一种降解黄曲霉毒素的应用及方法与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种降解黄曲霉毒素的应用及方法，特别是，中国被毛孢(hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉菌(paecilomyces hepiali)在黄曲霉毒素的降解中的应用及方法。


背景技术：

2.黄曲霉毒素最早是由1960年英国科学家分离的黄曲霉上发现的，黄曲霉毒素主要可以分为两类：蓝色荧光的b类和绿色荧光的g类，b类包括b1、b2、b2α，g类包括g1、g2；还包括一些衍生物如黄曲霉毒素m1、m2、p1、q、h1、gm、毒醇等。黄曲霉毒素是黄曲霉或寄生曲霉产生的次级代谢产物，已见报道的有18种，但是研究最多的还是在黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2，其中黄曲霉毒素b1的毒性最强，被世界卫生组织癌症研究中心认定为人类第一类致癌物，其毒性分别是砒霜、亚硝酸铵、氰化钾的68、75和10倍。
3.黄曲霉毒素在粮食、饲料中污染比较严重，对人类和牲畜的健康威胁大，而传统的黄曲霉毒素去除主要是物理法和化学法。物理法主要有高温法、辐射法和物理吸附法，化学法有碱处理法、氧化法等，但是这些方法容易对环境造成二次污染、降低样品的营养价值以及降解产物毒性不确定等问题。而生物法具有安全、高效、不可逆和对环境友好等特点，成为黄曲霉毒素降解的研究热点。目前，已经报道了某些微生物具有脱除黄曲霉毒素的能力，例如，关心等，黄曲霉毒素b1高效降解菌株的筛选鉴定及其降解(华中农业大学学报，2016年3月第25卷第2期)。在公开号为cn101766273b的专利中，公开了一种可以除去黄曲霉毒素的蘑菇多糖体组合物，但是该蘑菇多糖体组合物仅能吸附黄曲霉毒素，不能对其进行降解。
4.但是，如何利用已知的菌有效地降解黄曲霉毒素仍需要进一步研究。


技术实现要素：

5.本发明提供一种中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌在降解黄曲霉毒素中的应用。
6.具体地，上述黄曲霉毒素可以为任何类型的黄曲霉毒素(aflatoxin，af)，例如，b1、b2、b2α、g1、g2，也可以为其任何衍生物，例如，m1、m2、p1、q、h1、gm、毒醇等，优选是afb1、afb2、afg1、afg2，特别优选是afb1。
7.具体地，上述中国被毛孢可以为任何中国被毛孢菌株，例如根据现有技术cn109082382a、cn105670937a获得不同的菌株，编号为菌株1#、菌株2#、菌株3#、菌株4#、菌株5#、菌株6#、菌株7#、菌株8#、菌株9#，将获得的序列与genbank(dna序列数据库)中保存的数据进行相似性分析，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18s rdna序列的同源性高于95％鉴定为中国被毛孢。
8.具体地，上述蝙蝠蛾拟青霉可以为任何蝙蝠蛾拟青霉菌株，例如cgmcc3.15540、3.17720、3.15421。
9.在本发明的一个实施例中，上述应用为中国被毛孢在降解b类黄曲霉毒素(例如afb1、afb2、afb2α)和g类黄曲霉毒素(例如afg1、afg2)中的应用。
10.在本发明另一个实施例中，上述应用为蝙蝠蛾拟青霉菌在降解b类黄曲霉毒素(例如afb1、afb2、afb2α)中的应用。
11.本发明还提供一种中国被毛孢的生物组合物在黄曲霉毒素降解中的应用。
12.本发明还提供一种蝙蝠蛾拟青霉的生物组合物在黄曲霉毒素降解中的应用。
13.本发明还提供一种中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉的生物组合物在黄曲霉毒素降解中的应用。
14.具体地，所述生物组合物为与上述菌株相关的组合物，其包含上述菌株的菌体例如活菌或细胞碎片，上述菌株的胞内物质或胞外代谢产物，上述菌株的种子液、发酵液、菌悬液、胞内液、细胞碎片液、种子液提取物、发酵液提取液、菌粉中的一种或多种，特别是种子液、发酵液、菌悬液中的一种或多种。
