蚕丝蛋白的应用及一种果蔬存储方法与流程

本发明涉及水果储存技术领域，具体涉及蚕丝蛋白的应用及一种果蔬存储方法。

背景技术：

水果和蔬菜(简称果蔬)是天然营养食品，含有人体必需的多种维生素、矿物质、碳水化合物、粗纤维、蛋白质及脂肪等营养素。果蔬不仅口感好，而且还能促进身体健康，进而达到防治疾病，养颜美容的效果，是最受现代人欢迎的天然健康食品。果蔬采收后，虽然离开了母体，但是仍然是有生命的活体，因此，在采收后仍会不断发生生理、物理和化学变化。因此，如何储存果蔬才能让果蔬的保质期更长久一直以来都是困扰农业领域的一大难题。冷藏保鲜技术是目前使用最广泛的保鲜技术之一，其通过降低温度抑制果蔬呼吸代谢作用、延缓内源乙烯的释放、延缓果蔬衰老程度、延长其货架期，从而维持较为稳定的营养物质，与此同时，还能有效抑制微生物繁殖生长，避免果蔬因受到侵染而造成腐烂变质。然而，对于一些起源于热带或亚热带的果蔬，在低于冷害临界温度时，组织不能进行正常的代谢活动，抵抗力降低，产生多种生理生化失调，最终导致各种冷害症状的出现。果蔬在0℃以上的低温中表现出生理代谢不适应的现象，称为冷害。果蔬受冷害后，组织内变黑、变褐和干缩，外表出现凹陷斑纹，有味、一些表皮较薄、较柔软的果品则易出现水渍状的斑块。因此，控制冷害对于果蔬存储具有重要意义。

广东盛产名优岭南水果，岭南水果喜湿热，采摘后易发生衰老、病害等品质劣变。香蕉是世界主要经济水果，在鲜果贸易中居首位，是华南地区北运和出口的主要水果，但香蕉等岭南水果对低温敏感，低温贮藏时易发生冷害。香蕉冷害症状表现为，外表皮变褐色或棕黑色，下表皮变褐色，纵切后，切面处可看到棕色或棕色条纹。严重情况下，果肉也变成棕色或黑色，甚至失去原有风味(jiangy.m.,joyced.c.,jiangw.,luw.effectsofchillingtemperaturesonethylenebindingbybananafruit.plantgrowthregulation,2004,43(2):109-115)。

可食性涂膜是一种广泛应用在果蔬保鲜领域的有效方法。包裹在果蔬表面的可食性膜不仅能阻止气体交换、控制果蔬呼吸速率、降低营养成分损失、减少水分蒸发还可以防止微生物的入侵。现有技术中，常用的涂膜成分有多糖、多肽、树脂、脂类及其复合物等，尽管现有技术中的涂膜成分能够起到一定的保鲜作用，然而这些涂膜成分对冷敏型果蔬的冷害防控技术的效果欠佳。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种能够减轻采摘后果蔬低温贮藏过程中冷害症状的果蔬抗冷害剂。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种能够减轻采摘后果蔬低温贮藏过程中冷害症状的存储方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：蚕丝蛋白在制备果蔬抗冷害剂中的应用。

优选地，所述蚕丝蛋白的分子量范围为200～4000da。

本发明的有益效果在于：本发明方案的抗冷害剂中的蚕丝蛋白可以较好地减轻采摘后香蕉等果蔬的冷害症状，通过具有阻止气体交换、成膜性能较好的蚕丝蛋白减轻果蔬在低温存储过程中发生冷害状况。

为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种果蔬存储方法，包括以下步骤：将含有蚕丝蛋白的果蔬抗冷害剂包覆在果蔬表面。

