一种提高免疫力的益生菌发酵黄金菇组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种提高免疫力的益生菌发酵黄金菇组合物及其制备方法，属于功能饮料制备和应用领域。


背景技术：

2.人体免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质（抗体、溶菌酶、补体、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子）组成。维持免疫细胞代谢和免疫活性物质合成需要营养物质，免疫应答过程会产生自由基，而一些维生素、矿物质和植物化合物具有抗氧化作用；此外，营养素缺乏会增加疾病发生风险，影响食物的消化、吸收、代谢和生长发育，从而间接影响免疫系统。因此，合理膳食是人体免疫系统正常运作和有效发挥功能的重要保障。目前国内外营养素与免疫力的研究涉及微量营养素的较多，植物化合物对免疫功能的影响研究尚处于起步阶段，国内研究以疾病状态下的营养干预为主。
3.黄金菇是一种食用真菌，其营养成分丰富且复杂，主要包括以下几类：40%蛋自质类3%脂肪类，30%氨基酸类。黄金菇还含有多种维生素，如维生素c、b3、b5等，含有丰富的微量元素，如钾、磷、铁、钙、钠、镁、硒和锗等。研究表明黄金菇发酵提能明显增强小鼠免疫功能和细胞免疫功能，这可能与其内的烟酸和多糖有密切关系；其多糖能够明显提高小鼠免疫器官脏器指数；其水提取物同样能够增强小鼠体内腹腔巨噬细胞的吞噬能力。黄金菇的提高免疫能力可能与其多糖有关。
4.目前，国内提高免疫力的食品相关专利已经较多，如cn112568344a一种可以调节肠道和增强免疫力的食品及其制备方法、cn112568441a一种增强免疫力的组合物及其制备方法、cn112535249a一种采用发酵植物制备增强免疫力中药保健饮品的方法、cn112515165a一种增强免疫力的人参红景天片及其制备方法、cn112516227a一种增强免疫复方精油及其应用、cn112535710a一种增强中老年人免疫力的中草药口服液制备方法等，上述制作方法简单、提取工艺粗放，也未进行体内实验，并不一定具有所述效果。


