一种具有抑菌功能的美拉德肽及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有抑菌功能的美拉德肽及其制备方法，属于食品调味基料领域。

背景技术：

随着时代的发展，现代人们越来越注重食品的纯天然性和安全性。由于目前食品工业常用的合成防腐剂的安全性受到质疑，人们更倾向于天然、高效、低毒的天然防腐剂。美拉德反应是食品配料在常规加工过程中，没有化学试剂参与自然发生的，因此具有很好的安全性，在替代其他防腐剂方面具有较大潜力。

美拉德反应又称为羰氨反应，即氨基化合物和羰基化合物在食品加工和储藏过程中发生的复杂反应。在食品加工中，人们经常利用该反应来提高蛋白质或肽类的食品功能性和风味特性。通过美拉德反应所形成的大量挥发性香气成分以及非挥发性的呈味物质，能够赋予食品独特的香气、滋味和颜色。越来越多的研究致力于采用食品级的氨基酸、动物蛋白肽、植物蛋白肽等作为氮源，与各种还原糖进行美拉德反应，通过对反应条件的控制，制备出具有目标风味特性的美拉德反应产物。其中，有蛋白水解物或一定分子量小肽参与的美拉德反应，所形成的产物即为美拉德肽。

另外，通过美拉德反应还可以提高反应底物原有的生物活性或者获得抗氧化、降血压、抗菌活性、抗癌、抗诱变等新生物活性。就抑菌性而言，现有的研究技术主要是利用美拉德反应来对抑菌物质(如壳聚糖、溶菌酶和动物蛋白来源的抗菌肽等)进行修饰和改性，提高和改善它们的抑菌性、乳化性和溶解性等方面的性能，然而这一类美拉德肽往往由于风味特性不佳而限制了其在食品中的应用。

相比于动物蛋白，利用植物蛋白所制备的美拉德肽在风味特性的形成上可塑性更高，并综合考虑安全性和经济成本的问题，人们逐渐由以动物蛋白酶解物作为反应原料转向价格低廉、质量稳定的植物蛋白的应用上。植物蛋白酶解液中含有丰富的小肽和氨基酸，可作为反应底物与还原糖在一定条件下进行美拉德反应，形成具有良好呈味特性、溶解性和营养功能的产物。然而现有的研究技术表明，利用本身不具备抑菌活性的植物蛋白和糖源作为反应底物，所制备的美拉德风味肽抑菌活性非常有限，只有达到一定高浓度，如几十甚至几百毫克每毫升才能表现出较为明显的抑菌效果，而当其作为调味料添加到食品体系中时，使用范围非常有限，从而限制美拉德风味肽在食品体系中抑菌功能的发挥。

技术实现要素：

【技术问题】

现有技术利用植物蛋白作为氮源制备得到的美拉德肽的抑菌活性低的问题。

【技术方案】

为了解决上述问题，本发明以玉米蛋白肽、半胱氨酸、赖氨酸、缬氨酸和木糖为原料，基于酶解结合美拉德反应技术，制备得到了具有良好风味并且能够对供试菌有良好抑制效果的美拉德肽，使其在实际应用的过程中，不仅能够给增强食物的风味特性，还能起到辅助抑菌的作用，减少化学合成防腐剂的使用量。

具体的，本发明的技术方案为：一种具有抑菌功能的美拉德肽的制备方法，所述方法是将玉米蛋白粉进行酶解，以酶解所得酶解上清液作为反应底物，加入半胱氨酸、赖氨酸和缬氨酸，再与木糖于一定的温度和ph条件下进行美拉德反应，浓缩即为所得产品。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将半胱氨酸添加到玉米蛋白酶解液中，并超声处理15～20min至完全溶解，其中，半胱氨酸的添加量是玉米蛋白酶解液中可溶性固形物质量的8％～15％；

(2)将赖氨酸和缬氨酸按比例添加到步骤(1)得到的混合液中，并控制赖氨酸和缬氨酸的质量比为1:1～1:4，且所述赖氨酸和缬氨酸的总添加量为半胱氨酸添加量的2～3倍；

