1.本发明属于胆固醇肽降解技术领域，具体涉及一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法。
背景技术：
2.随着人们生活水平的不断提高，对于健康食品的需求量不断增加，人们日常生活饮食结构也在改变，随之而来的是发病率的升高，如高血压、高血糖、高血脂等慢性疾病，于是对于具有降胆固醇等保健功效的食品成分的研究得到了大家的关注，也成为近年来的研究热点。
3.高血脂症是我国目前致死率较高的慢性病之一,而现阶段治疗的主要方法是采用降低血液中胆固醇含量的靶向药物治疗,其中存在治疗费用高昂、具有较大的毒副作用等缺陷。乳清有较高的营养价值,当乳清蛋白被蛋白酶水解以后,会产生许多具有生物活性的序列,经过释放后,即成为我们所熟知的生物活性肽。但是目前对于水解乳清蛋白获得降血压肽并研究其功效的实验居多,而对于更具研究意义的乳清蛋白降胆固醇肽的研究较局限。
4.苹果酸是天然安全原料，来源丰富且成本低，其在物质代谢途径中处于特殊位置，可直接参与人体代谢、被人体直接吸收、实现短时间内向肌体提供能量和消除疲劳等作用，利用苹果酸的众多优点可以很好的与食品应用进行结合，创造出更多的价值。多肽的制备一般是通过生物化学手段将蛋白质水解，以发挥更优的功效，故对其制备方法的研究是至关重要的。对于降胆固醇肽的制备方法有很多中，包括酶解法、发酵法、化学法等，应用较多的是酶解法，但单一酶解的方式成本高，酶解效率有限，现多采用复合酶解以及与微波或超声等高新技术结合的优化工艺。
5.传统的乳清蛋白降胆固醇肽的方法，主要存在操作复杂、产量及降胆固醇活性低等不足，导致对于肽的提取及利用率不高，很大程度上限制了其在食品工业的运用。因此，对于乳清蛋白降胆固醇肽高活性成品的制备方法的研究尤为重要。
技术实现要素：
6.本发明提供了一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，解决了单一酶解乳清蛋白的方法胆固醇肽降解率不高，成本高的技术问题，所述方法如下：一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，包括将灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冷却至20~30℃，在4000
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g ~10000
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g条件下离心，并加入苹果酸，混匀搅拌。搅拌速度1000~2000rpm，搅拌时间为15~25min。
7.其中，所述苹果酸的添加量为2.0~2.5%(w/v)。
8.其中，所述离心的时间为8~20 min。
9.其中，所述乳清蛋白溶液的浓度为6~8%(w/v)。
10.其中，所述酶解的方法为在ph为7.0~9.0，40~50℃的条件下用胰蛋白酶水解，再在
ph为7.0，45~55℃的条件下用中性蛋白酶水解。
11.其中，所述胰蛋白酶的加酶量为4~5.6%(w/v)，中性蛋白酶的加酶量为1~1.4%(w/v)。
12.其中，所述胰蛋白酶的酶活力大于等于250 u/mg，中性蛋白酶的酶活力大于等于100 u/mg。
13.其中，所述胰蛋白酶的水解时间为7~9 h，中性蛋白酶的水解时间为1.75~2.25 h。
14.其中，所述灭酶的条件为在90
±
5℃ 的条件下灭酶8~20 min。
15.其中，所述冷却至20~30℃具体为在3 min内迅速冷却至20~30℃。
16.有益效果：本发明的方法所选的苹果酸，复酶解分别选用胰蛋白酶和中性蛋白酶对乳清蛋白进行酶解，以获得具有高水解度和降胆固醇活性的乳清蛋白降胆固醇肽。水解度及其活性等的提高是因为先进行酶解后会使得部分大分子蛋白降解为小分子活性肽，此时加入苹果酸使得水解度加深，更多的蛋白质被水解为疏水性的多肽，使得乳清蛋白具有更高的疏水性氨基酸组成，有助于结合具有疏水性的胆酸盐，从而提高结合胆酸盐的能力和降胆固醇活性。
17.本发明对乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法进行改进，相较于传统酶解的制备方法，苹果酸的处理极大的提高了乳清蛋白的水解程度，水解出更多的疏水性肽，从而提高了其与胆酸盐的结合率，以达到提高其降胆固醇的活性，为产品在食品领域的应用得到进一步的发展。本实验先将乳清蛋白粉溶解以制备溶液，用磁力搅拌器对溶液进行分散，使其充分溶解，经过两次酶解后再进行苹果酸处理，最后冷冻干燥备用。整个试验以乳清蛋白的量、加酶量、水解温度、ph值以及苹果酸的量等为单因素进行实验，通过测定乳清蛋白的水解度、胆酸钠结合率、牛磺胆酸钠结合率以及脱氧胆酸钠结合率等指标确定单因素的最佳水平，最后通过正交实验优选最佳条件，并对结果进行分析总结。
18.本发明主要对乳清蛋白降胆固醇肽的制备方法进行改进，以达到提高其降胆固醇活性。传统的制备方法有单酶法、复酶法、发酵法等，其降胆固醇肽的制备产量及其降胆固醇活性。
19.本发明先对乳清蛋白溶液进行制备，再用两种蛋白酶先后进行酶解，之后用一定浓度的苹果酸苹果酸处理，最后将水解后的乳清蛋白溶液冷冻干燥处理，置于4℃冰箱保存备用。最后通过测定水解度、胆酸钠结合率、牛磺胆酸钠结合率以及脱氧胆酸钠结合率等指标来判断乳清蛋白降胆固醇肽的产量及其降胆固醇活性，其中水解度最高可达7.2%、脱氧胆酸钠的结合率达到96.96%，相较于传统方法有显著的提高。
20.本发明利用苹果酸结合复合酶解对乳清蛋白进行处理，制备乳清蛋白降胆固醇肽，得到的产品其水解度及胆酸盐结合率较传统制备方法来说，有显著提高，即降胆固醇肽的产量及其降胆固醇活性更佳。将其应用到功能性食品当中，发挥社会经济效应。
21.本发明提高了乳清蛋白降胆固醇肽的产量及其降胆固醇活性，整个工艺操作简单，产品营养价值高，易于与食品较好的结合。作为食品工业的功能成分，对于人们的健康生活具有一定的实际意义，相信未来的发展前景可观。
具体实施方式
22.下面结合实施例，对本发明提出的一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法作进一步地描述。
23.实施例中，乳清蛋白肽水解度测定方法如下：（1）双缩脲法测蛋白含量配制浓度为7%（w/v）的wpi，去离子水稀释为2.5倍，混匀后按照蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所，型号a045
‑1‑
1）测定wpi的蛋白含量。
24.（2）茚三酮法测游离氨基酸含量配制浓度为7%（w/v）的wpi，参照氨基酸检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，型号r30298
‑
100t）操作表进行操作。
25.（3）水解度计算式中：nh2含量—每mg蛋白质中游离氨基酸含量（μmol/mg prot）；h
tot
—每mg蛋白质的肽键微摩尔数，查得乳清蛋白h
tot =8.8（μmol/mg）。
26.2、实施例中评价胆固醇肽的降解情况采用乳清蛋白结合胆酸盐试验，具体操作方法如下：（1）胆酸盐标曲制作分别以0.1 mol/l、ph 6.3的磷酸盐缓冲溶液（pbs）配制0.4 mmol/l的牛磺胆酸钠（stc）、胆酸钠（sc）和脱氧胆酸钠（sdc）溶液，分别取0 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml于具塞试管中，加入pbs溶液至2.5 ml，再加入7.5 ml 60%的浓硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出后冰浴5 min，于387 nm处测定吸光值。以胆酸盐浓度为横坐标，吸光度的值为纵坐标，绘制标准曲线。
27.（2）结合胆酸盐能力测定取1 ml（20 mg/ml）待测样品于离心管中，再加入4 ml胆酸盐溶液（0.4 mmol/l stc、sc和sdc，使用pbs缓冲溶液配制），37℃恒温振荡2 h，4000 rpm条件下离心20 min。取2.5 ml上清液于10 ml试管中，加入7.5 ml 60%（w/v）的硫酸溶液，70℃水浴20 min，取出后冰浴5 min，于387 nm处测定吸光值，由标准曲线求得上清液中胆酸盐的浓度。对照用1 ml pbs缓冲溶液代替样品。