15.具体地，上述生物组合物可以为液体、凝胶、粉末、喷雾等任何合适的形式，优选是液体形式。
16.具体地，上述种子液可以通过培养上述菌株得到。
17.具体地，发酵液通过种子液进一步培养得到。
18.具体地，上述培养方法包括：将菌种在适当的培养基(特别是液体培养基)中培养。
19.具体地，上述培养温度可以为任何适宜的培养温度，例如，对于中国被毛孢菌株，培养温度可以为4-25℃，特别是10-20℃，13-16℃，例如14℃、15℃；对于蝙蝠蛾拟青霉菌株，培养温度可以为15-37℃，特别是20-30℃，24-26℃，例如25℃。
20.具体地，上述培养可以为振荡培养，振荡频率可以为80-200rpm，特别是100-150rpm，例如，100、110、120、130、140、150rpm。
21.具体地，上述培养时间可以为任何适宜的培养时间，例如，对于中国被毛孢菌株，培养时间可以为5-20天，特别是10-15天；对于蝙蝠蛾拟青霉菌株，培养时间可以为2-10天，特别是4-6天。
22.在本发明的一个实施例中，上述培养基可以为pdb培养基。
23.具体地，上述培养方法还包括二级培养。
24.具体地，上述二级培养包括：将上述培养液接种入适当的培养基中培养。
25.具体地，上述二级培养中接种量为1-20％(v/v)，特别是5-10％。
26.具体地，上述二级培养中，培养温度可以为任何适宜的培养温度，例如，对于中国被毛孢菌株，培养温度可以为4-25℃，特别是10-20℃，13-16℃，例如14℃、15℃；对于蝙蝠蛾拟青霉菌株，培养温度可以为15-37℃，特别是20-30℃，24-26℃，例如25℃。
27.具体地，上述二级培养中，培养可以为振荡培养，振荡频率可以为80-200rpm，特别是100-150rpm。
28.具体地，上述培养时间可以为任何适宜的培养时间，例如，对于中国被毛孢菌株，培养时间可以为1-10天，特别是4-6天；对于蝙蝠蛾拟青霉菌株，培养时间可以为1-10天，特别是1-3天。
29.具体地，上述二级培养中，上述培养基可以为pdb培养基。
30.在本发明的一个实施例中，上述方法包括：将菌种接种于pdb培养基，振荡培养，然后转接到pdb培养基中，同条件下培养。
31.具体地，上述种子液可以为上述菌株的二级培养液(如上所述)。
32.具体地，上述菌悬液可以通过将上述菌株的菌体悬浮于缓冲液中制得。
33.在本发明的一个实施方式中，上述菌悬液可以通过将上述种子液(例如通过离心)分离所得菌体悬浮于缓冲液中制得。
34.在本发明的一个实施例中，上述缓冲液为pbs缓冲液。
35.具体地，上述胞内液可以通过如下制得：将上述菌株的菌体(例如通过研磨)破壁，分离所得上清液即为胞内液。
36.具体地，上述细胞碎片液可以通过如下制得：将上述菌株的菌体(例如通过研磨)破壁，分离，将所得固体悬浮于缓冲液中。
37.在本发明的一个实施例中，上述缓冲液为pbs缓冲液。
38.具体地，上述种子液提取物和发酵液提取物可以通过对种子液或发酵液进行合适的提取得到。
39.具体地，上述菌粉为菌株粉末，特别是活菌粉，例如活菌冻干粉。
40.本发明还提供一种中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌在药物、食品和饲料中的应用。
41.本发明还提供一种中国被毛孢的生物组合物在药物、食品和饲料中的应用。
42.本发明还提供一种蝙蝠蛾拟青霉的生物组合物在药物、食品和饲料中的应用。
43.本发明还提供一种中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉的生物组合物在药物、食品和饲料中的应用。
44.具体地，中国被毛孢或蝙蝠蛾拟青霉菌、及其生物组合物具有本发明上述相应定义。
45.具体地，上述应用可以为中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌在药物、食品和饲料的生产、加工、储存、运输等过程中的应用。
