本发明属于药用植物应用技术领域，涉及一种连翘叶微生态制剂的制备方法。
背景技术：
在畜牧业生产中，由于长期或超剂量使用饲用抗生素，导致畜禽体内药物残留及病原菌抗药性逐渐增强的问题日益突出。中草药具有低毒性、低残留、无抗药性、多功能性等特点，已经证明其对于增强畜禽机体免疫力，改善蛋白质代谢和钙、磷代谢，提高生产性能，防治疾病和增加饲料香味都有很好的效果。以其作为抗生素的替代物，已经成为了研究热点。
连翘为木犀科植物，是传统的中草药，有清热解毒，消肿散结之功效，主治温热、丹毒、斑疹、痈肿等症。现代科学研究证明，连翘具有优异的抗菌、抗病毒活性。连翘传统以果实入药。在很长一段时间内，连翘野生资源开发不平衡，产地抢青现象时有发生，在造成连翘资源紧缺的同时，大量的连翘叶片却被遗弃不用，造成了资源的极大浪费。
连翘叶中所含连翘苷和连翘酯苷等有效成分与连翘果实相似，总量更是果实的10倍以上。研究结果表明，连翘叶具有抗衰老、抗氧化、清除自由基、抗菌、抗病毒、抗感染症及抗内毒素等药理活性，对动物的生长性能及健康状况都有所改善，且低毒无残留。目前，连翘叶已成为新型饲料添加剂研究的热点，具有极大的开发价值。
中药微生态动物饲料添加剂是中药经有益微生物发酵制成的生物制剂，其不仅具有促进动物免疫器官生长发育，提高机体免疫功能和抗病能力，促进动物生长发育，缩短饲养周期，提高饲料转化率和生产性能，改善产品品质，增强药效和降低饲养成本等功效，还安全无害，无残留，不易产生抗药性。
因此，结合现代微生物发酵技术开发连翘叶微生态制剂，有利于深度挖掘连翘叶的功效，满足畜禽产品生产过程对新型饲料添加剂的市场需求，开发出既能保障畜禽健康生长发育，又不会对人体健康造成危害的新型饲料添加剂，具有广阔的市场应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于连翘叶的微生态制剂，以及该微生态制剂的制备方法。
本发明所述的基于连翘叶的微生态制剂是以连翘叶干粉为原料，先接种枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌进行有氧发酵后，再接种德式保加利亚乳杆菌进行厌氧发酵得到的微生态制剂。
连翘叶本身既具有抗衰老、抗氧化、清除自由基、保肝、增强免疫及抗应激等药理活性，能够改善动物的生长性能及健康状况，且低毒无残留。本发明通过将其接种益生菌发酵制备得到连翘叶微生态制剂，含有丰富的有益微生物，既可以增加动物肠道内的微生物数量和种类，竞争性排斥致病微生物，改善肠道功能，又能够提高饲料利用率，降低料肉比。另外，微生物在代谢时可以破坏连翘叶的细胞壁，有助于连翘活性成分的析出，增强其药效。
进而，本发明还提供了所述基于连翘叶的微生态制剂的具体制备方法，是以连翘叶干粉为原料，先按照每千克连翘叶干粉接种枯草芽孢杆菌(3～5)×1010～(3～5)×1011个、产朊假丝酵母菌(1～3)×1010～(4～7)×1011个，于25～40℃有氧发酵48～72h，再按照每千克连翘叶干粉接种德式保加利亚乳杆菌(5～8)×109～(5～8)×1010个，密封，于35～40℃厌氧发酵24～72h，制备得到连翘叶微生态制剂。
进一步地，本发明所述的有氧发酵优选先在25～30℃控温发酵24h，再于35～40℃控温发酵24～48h。
其中，所述的连翘叶干粉是采摘新鲜的连翘叶，清洗干净后，自然晾干，粉碎过40目筛，灭菌后烘干至含水量6%以下，制得连翘叶干粉。
进一步地，所述新鲜的连翘叶优选采摘5～7月份的连翘叶。
本发明将制备的连翘叶微生态制剂烘干至含水量为10～12%。优选的烘干温度为25～30℃。
本发明制备的连翘叶微生态制剂可以作为畜禽饲料添加剂，直接添加到畜禽饲料中使用，添加量一般为饲料重量的1～5%。
本发明在连翘叶中加入有益菌进行发酵后，与未发酵连翘叶相比，部分有效成分如连翘苷、连翘酯苷a的含量提高了15～30%，提高了连翘叶资源的利用程度。
以本发明制备的连翘叶微生态制剂作为畜禽饲料添加剂，直接添加到畜禽饲料中饲喂肉仔鸡，可以提高肉仔鸡饲料利用率，有效改善肉仔鸡的生产性能，降低肉仔鸡的腹泻率和死亡率，并明显提高肉仔鸡胸腺指数及法氏囊指数，增加血清中iga和igm含量，增强肉仔鸡免疫功能，其功效优于连翘叶，与抗生素基本相当，可以减少抗生素的使用。