进一步地，所述包覆操作为通过浸泡、涂敷或喷洒等方式将含有蚕丝蛋白的果蔬抗冷害剂包覆在果蔬表面。

进一步地，所述果蔬存储方法包括以下步骤：将采摘后的果蔬浸泡在含有蚕丝蛋白的溶液中，干燥后放置在低温下存储。

优选地，所述干燥操作为自然晾干。

优选地，所述含有蚕丝蛋白的溶液中蚕丝蛋白的浓度为(0.5～5)g/l。

进一步地，所述浸泡操作的时间为(1～10)min；优选为5min。

进一步地，所述低温是指(0～10)℃。

进一步地，所述果蔬包括冷敏型水果。

优选地，所述冷敏型水果包括香蕉或草莓中的至少一种。

本发明的有益效果在于：本发明方案利用的蚕丝蛋白在果蔬表面可形成一层可食性蛋白膜，由于蚕丝蛋白中含有大量的氢键、二硫键以及疏水相互作用力等可以维持膜的稳定结构并具有优良的机械屏障特性。蚕丝蛋白又名丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％左右。蚕丝蛋白是一种含有亲水基和疏水基由18种氨基酸构成的高分子，疏水基主要含有70％的glly-x的高重复链段，由gly-ala-gly-ala-gly-ser组成。蚕丝蛋白无毒、无气味、无刺激性、易溶于水且具有优良的机械性能和良好的理化性质，如良好的韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性能。因此，利用蚕丝蛋白作为抗冷害剂可以取得良好的抗冷害效果。采用本发明方案的水果抗冷害剂，无须使用其他化学添加剂处理，处理后，果蔬表面不会残留任何有害化学物质，使得果蔬更安全卫生，同时蛋丝蛋白形成的是可食用性膜，使用完后可完全水溶且不污染水质。

附图说明

图1为本发明实施例中未处理和采用蚕丝蛋白处理的香蕉果实对照图；

图2是本发明实施例中未处理和采用蚕丝蛋白处理香蕉果实后的果皮褐变指数变化图；

图3是本发明实施例中未处理和采用蚕丝蛋白处理香蕉果实后果皮在6℃贮藏过程中的活性氧变化图；

图4是本发明实施例中未处理和采用蚕丝蛋白处理香蕉果实后果皮在6℃贮藏过程中的饱和脂肪酸变化图；

图5是本发明实施例中未处理和采用蚕丝蛋白处理香蕉果实后果皮在6℃贮藏过程中的显著性差异脂质的相对含量。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明实施例为：一种果蔬抗冷害剂，所述果蔬抗冷害剂为蚕丝蛋白。将该果蔬抗冷害剂应用在减轻香蕉冷害症状上的保鲜存储中，具体操作如下：

1、材料：

香蕉：采摘后的青色成熟香蕉。

蚕丝蛋白：江苏富胜德生物工程有限公司提供。

超氧阴离子产生速率和羥自由基含量试剂盒：南京建成有限公司提供。

2、设备：

超低温冰箱：6℃，相对湿度85％-90％，thermoscientific；

气相色谱质谱联用气相色谱-质谱联用仪(thermo，dsqii)；

uhplcnexeralc-30a超高效液相色谱系统；

qexactiveplus质谱仪(thermoscientific^tm)。

3、处理方式：

香蕉：采摘成熟度约80％的香蕉果实用于进行采后冷害相关研究，选取大小一致、无明显伤痕、无病虫害的果实，分两组组处理：

①蚕丝蛋白处理：对果实施用1.0gl^-1蚕丝蛋白处理；

②对照处理：对果实施用清水处理。

以上两组果实分别浸泡5min，室温条件下晾干后装入0.03mm聚乙烯袋包装，放置在6℃低温贮藏果实。分别在冷害初期(storagei，即0天)、冷害中期(storageii，即2天)、冷害末期(storageiii，即4天)时取样，取得的果皮样品用液氮处理后存放于-80℃冰箱中备用。

4、蚕丝蛋白对香蕉冷害症状影响

(1)褐变指数测定：每组取50个香蕉果实用于果皮褐变指数测定，依照以下褐变等级标准估算每个果实果皮表面褐变面积，0，没有褐变；1，0-25％褐变面积；2，25％-50％褐变面积；3,50％-75％褐变面积；4，75％-100％褐变面积。香蕉果皮褐变指数计算公式如下：褐变指数＝∑(褐变等级×每个褐变等级的果实占总果实的比例)。