46.具体地，上述药物、食品和饲料可以为任何可以被黄曲霉毒素污染的药物、食品和饲料，其可以为疑似包含黄曲霉毒素和/或具有未知水平的黄曲霉毒素。具体地，上述应用为降解(甚至完全消除)药物、食品和饲料中的黄曲霉毒素的应用。
47.具体地，上述药物可以为中药材(其本身可以被黄曲霉毒素污染)及其制备的中药产品，或通过微生物发酵生产的药物(其中微生物发酵原料可以被黄曲霉毒素污染，致使所生产的药物可能被黄曲霉毒素污染)。
48.具体地，上述食品可以为人类日常摄取的食品，例如可以包含粮食、坚果及其制品等。
49.具体地，上述粮食可以为谷类，例如，玉米、小麦、大麦、黑麦、大米、高粱和黍中的一种或多种；豆类，例如大豆、豌豆和花生中的一种或多种；油籽，例如，油菜、大豆、向日葵和棉花。上述粮食还可经磨制，例如，湿磨或干磨的谷粒，包括含有谷蛋白/面筋、蛋白质、淀粉、糠和/或油的磨制级分。
50.具体地，上述坚果可以为花生、核桃、瓜子等。
51.具体地，上述制品可以为奶制品、调味料(诸如腐乳、豆豉、酱油、豆酱等的发酵调味品)、食用油(诸如由上述粮食榨取得到的油脂，例如花生油、大豆油、葵花籽油、棉籽油等)等。
52.具体地，上述饲料可以为任何适于或意图用于由动物摄取的化合物、混合物或组
合物，例如可以包含粮食、动物蛋白等。
53.具体地，上述动物蛋白可以为，例如，鱼粉、脱脂粉乳、乳清、蚕蛹粉、骨粉等。
54.本发明还提供一种黄曲霉毒素降解剂(或黄曲霉毒素解毒剂)，其包含中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌，及包含其中任一菌或两种菌的生物组合物。
55.具体地，中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉菌、生物组合物具有本发明上述相应定义。
56.本发明还提供一种中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌、中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌的生物组合物在制备黄曲霉毒素降解剂(或黄曲霉毒素解毒剂)中的应用。
57.本发明还提供一种降解黄曲霉毒素(降低或甚至消除黄曲霉毒素毒性)的方法，其包括使用中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌，或使用中国被毛孢和/或蝙蝠蛾拟青霉菌的生物组合物的步骤。
58.具体地，黄曲霉毒素、中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉菌、生物组合物具有本发明上述相应定义。
59.具体地，上述方法可以包括将上述生物组合物与待处理的材料混合，任选地，进行生物降解处理的步骤，其中待处理的材料为疑似包含黄曲霉毒素和/或具有未知水平的黄曲霉毒素的材料(如药物、食品、饲料)。
60.本发明的发明人通过大量实验发现，中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌可以在短时间内有效降解多种黄曲霉毒素，在需要降解黄曲霉毒素的领域，特别是药物、食品和饲料领域，具有非常好的应用价值。
附图说明
61.图1所示为菌株8#降解afb1动力学结果。
具体实施方式
62.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
63.中国被毛孢(hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali chen)。
64.黄曲霉毒素(aflatoxin，af)为黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素。黄曲霉毒素主要可以分为两类：蓝色荧光的b类和绿色荧光的g类，b类包括b1、b2、b2α，g类包括g1、g2；还包括一些衍生物如黄曲霉毒素m1、m2、p1、q、h1、gm、毒醇(aflatoxicol)等。