本发明连翘叶微生态制剂的制备方法简单易行、安全环保、成本低廉，可以满足畜产品生产过程的对新型饲料添加剂的市场需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不是限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1。
挑取保存于斜面培养基的枯草芽孢杆菌单克隆菌落，接种于含牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%的液体完全培养基中，25～35℃摇床中100～160rpm培养36～72h，至活菌数为(3×108～3×109)个/ml。
将产朊假丝酵母菌冻干粉接种于含葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母粉1%的ypd培养基中，25～35℃摇床中100～160rpm培养72～96h，至活菌数为(1×108～1×109)个/ml。
配制含蛋白胨1%、牛肉浸膏0.8%、酵母粉0.4%、葡萄糖2.2%、硫酸镁0.04%、乙酸钠0.8%、柠檬酸三铵0.2%、磷酸氢二钾1%、硫酸锰0.025%、吐温800.1%的mrs培养基，接种德式保加利亚乳杆菌冻干粉，35～40℃摇床中100～160rpm培养48h，至活菌数为(6×107～6×108)个/ml。
6～7月份，采摘新鲜的连翘叶，清洗干净，自然晾干，粉碎过40目筛，121℃湿热灭菌，45～55℃烘箱中烘干至含水量6%以下，制备得到连翘叶干粉。
无菌操作下，每千克连翘叶干粉接种枯草芽孢杆菌(3～5)×1010个、产朊假丝酵母菌(1～3)×1010个，充分搅拌均匀，装入发酵罐中，控制温度在25～30℃发酵24h，再控制温度为35～40℃，继续发酵48h。
发酵结束后，按照每千克连翘叶干粉接种德式保加利亚乳杆菌(5～8)×109个，充分搅拌均匀，装入发酵罐中，密封，控制温度在35～40℃，厌氧发酵24～48h。
发酵结束后，25～30℃烘干至含水量10～12%，制备得到连翘叶微生态制剂。
实施例2。
采用实施例1制备的连翘叶干粉，无菌操作下，每千克连翘叶干粉接种实施例1培养的枯草芽孢杆菌(3～5)×1011个、产朊假丝酵母菌(4～7)×1011个，充分搅拌均匀，装入发酵罐中，控制温度在32～37℃发酵24h，再控制温度为35～40℃继续发酵24h。
发酵结束后，每千克连翘叶干粉接种实施例1培养的德式保加利亚乳杆菌(5～8)×1010个，充分搅拌均匀，装入发酵罐中，密封，控制温度在35～40℃，厌氧发酵72h。
发酵结束后，25～30℃烘干至含水量10～12%，制备得到连翘叶微生态制剂。
应用例：连翘叶微生态饲料添加剂对肉仔鸡生长性能、免疫功能的影响。
选取800只健康1日龄肉仔鸡，随机分为空白对照组、抗生素组、连翘叶组、连翘叶微生态制剂组，每组200只。
空白对照组只饲喂基础日粮。其他各组在饲喂基础日粮的基础上，抗生素组添加金霉素100mg/kg，连翘叶组添加3%连翘叶干粉，连翘叶微生态制剂组添加3%连翘叶微生态制剂。每日上午、下午各喂食一次。
基础日粮的组成为：玉米60.3%，麸皮4%，葵籽饼4%，棉仁饼6%，豆饼18%，鱼粉5%，骨粉1.5%，贝壳粉1%，食盐0.2%。
试验肉仔鸡笼养，每笼8只，自由采食与饮水，按肉鸡常规程序免疫。
实验前称重，记录每组采食量。
实验持续42天，每天记录肉仔鸡因腹泻造成的粪便敷住肛门现象，统计腹泻率，并观察肉仔鸡的死亡数，计算死亡率。
于实验的第42天，每组随机抽取100只肉仔鸡，计算日增重、料重比。颈静脉放血致死，采集血样，制备血清，免疫比浊法检测血清中iga和igm含量；迅速摘取胸腺和法氏囊，擦干表面水分后，称重并计算其免疫器官指数。
表1结果显示，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂可明显减少肉仔鸡的死亡，抑制腹泻发生，提高肉仔鸡的日增重，降低料肉比。且与连翘叶组相比，连翘叶微生态制剂可以进一步提高肉仔鸡的生长性能，与抗生素组相比，连翘叶微生态制剂具有与抗生素相似的提高肉仔鸡生长性能。
从表2可以看出，与空白对照组相比，连翘叶微生态制剂可以明显增加肉仔鸡的胸腺指数、法氏囊指数，以及血清中iga和igm含量。与连翘叶组相比，连翘叶微生态制剂可以进一步增强肉仔鸡的免疫功能，与抗生素组相比，连翘叶微生态制剂具有与抗生素相似的增强免疫功能效应。