(2)活性氧测定：

1)h2o2含量测定：取香蕉样品果皮5g，先用液氮磨碎，再加入25ml冷丙酮研磨提取，6000g离心15min，取上清夜1ml，加入0.1ml20％ticl4和0.2ml2mol/l浓氨水进行反应，然后在6000g下离心15min，收集沉淀部分，将沉淀用3ml1mol/lh2so4进行溶解，在5000g下离心20min，取上清液在410nm下测定光吸收值。以h2o2标准曲线计算果皮组织中h2o2的含量，过氧化氢的结果表示为nmol·kg^-1。

2)超氧阴离子产生速率和羟自由基含量的测定是采用试剂盒(南京建成有限公司，南京，中国)，测定波长分别为530nm和550nm。超氧阴离子产生速率的结果可表示为nmol·kg^-1·s^-1，羟自由基含量表示为u·ml^-1，活性单位(u)可定义为每mg组织使反应液中的h2o2浓度增加1mmol·l^-1为一个产生羟自由基能力单位。

(3)饱和脂肪酸测定：

1)样本的抽提：200mg香蕉果皮样品悬浮于1800μl-20℃预冷的甲醇，摇匀后加入200μl的核糖醇内标(0.2mgml^-1溶于水)，充分震荡；在4℃下超声处理15min后，70℃水浴15min，随后置于-20℃使溶剂冷凝；经4℃，5000g离心15min后，吸取100μl上清于1.5ml离心管中，30℃真空浓缩至干，置于-80℃超低温冰箱中保存备用；真空浓缩至干的样品中加入50μl的盐酸甲氧胺(2mgml^-1溶于吡啶)，50℃于真空干燥箱孵育30min，加入50μlbstfa+1％tmcs于真空干燥箱中，60℃孵育40min。经过0.22μm微孔滤膜过滤，样品置于室温以待上样。

2)气相色谱-质谱联用仪分析：气相色谱质谱联用气相色谱-质谱联用仪(thermo，dsqⅱ)的进样方法及具体参数为：

i)毛细管柱：db-5ms(5％苯基/甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm)；

ii)离子源：70ev；

iii)扫描范围：45-600m/z；

iv)进样口温度：230℃；

v)传输线温度：250℃；

vi)载气：高纯氦气(99.999％)；

vii)载气流量：1.2mlmin^-1；

viii)程序升温：从100℃开始，保持1min，以3℃·min^-1升至184℃，0.5℃·min^-1升至190℃保持1min，15℃·min^-1升至280℃保持5min；

ix)分流比：10：1

x)手动上样，进样量为1μl。

将实验中所得的质谱图与nist2008和wiely数据库中的标准谱图进行比对，得到香蕉果皮极性代谢物的初步定性分析报告。剔除报告中的柱流失及相对峰面积<2％的成分，除去rsi和si均小于700的成分，然后剔除重复数<3的成分，并再次对报告中匹配度小于70的成分进行手动分析。

(4)脂质提取和分析

精确称取样本80mg左右(每组重复称取5份)香蕉皮冻样，加入240μl预冷甲醇，涡旋混合，加入800μl甲基叔丁基醚(methyltert-butylether，mtbe)，涡旋混合，加入200μl水，涡旋混合，低温水浴中超声20min，室温放置30min，8000g，10℃离心15min，取上层有机相，氮气吹干，质谱分析时加入200μl异丙醇溶液复溶，涡旋，8000g，10℃，离心15min，取上清进样分析。

lc-ms分析：样品采用uhplcnexeralc-30a超高效液相色谱系统进行分离。柱温：45℃；流速：300μl·min^-1；进样量：4μl。流动相组成a：10mm甲酸铵乙腈水溶液(乙腈：水＝6：4，v/v)，b：10mm甲酸铵乙腈异丙醇溶液(乙腈：异丙醇＝1：9，v/v)。梯度洗脱程序如下：0-7min，b维持在30％；7.1-25min，b从30％线性变化至100％；25.1-30min，b维持在30％。整个分析过程中样品置于10℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序，进行样本的连续分析。样本队列中每隔8个实验样本设置1个质控(qc)样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

分别采用电喷雾电离(esi)正离子和负离子模式进行检测。样品经uhplc分离后采用qexactiveplus质谱仪(thermoscientific^tm)进行质谱分析。esi源参数如下：