65.在本发明中，“中国被毛孢的生物组合物”是指与中国被毛孢相关的组合物，“蝙蝠蛾拟青霉菌的生物组合物”是指与蝙蝠蛾拟青霉菌(例如中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)编号为3.15540、3.17720、3.15421)相关的组合物，例如由其菌体通过处理得到的制剂，例如其种子液、发酵液、菌悬液、胞内液、细胞碎片液等，以及由其种子液通过处理得到的制剂，例如种子液上清液、发酵液上清液、发酵液提取物、种子液提取物等。因此，“中国被毛孢或蝙蝠蛾拟青霉菌的生物组合物”包含中国被毛孢菌体或蝙蝠蛾拟青霉菌体(例如其活菌或细胞碎片)、胞内物质或胞外代谢产物。
66.本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体
并入本文。
67.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
68.实施例1：不同菌株降解黄曲霉毒素
69.根据现有技术cn109082382a、cn105670937a获得中国被毛孢不同的菌株1#～菌株9#(其中菌株2#为cn109082382a中所述的菌株l0106)，共9株菌，将获得的序列与genbank(dna序列数据库)中保存的数据进行相似性分析发现，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18s rdna序列的同源性高于95％，因此，筛选获得的九株菌均为中国被毛孢。其中菌株1#、菌株2#、菌株3#、菌株4#、菌株7#、菌株8#和菌株9#的具体检测碱基序列分别如seq id no:1-7所示。
70.蝙蝠蛾拟青霉菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，隶属中国科学院微生物研究所，cgmcc编号为3.15540、3.17720、3.15421。
71.1.中国被毛孢菌株1#～9#、蝙蝠蛾拟青霉菌cgmcc 3.15540、3.17720、3.15421的种子液制备
72.(1)中国被毛孢菌株的种子液制备
73.取中国被毛孢菌株斜面，刮取4分之1斜面菌丝于pdb摇瓶培养基(200ml/500ml)，120rpm振荡培养，培养温度15℃，培养时间12天。按接种量10％转接到pdb培养基，继续培养4天得种子液。
74.(2)蝙蝠蛾拟青霉菌的种子液制备
75.取蝙蝠蛾拟青霉菌株斜面，刮取一块1.5cm*1.5cm菌块于pdb摇瓶培养基(200ml/500ml)，150rpm振荡培养，培养温度25℃，培养时间5天。按接种量5％转接到pdb培养基，培养2天后获得种子液。
76.2.hplc检测(本发明的所有实施例都采用该方法检测黄曲霉毒素)
77.二氯甲烷提取：样品12000rpm离心10min，取上清液1ml，加1ml甲醇混合，再加入1ml二氯甲烷进行震荡混匀萃取，小心吸取下层有机相液体，重复萃取三次，合并萃取液。通过氮吹仪吹干，待二氯甲烷彻底挥干后，再用1ml甲醇溶解、定容，经0.22μm滤膜过滤后，hplc检测。
78.色谱柱为pickering mycotox
tm c18柱(4.6*250mm，5μm)，流动相为甲醇：乙腈：水(体积比22:22:56)，流速0.8ml/min，柱温40℃，进样量5μl，采用光化学衍生仪进行衍生，荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长450nm。
79.3.降解实验
80.分别取所述菌株在pdb培养基中制得种子液，取5ml制备的菌株种子液分别加入30μl afb1标准品(乙腈作为溶剂)至体系初始浓度为18ng/ml，14℃，120rpm振荡培养，hplc-光衍生检测afb1含量。
81.afb1降解率＝(起始样品afb1浓度-待测样品afb1浓度)/起始样品afb1浓度*100％。
82.实验结果如下表1所示，中国被毛孢菌株1#～9#、蝙蝠蛾拟青霉菌cgmcc3.15540、