(3)待氨基酸全部溶解后，加入玉米蛋白酶解液中可溶性固形物的质量的9％～16％的木糖；

(4)将步骤(3)得到的混合溶液的ph调至5～8，并在80～120℃下反应60～120min后，终止反应；

(5)将步骤(4)所得反应液进行浓缩，即可得到为具有抑菌功能的美拉德肽。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米蛋白酶解液为通过复合酶解工艺得到的酶解上清液，所述复合酶解工艺为：将玉米蛋白粉需粉碎至50-100目过筛，加入10～12倍质量的水搅拌形成的分散悬浮液，于90～95℃下热处理20～30min后，依次通过碱性蛋白酶于58～60℃酶解2.5～3h、复合风味蛋白酶于48～50℃酶解2～2.5h，离心所得上清液作为后续反应的底物肽，折光仪测定其可溶性固形物的质量浓度。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述半胱氨酸的添加量优选为玉米蛋白酶解液中可溶性固形物质量的9％～13％之间。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所添加赖氨酸和缬氨酸的比例优选为1:1～1:2.5之间。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所添加木糖的量优选为玉米蛋白酶解液中可溶性固形物质量的13％～15％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，调节ph的步骤优选为：先用现配的6mol/lnaoh溶液快速粗调混合溶液的ph至6.5～8.0，再用2mol/lnaoh溶液微调ph至7.2～7.8。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述反应温度控制在90～110℃之间，反应时间控制在90～120min之间较佳。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，需采用冰水浴迅速冷却终止反应。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述浓缩的方法采用低温旋转蒸发，将反应液的质量浓度浓缩至20％～30％之间，4℃冷藏存放。

本发明的优点和效果：

1、本发明以植物蛋白肽、氨基酸和木糖，这类本身不具有抑菌活性的原料作为反应底物，通过酶解结合美拉德反应技术，制备出兼具风味增强和较强抑菌活性的美拉德风味肽。解决了以动物来源的抗菌肽为原料所制备的产物风味不佳，或难以形成目标特征风味，以及植物蛋白制备所得美拉德肽抑菌性较差，所导致的风味与抑菌难以兼具的问题。

2、本发明首次将半胱氨酸、赖氨酸和缬氨酸进行复配，并以玉米蛋白肽作为反应底物，加入木糖进行美拉德反应。所得产物能在抑制腐败微生物的生长，可部分替代化学合成抑菌剂在食品中的使用，增加了传统意义上美拉德风味肽的附加功能，拓宽了其在食品调味基料领域的研究与应用的范围。

3、本发明的制备方法解决了单一氨基酸与还原糖反应所得产物的局限性，如赖氨酸-还原糖进行美拉德反应所得产物中焦糊味较重、风味单一、刺激且不协调，以及半胱氨酸-还原糖的反应产物硫味较重、刺鼻、色泽不佳等。通过对多种氨基酸的筛选和复配，并加入富含小肽和氨基酸的玉米蛋白酶解液中，再进行美拉德反应所得产物，具有酱香风味，醇厚感强，且能够赋予食品良好的色泽，以及协调饱满的整体风味。

4、本发明的制备方法还能在所述的合理范围内，通过对反应底物配比调控，制备出不同风味特征的美拉德肽。比如，当赖氨酸与缬氨酸添加量较大时，制备产生的美拉德风味肽具有较为浓郁的酱香味和一定的焦甜味，而增大半胱氨酸的添加量使得体系中肉香味更加突出，醇厚感和持续性也更为明显。可根据实际要求，做适当调整。

5、本发明将天然的食品级原料作为反应底物，不添加任何化学试剂，并且在合理、安全的条件范围内进行反应，制备出天然、高效、多功能的食品调味基料。

附图说明

图1为实施例3中金黄色葡萄球菌的生长曲线。

图2为实施例3中大肠杆菌的生长曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

玉米蛋白酶解液的制备：将玉米蛋白粉需粉碎至80目过筛，加入10～12倍质量的水搅拌形成的分散悬浮液。于95℃下热处理30min后，依次通过碱性蛋白酶于58℃酶解3h和复合风味蛋白酶于50℃酶解2h，离心所得上清液作为后续反应的底物肽，折光仪测定其可溶性固形物的质量浓度。其中，所述碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶均购自诺维信公司。

实施例1

称取20g质量浓度为8％的玉米蛋白酶解液，加入0.15g的半胱氨酸超声溶解后，分别称取0.2g和0.25g的赖氨酸和缬氨酸(即两者比例为1:1.25)，搅拌使其完全溶解后，加入0.24g的木糖。用现配的naoh溶液快速调节ph至7.5后，转移至加有磁力搅拌转子的美拉德反应瓶内，并将缠有生料带的瓶盖旋紧，于预定105℃的油浴锅内反应120min，冰浴迅速冷却终止反应。将所得反应液浓缩至25wt％，即为美拉德肽a。

