乙腈的混合物通常用于研究蛋白质及其可能的聚集体。样品制备通过将125克粉末溶解在25ml的纯水中来制备5g/l的分离物的纯水溶液，并在室温下在搅动下保持30分钟。在0.22μm针筒式过滤器上过滤10ml溶液，并引入小瓶中。进样量为5μl。结果通过se-hplc分析从油菜籽分离物中获得的典型结果如图4所示。第一个峰对应于十字花科蛋白，并且第二个峰对应于芸苔籽蛋白。计算每个峰的曲线(a)下的面积，因此可以返回到分离物中的芸苔籽蛋白含量。这种计算很简单，因为两种蛋白质的质量消光系数(通过芸苔籽蛋白分离物和十字花科蛋白分离物的校准曲线测量)相同。分离物中的芸苔籽蛋白含量由以下等式(等式1)给出：图4示出在还原条件下通过se-hplc和sds-page分析观察到的峰之间的相关性。第一个峰对应于高分子量蛋白质(十字花科蛋白)，其由六个亚基组成，这些亚基又由两个主要多肽组成，即，α链(约30kda)和β链(约20kda)，可见于sds-page凝胶。第二个峰与低分子量蛋白质(芸苔籽蛋白)一致，芸苔籽蛋白由通过二硫键结合在一起的两个主要亚基组成，一个小亚基为4kda，另一个长为9kda。图5是在制备10g/l芸苔籽蛋白分离物的溶液后获得的色谱图。因此，如图4所示，一个主峰在相同的保留时间清晰可见。分离的蛋白质是仍通过其二硫键连接的亚基，因为洗脱条件允许离解静电和离子相互作用，但不允许离解二硫键。将理解的是，这些是建议的操作条件的实施例，并且待分离的液体的组成可需要在不同的条件下操作或使用离心机以外的分离技术从液体或两个不混溶的液相中分离固体。当前第1页12