28.式中：c0—对照溶液的胆酸盐浓度(mmol/l)；c1—样品上清液中的胆酸盐浓度(mmol/l)。
29.实施例1一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备6%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在1500 rpm的条件下磁力搅拌分散2 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，放置12~18 h水合。
30.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值9.0，在40℃水浴中先进行胰蛋白酶水解8 h，后90
±
5℃的条件下灭酶15 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在45℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶15 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1%(w/v)。
31.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至25℃，在4500
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g条件下离心10 min。在上清液中加入2.0%(w/v)苹果酸，混匀置于1500rpm的磁力搅拌器搅拌20 min。步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清蛋白。
32.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为5.8
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0.3%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为4.0
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0.1%、胆酸钠为25.7
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0.5%、脱氧胆酸钠为：90.4
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0.47%。
33.实施例2一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备6%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在1500 rpm的条件下磁力搅拌分散2 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，过夜水合。
34.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值8.0，在45℃水浴中先进行胰蛋白酶水解7 h，后90℃下灭酶20 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在50℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解1.75 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶20 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4.8%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1.2%(w/v)。
35.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至20~30℃，在5500
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g条件下离心18min。在上清液中加入2.5%(w/v)苹果酸，混匀置于1500rpm的磁力搅拌器搅拌22 min。步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清蛋白。
36.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为6.8
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0.1%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为5.1
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0.42%、胆酸钠为30.43
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0.96%、脱氧胆酸钠为：94.13
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0.21%。
37.实施例3一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：
步骤1：制备乳清蛋白溶液制备7%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在3000 rpm的条件下磁力搅拌分散2 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，过夜水合。
38.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值7.0，在50℃水浴中先进行胰蛋白酶水解9 h，后90℃下灭酶10 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在50℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2.25 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4.8%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1.2%(w/v)。
39.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至20~30℃，在7000
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g条件下离心12 min。在上清液中加入2.2%(w/v)苹果酸，混匀置于1800rpm的磁力搅拌器搅拌20 min。步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清蛋白。
40.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为6.4
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0.21%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为4.8
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0.24%、胆酸钠为28.51
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0.57%、脱氧胆酸钠为：93.14
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0.38%。
41.实施例4一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备7%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在3000 rpm的条件下磁力搅拌分散1 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4