正离子模式(positive)：加热温度(heatertemp)300℃，鞘气流速(sheathgasflowrate)：45arb，辅助气流速(auxgasflowrate)：15arb，吹扫气流速(sweepgasflowrate)：1arb，喷雾电压(sprayvoltage)3.0kv，离子传输管温度(capillarytemp)350℃，s透镜射频电平(s-lensrflevel)：50％，一级质谱扫描范围(ms1scanranges):200-1800。

负离子模式(negative)：heatertemp300℃，sheathgasflowrate45arb，auxgasflowrate15arb，sweepgasflowrate1arb，sprayvoltage2.5kv，capillarytemp350℃，s-lensrflevel60％，ms1scanranges:250-1800。

脂质分子和脂质碎片的质量电荷比，按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(ms2scan，hcd)。ms1在m/z200时分辨率为70000，ms2在m/z200时分辨率为17500。

5、实验结果及分析

1)图1为不同存储时间后的香蕉的实物图，图片中的香蕉均始终呈青色，从图1中可以看出，与对照相比，蚕丝蛋白处理的香蕉果实果皮褐变明显减轻，说明蚕丝蛋白可显著减轻香蕉果实在低温贮藏过程中的冷害症状。

2)褐变指数测定结果如图2所示，从图2中可以看出，与对照相比，蚕丝蛋白处理的香蕉果实果皮褐变指数显著降低，说明蚕丝蛋白可显著减轻香蕉果实在低温贮藏过程中的褐变程度。

3)活性氧测定结果如图3所示，其中，图3中a部分为不同存储时间的超氧阴离子的产生速率与存储时间关系图，b部分为过氧化氢的含量与存储时间关系图，c部分为羟自由基含量与存储时间关系图；从图3中可以看出，与对照相比，蚕丝蛋白处理后香蕉果皮中的活性氧水平降低，说明蚕丝蛋白可减轻香蕉果实在低温贮藏过程中的氧化损伤程度，进而减轻冷害症状。

4)饱和脂肪酸测定结果如图4所示，图4中a部分为棕榈酸含量与存储时间的关系图，b部分为存储时间与硬脂酸的关系图；从图4中可以看出，在贮藏第4天，与对照相比，蚕丝蛋白处理后香蕉果皮中的饱和脂肪酸含量显著降低，说明蚕丝蛋白可显著降低香蕉果实在低温贮藏过程中果皮的膜脂氧化程度，进而减轻冷害症状。

5)脂质提取和分析结果如图5所示，图5中a部分为磷脂酸(phosphatidicacid，pa)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanilamine，pe)含量与存储时间的关系图；b部分为磷脂甘油(phospholipidsglycerin，pg)、磷脂酰丝氨酸(phosphafldylscrine，ps)和甘油三酯(triglyceride，tg)的含量与存储时间的关系图；c部分为溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，lpc)和溶血磷脂乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，lpe)的含量与存储时间的关系图；d部分为单半乳糖甘油二酯(monogalactosyldiacylcerol，mgdg)、单半乳糖甘油一酯(monogalactosylmonoacylglycerol，mgmg)和硫代异鼠李糖甘油二酯(sulfoquinovosyldiacylglycerol，sqdg)的含量与存储时间的关系图；从图5中可以看出，与对照相比，蚕丝蛋白处理后香蕉果皮中的pc和pe，ps，mgdg，mgmg和sqdg含量显著增加，pg类含量基本无显著变化，pa，lpc，lpc，tg类含量显著下降，由此表明蚕丝蛋白可显著抑制果皮组织细胞膜脂降低，进而减轻冷害症状。

由上述结果可以看出，采用本发明提供蚕丝蛋白在减轻香蕉冷害症状上的保鲜应用，按照本发明提出的蚕丝蛋白分子量、浓度及浸泡时间，能够减轻香蕉果实在低温贮藏过程中的果皮褐变程度，进而减轻香蕉冷害症状。因此，利用蚕丝蛋白减轻香蕉冷害症状，对研究采收后香蕉果实低温贮藏冷害发生机理及香蕉保鲜技术开发均具有重要意义。同样地，将蚕丝蛋白用于其他果蔬存储(如草莓等)中同样具有良好的抗冷害效果。本发明方案的果蔬抗冷害剂在制备过程中也可根据需要加入一些其他增强果蔬其他性能或保鲜性能的试剂。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。