实施例2

称取20g质量浓度为8％的玉米蛋白酶解液，加入0.2g的半胱氨酸超声溶解后，分别称取0.16g和0.24g的赖氨酸和缬氨酸(即两者比例为1:1.5)，搅拌使其完全溶解后，加入0.24g的木糖。用现配的naoh溶液快速调节ph至7.5后，转移至加有磁力搅拌转子的美拉德反应瓶内，并将缠有生料带的瓶盖旋紧，于预定105℃的油浴锅内反应120min，冰浴迅速冷却终止反应。将所得反应液浓缩至25wt％，即为美拉德肽b。

实施例3：在酱卤肉中的应用

将新鲜瘦猪肉洗净后焯水，放入电压力锅中，加入酱油、水(瘦肉:酱油:水＝100:7:140，质量比)后进行高压蒸煮，一式三份。出锅后立即按卤汁质量的0.5％浓度分别将美拉德肽a和b加入其中两份。稍冷却后进行描述性感官评定。结果表明，相比于不加美拉德肽的空白对照组，加了美拉德肽a的酱卤肉，酱香味较突出，肉香味适中，闻起来有一定的焦甜气味。加了美拉德肽b的酱卤肉，不仅酱香味浓郁，而且肉味更加明显，整体香气饱满浓厚，且留香持久。可见，不同的氨基酸的配比和添加量能够改变美拉德肽的风味，即本发明方法能够根据需求调整美拉德肽的风味。

实施例4：对供试菌的最低抑菌浓度的测定

无菌条件下，将实施例1制备得到的美拉德肽a经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，并采用倍比稀释法制成一系列具有浓度梯度的抑菌样液，取等体积的无菌水代替抑菌样液作空白对照，每管中加入等量活化好的供试菌菌悬液，使终菌浓度为10⁶cfu/ml。于37℃恒温摇床培养24h，以肉眼观察不浑浊的最低浓度作为最低抑菌浓度(mic)。观察到美拉德肽a对金黄色葡萄球菌的mic为5mg/ml，对大肠杆菌的mic为12.5mg/ml。

将实施例2制备得到美拉德肽b，按照上述方法进行最低抑菌浓度的测定，结果得美拉德肽b对金黄色葡萄球菌的mic为10mg/ml，对大肠杆菌的mic为25mg/ml。可见，利用本发明方法使得在反应底物本身不具有抑菌活性的情况下，制备得到了能够达到动物蛋白参与反应所制备美拉德肽的抑菌水平(对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌mic一般为10～30mg/ml)。

实施例5：对供试菌的生长曲线的测定

按照实施1制备美拉德肽a，分别采用1mic和2mic浓度的美拉德肽a于37℃下摇床培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，每隔2h吸取1ml菌液稀释至适当梯度，进行菌落计数，直至细菌生长达到稳定期，画出受试菌的生长曲线。以无菌水代替抑菌样液作为空白对照。金黄色葡萄球菌生长曲线结果如图1所示，可以看出，1mic浓度的美拉德肽a基本可以将金黄色葡萄球菌的浓度对数值控制在4左右，在2mic浓度美拉德肽a的作用下，活菌数不断下降，并于10h全部死亡。大肠杆菌生长曲线结果如图2所示，可以看出，1mic浓度的美拉德肽a基本可以将大肠杆菌的浓度对数值于12h内控制在4～5之间，12h之后逐渐下降。在2mic浓度的美拉德肽a的作用下，大肠杆菌的生长受到抑制，菌落总数呈现持续下降的趋势。由此可见，本发明制备得到的美拉德肽具有明显的抑菌性能，在一定浓度下能够抑制部分革兰氏阳性和阴性菌的生长，相比于现有技术中采用的其他采用植物蛋白制备的美拉德肽(一般无抑菌性或者抑菌性较差)，具有较好的抑菌水平。

实施例6：对将排骨汤存放期间保鲜效果测试

将新鲜猪排骨洗净宰成小段后焯水，放入电压力锅中，加入清水、姜片、花椒、盐后进行高压蒸煮。在无菌条件下冷却至室温后，设立四个样品组1～4，分别为0.075‰山梨酸钾+5‰美拉德肽a、0.075‰山梨酸钾、0.05‰山梨酸钾+5‰美拉德肽a和空白对照，无菌密封包装并于25℃放置定时取样，以细菌总数、ph值、挥发性盐基氮(tvb-n)为鲜度指标进行测定，其中，细菌总数、ph值、挥发性盐基氮(tvb-n)分别参照gb4789.2-2016、gb5009.237-2016和gb5009.228-2016的方法进行测定。