±
1℃冰箱，过夜水合。
42.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值8.0，在45℃水浴中先进行胰蛋白酶水解8 h，后在90
±
5℃条件下灭酶10 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在50℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4.8%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1.2%(w/v)。
43.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至20~30℃，在6500
ꢀ×ꢀ
g条件下离心15 min。在上清液中加入2.5%(w/v)苹果酸，混匀置于2000rpm的磁力搅拌器搅拌20 min。步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清蛋白。
44.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为7
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0.2%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠
为5.61
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0.97%、胆酸钠为33.65
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1%、脱氧胆酸钠为：96.85
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0.11%。
45.实施例5一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备8%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在1000 rpm的条件下磁力搅拌分散3 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，过夜水合。
46.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值8.0，在45℃水浴中先进行胰蛋白酶水解8 h，后在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在45℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为5.6%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1.4%(w/v)。
47.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至20℃，在4000
ꢀ×ꢀ
g条件下离心12 min。在上清液中加入2.5%(w/v)苹果酸，混匀置于1000rpm的磁力搅拌器搅拌25 min。
48.步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清蛋白。
49.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为6.1
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0.17%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为4.2
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0.32%、胆酸钠为27.42
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0.63%、脱氧胆酸钠为：92.2
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0.44%。
50.实施例6一种提高酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率的方法，其制备方法如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备8%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在1500 rpm的条件下磁力搅拌分散2 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，过夜水合。
51.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值8.0，在50℃水浴中先进行胰蛋白酶水解8 h，后在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在55℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1%(w/v)。
52.步骤3：苹果酸处理将步骤2中灭酶后的酶解乳清蛋白溶液冰浴处理，使其在3 min内冷却至30℃，在10000
ꢀ×ꢀ
g条件下离心8 min。在上清液中加入2.5%(w/v)苹果酸，混匀置于1500rpm的磁力搅拌器搅拌15 min。步骤4：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到降解了胆固醇肽的酶解乳清
蛋白。
53.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解再用苹果酸处理，可以使乳清蛋白表现出更高的水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)，水解度为6.0
ꢀ±ꢀ
0.12%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为4.12
ꢀ±ꢀ
0.17%、胆酸钠为26.59
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0.71%、脱氧胆酸钠为：91.31
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0.28%。
54.对比例本实施例提供一种实施例1的对比例，没有离心、添加苹果酸等步骤，具体如下：步骤1：制备乳清蛋白溶液制备6%(w/v)的乳清蛋白溶液，并在1500 rpm的条件下磁力搅拌分散2 h使乳清蛋白充分溶解，放置于4℃冰箱，放置12~18 h水合。
55.步骤2：酶解用1.0 mol/l naoh维持ph值9.0，在40℃水浴中先进行胰蛋白酶水解8 h，后在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min，冰浴冷却至20~30℃后，用1.0 mol/l的hcl溶液将酶解乳清蛋白溶液调至ph 7.0，并在45℃水浴中进行中性蛋白酶水解，水解2 h后，在90
±
5℃ 的条件下灭酶10 min。其中，胰蛋白酶的酶活力为250 u/mg，加酶量为4%(w/v)，中性蛋白酶的酶活力为100 u/mg，加酶量为1%(w/v)。
56.步骤3：冻干贮藏最后置于冷冻干燥机冻干，保存在4℃冰箱备用，得到酶解乳清蛋白。
57.本实施例的酶解乳清蛋白先酶解，其水解度和胆酸盐结合能力(p < 0.05)显著低于未添加苹果酸的实施例组，经过测试，水解度为4.32
ꢀ±ꢀ
0.22%，结合胆酸盐能力：牛磺胆酸钠为
‑
5.55
ꢀ±ꢀ
0.92%、胆酸钠为18.04
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2.78%、脱氧胆酸钠为：
‑
24.45
ꢀ±ꢀ
4.83%。水解度显著低于实施例组，胆酸盐结合能力非常差，因此，本发明采用先离心，再添加苹果酸的方法显著提高了酶解乳清蛋白中胆固醇肽降解率。