3.17720、3.15421均可降解afb1：
83.表1不同菌株对afb1的降解情况
[0084][0085]
实施例2：菌株8#降解黄曲霉毒素
[0086]
取5ml菌株8#种子液并加入30μl的黄曲霉毒素afb1标准溶液(以乙腈作为溶剂)，以同样体积pdb、种子液分别加入标准品溶液、乙腈作为空白对照，具体见下表2。空白和实验组均在120rpm，15℃振荡培养，分别在0、48、72、96、120h取样1ml。
[0087]
表2实验设计
[0088]
对照15ml空白培养基+30μl标样对照25ml种子液+30μl乙腈低浓度实验组15ml种子液+30μl标样高浓度实验组25ml种子液+50μl标样
[0089]
注：标样原始浓度3ppm，低浓度实验组1中afb1浓度为17.89ppb，高浓度实验组2中afb1浓度为29.70ppb。
[0090]
黄曲霉毒素含量检测参照实施例1中方法进行，结果显示，中国被毛孢种子液能够降解黄曲霉毒素标样，且加入90ng的低浓度样品在96h降解率为98％，高浓度样品在120h的降解率为100％。高浓度样品降解黄曲霉毒素动力学结果如图1所示。
[0091]
降解作用和解吸附作用的区分
[0092]
取低和高浓度实验组样品，12000rpm离心10min，取上清并用三氯甲烷提取；而同时向菌体沉淀中加入与上清等体积的pbs溶液(ph 7.4)至离心管，重悬菌体，12000rpm离心10min，弃上清。
[0093]
向上述沉淀中加入与等体积的甲醇溶液，悬浮混匀，40khz超声30min，0.22μm滤膜过滤，即为沉淀提取液。
[0094]
分别检测菌体沉淀提取液和上清样品中黄曲霉毒素含量，结果发现在种子液上清
和菌体提取液中均未检测到黄曲霉毒素，也就是说菌株8#对黄曲霉毒素的作用是降解，而不是吸附。
[0095]
实施例3：菌株8#降解黄曲霉毒素afg2、afg1、afb2和afb1
[0096]
同实施例1方法制得种子液，取4.95ml种子液分别加入50μl混合标准品afb1(1000ppb)、afb2(300ppb)、afg1(1000ppb)和afg2(300ppb)，至初始浓度分别为10ppb、3ppb、10ppb和3ppb，14℃，120rpm，以pdb培养基代替种子液作为对照，振荡反应144h后，二氯甲烷提取，hplc-光衍生检测。
[0097]
结果表明该菌株8#在144h时均能有效降解afg2、afg1、afb2和afb1，残余率分别为23％、0、10％和0。
[0098]
实施例4：菌株8#种子液中不同组分对afb1的降解实验
[0099]
同实施例1方法制得种子液；
[0100]
1.上清液
[0101]
取54ml种子液，离心，得上清液。
[0102]
2.菌悬液：
[0103]
菌体沉淀用ph7.4的pbs洗涤两次，然后用同样体积的pbs悬浮，获得菌悬液。
[0104]
3.胞内液和细胞碎片制备：
[0105]
取15ml菌悬液，研磨，研磨液离心，取上清液记为胞内液，沉淀再次用15ml pbs悬浮，记为细胞碎片。
[0106]
4.不同组分降解afb1：
[0107]
分别取5ml上述制备的种子液、上清液、菌悬液、胞内液和细胞碎片，并一一加入30μl afb1标准品至afb1初始浓度18ng/ml，15℃，120rpm，振荡培养，分别在96h取样，hplc-光衍生检测。
[0108]
实验结果如下表3所示。
[0109]
表3不同组分在96h对afb1的降解实验结果
[0110][0111][0112]
基本除去菌体的上清液以及不含活菌体的胞内液降解效果很低，即中国被毛孢本身具有降解作用，而细胞碎片中可能含有活菌体，从而具有一定的降解效果。
[0113]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0114]
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
[0115]
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。