结果发现，与空白对照组相比，样品组1～3(加入山梨酸钾和/或美拉德风味肽的样品组)的排骨汤中微生物生长活动均受到不同程度的抑制，从而减缓了排骨汤的腐败变质。综合比较几组样品的鲜度指标测定结果发现，不添加任何抑菌物质的空白对照组(样品组4)，存放4d就开始出现腐败变质特征：细菌总数达1.86×10⁶cfu/ml、ph值为6.62、tvb-n值为15.012mg/100g；样品组1中0.075‰山梨酸钾和5‰美拉德肽复配处理的防腐效果最佳，可将排骨汤的保质期延长至11d，此时，细菌总数仅2.85×10⁴cfu/ml、ph值为6.28、tvb-n值为12.816mg/100g；样品组2(添加0.075‰山梨酸钾)和样品组3(添加0.05‰山梨酸钾+5‰美拉德肽)均能将排骨汤的变质时间延长至8d，此时两组样品的菌落总数均为10⁵cfu/ml，ph值为6.4，tvb-n值分别为13.94和14.12mg/100g，保鲜效果相当，说明美拉德肽在替代合成抑菌剂方面具有潜力，从而减少化学防腐剂的使用。

对比例1

称取20g质量浓度为8％的玉米蛋白酶解液，加入0.60g的半胱氨酸超声溶解后，加入0.24g的木糖。用现配的naoh溶液快速调节ph至7.5后，转移至加有磁力搅拌转子的美拉德反应瓶内，并将缠有生料带的瓶盖旋紧，于预定105℃的油浴锅内反应120min，冰浴迅速冷却终止反应。将所得反应液浓缩至25wt％，制备得到美拉德肽。

按照实施例4的方法检测制备得到的美拉德肽的最低抑菌浓度，可以发现其对金黄色葡萄球菌的mic为45mg/ml，对大肠杆菌的mic为120mg/ml，可见，其抑菌性较本发明明显变差。

对比例2

称取20g质量浓度为8％的玉米蛋白酶解液，分别称取0.27g和0.33g的赖氨酸和缬氨酸(即两者比例为1:1.25)，搅拌使其完全溶解后，加入0.24g的木糖。用现配的naoh溶液快速调节ph至7.5后，转移至加有磁力搅拌转子的美拉德反应瓶内，并将缠有生料带的瓶盖旋紧，于预定105℃的油浴锅内反应120min，冰浴迅速冷却终止反应。将所得反应液浓缩至25wt％，即可制备得到美拉德肽。

按照实施例4的方法检测制备得到的美拉德肽的最低抑菌浓度，可以发现其对金黄色葡萄球菌的mic为15mg/ml，对大肠杆菌的mic为40mg/ml，可见其抑菌性能有所下降。此外，制备得到的美拉德肽的风味不佳，整体仅表现出单一的焦甜味，醇厚味和肉香味均不足，风味轮廓不够饱满，整体可接受性较差。

对比例3

称取20g质量浓度为8％的玉米蛋白酶解液，分别称取0.2g和0.25g的赖氨酸和缬氨酸(即两者比例为1:1.25)，搅拌使其完全溶解后，再加入0.15g的半胱氨酸超声溶解，之后加入0.24g的木糖。用现配的naoh溶液快速调节ph至7.5后，转移至加有磁力搅拌转子的美拉德反应瓶内，并将缠有生料带的瓶盖旋紧，于预定105℃的油浴锅内反应120min，冰浴迅速冷却终止反应。将所得反应液浓缩至25wt％，即可制备得到美拉德肽。

按照实施例4的方法检测制备得到的美拉德肽的最低抑菌浓度，可以发现其对金黄色葡萄球菌的mic为20mg/ml，对大肠杆菌的mic为55mg/ml，可见其抑菌性能较对比文件1下降，此外，制备所得美拉德肽中含有絮状物，不是澄清透明的溶液，且颜色较深，有明显的焦糊味。

对比例4

按照实例1制备美拉德肽，将赖氨酸和缬氨酸的添加量改成0.05g和0.1g，即两者质量比为1:2，且总质量与半胱氨酸比为1:1，制备所得美拉德肽抑菌性较差，表现为对金黄色葡萄球菌的mic为25mg/ml，对大肠杆菌的mic为80mg/ml。美拉德肽的整体风味不协调，肉香味突出，焦香味不足。

对比例5

按照实例1制备美拉德肽，仅将美拉德反应的温度调整为70℃，其他步骤和条件均保持一致，制备所得美拉德肽的抑菌性较低，表现为对金黄色葡萄球菌的mic为30mg/ml，对大肠杆菌的mic为100mg/ml。该反应条件下风味形成不足，未形成较好的酱香风味，且夹杂着明显的生粮食味，比较难以接受。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。