技术实现要素：

5.人体免疫力低下有诸多原因，其中营养失衡是主要原因之一。黄金菇富含富含蛋白质、人体必需氨基酸、维生素及微量元素，经益生菌转化后，黄金菇的益生成分和益生功能有了极大的提高，特别是在提高免疫力方面有巨大作用。
6.本发明提供了一种黄金菇组合物精加工方法，采用模拟人体肠道消化的流程，对黄金菇组合物进行6-12个月的固态发酵分解和2-3个月的液态发酵萃取，利用益生菌消耗大分子、低营养价值的成分，产生益生活性成分，并保留不能进一步代谢的小分子活性成分。
7.本发明提供了一种可以提高免疫力的黄金菇组合物，所述黄金菇组合物的比例如下：黄金菇占90%，米糠占5%，海带占5%，组合物接种长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜
亚种和马克思克鲁维酵母，经长期固态发酵和液态发酵，再经高温瞬时杀菌和陶瓷膜过滤，得到一款具有提高免疫力的饮料。
8.本发明公开的益生菌发酵黄金菇组合物的制备方法如下：（1）黄金菇组合物处理a. 黄金菇采收后，去根茎，仅保留子实体，清洗后沥干水， 45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g；b. 黑米糠过筛去除杂物，清洗后沥干水，45-50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g；c. 海带经清洗后沥干水，45-50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g；（2）黄金菇组合物固态发酵a. 步骤（1）a、b和c所得黄金菇粉、黑米糠粉和海带粉以18:1:1的比例进行混合，取样和混合过程在洁净区内进行；b. 取长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵母9种菌的菌粉或菌液，每种菌粉按照1g/kg或或每种菌液按照1ml/kg的比例加入（2）a所得的粉中，混合均匀，再加入等质量的水，混合均匀后，转移到无菌不锈钢罐中，在30-37℃恒温房间内，密封发酵6-12个月；c. 固态发酵6个月后，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测ph，待ph值达到5以下时，结束固态发酵；（3）黄金菇组合物液态发酵a. 经（2）c判断固态发酵结束后的（2）a，转移到无菌液体发酵罐内进行初步液体萃取。每公斤物料添加50-100倍无菌水，35-37℃、50-80r/min搅拌48h进行，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24-48h后从底部排出，保留上清部分；b. 对（3）a所得物进行间歇通气发酵。先向罐内通入400-500l/min无菌空气，持续5天，促进益生菌进一步消耗液体内大分子营养物，再沉淀2天，从底部排出沉淀残渣，保留上清；c. 连续重复进行（3）b操作，直至发酵液透明度≥15cm，则结束（3）b的操作；d. 完成（3）c操作，经超高温瞬时杀菌设备，130℃-150℃处理9-12s，迅速冷却至常温，再经1-0.45μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，得到一款澄清饮料；所述1（a）的黄金菇，优选产自广西原始森林。
9.所述1（a）的黄金菇，优选的处理工艺如下：45℃热风干燥，去掉85%的水分。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g。
10.所述1（b）的米糠，优选产自陕西的黑米糠。
11.所述1（b）的米糠，优选的处理工艺如下：48℃热风干燥，去掉80%的水分。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g。
12.所述1（c）的海带，优选产自福建的霞浦海带。
13.所述1（c）的海带，选的处理工艺如下：50℃热风干燥，去掉85%的水分。经粉碎机粉
碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g。
14.优选的，所述黄金菇组合物由如下比例，黄金菇：米糠：海带=18:1:1。
15.所述（2）b的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵母9种菌菌粉，优选活菌在2000亿/克菌粉。
16.所述（2）b的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵母9种菌菌液，优选制备方法如下：使用mrs培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养乳酸菌，30℃静置培养酵母菌，培养24h，再经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种，即得到各菌种菌液。
17.所述（2）b固态发酵，优选发酵温度为36℃，优选发酵时间为9个月。
18.所述（2）c固态发酵终点，优选ph为4.5时。
19.所述（3）a，初步液体萃取中优选每公斤物料添加100倍无菌水，优选保温37℃，优选搅拌50r/min，优选萃取时间为48h。
20.所述（3）a中，初步液体萃取中优选的沉淀时间为24h。
21.所述（3）c中，优选重复（3）b次数为5次，优选的发酵液透明度为20cm。
22.所述（3）d中，优选的超高温瞬时杀菌条件如下：140℃处理4s，迅速冷却到30℃以下。
23.所述（3）d中，优选陶瓷膜过滤系统孔径为1μm。
24.本发明的益生菌发酵黄金菇组合物可以显著提高免疫力低小鼠白细胞数、淋巴细胞数，增加小鼠的免疫力。同时，益生菌发酵黄金菇组合物具有较强的抗氧化能力。
25.本发明具有以下优点：1、该益生菌发酵黄金菇组合物食用安全，无任何毒副作用。
26.2、该益生菌发酵黄金菇组合物具有口感清淡、能量低、低碳水的优点。
27.3、该益生菌发酵黄金菇组合物生产过程中，益生菌消耗大分子易代谢成分，一方面菌体代谢产生小分子功能、风味成分，另一方面益生菌消耗低功能作用的大分子成分，保留和富集小分子活性成分，如小分子游离酚、小分子肽。
28.4、该益生菌发酵黄金菇组合物具有易吸收的特点，可提高免疫力低下动物体的白细胞数和淋巴细胞细胞数，提高动物体免疫力。
29.5、该益生菌发酵黄金菇组合物不添加任何添加剂，所有原料均是优质选取。产品经高温灭菌、无菌灌装，具有长达24月的保质期。
附图说明
30.图1为益生菌发酵黄金菇组合物饮料生产工艺示意图。
31.具体实施案例通过具体实施案例方式对本发明益生菌发酵黄金菇组合物作进一步说明，但该说明并非对本发明的限制。本领域内依据本发明思路做出的改进或修改，不脱离本发明路线的，均视作对本发明的侵权。
32.本案例的实施物料，检测方法，均符合国家相关标准要求。
33.实施例1：高免疫力的益生菌发酵黄金菇组合物的制备（1）黄金菇组合物处理a. 黄金菇采收后，去根茎，仅保留子实体，清洗后沥干水，45℃热风干燥，去掉85%的水分。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g。
34.b. 黑米糠过筛去除杂物，清洗后沥干水，50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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35.c. 海带经清洗后沥干水，50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于1
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104cfu/g。
36.（2）黄金菇组合物固态发酵a. 步骤（1）a、b和c所得黄金菇粉、黑米糠粉和海带粉以18:1:1的比例进行混合，取样和混合过程在洁净区内进行。
37.b. 取长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵母9种菌的菌粉，每种菌粉按照1g/kg的比例加入（2）a所得的粉中，混合均匀，再加入等质量的水，混合均匀后，转移到无菌不锈钢罐中，在30-37℃恒温房间内，密封发酵。
38.c. 固态发酵6个月后，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测ph，第9个月ph值降到4.5，结束固态发酵。
39.（3）黄金菇组合物液态发酵a. 经（2）c判断固态发酵结束后的（2）a，转移到无菌液体发酵罐内进行初步液体萃取。每公斤物料添加100倍无菌水，37℃、80r/min搅拌48h进行，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24后从底部排出，保留上清部分。
40.b. 对（3）a所得物进行间歇通气发酵。先向罐内通入400l/min无菌空气，持续5天，促进益生菌进一步消耗液体内大分子营养物，再沉淀2天，从底部排出沉淀残渣，保留上清。c. 连续重复进行（3）b操作，直至发酵液透明度达到20cm，则结束（3）b的操作。
41.d. 完成（3）c操作，经超高温瞬时杀菌设备，130℃处理9s，迅速冷却至常温，再经1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，单瓶包装规格为50ml。
42.实验例1：本发明益生菌发酵黄金菇组合物的经口急毒试验1.1 样品益生菌发酵黄金菇组合物，液体500 ml，由实施例1制备。
43.1.2 实验动物健康成年spf级icr小鼠20只，雌雄各半，由南京医科大学医药实验动物中心提供，生产许可证号scxk（苏）2016-0002，合格证编号：nyd-l-2020110905。实验动物在温度为20-26℃、相对湿度为40%-70%的本中心屏障系统中饲养，实验动物使用许可证号：syxk（苏）2020-0006。实验鼠维持饲料（co60辐照）由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证（2019）01008。
44.1.3急毒试验情况采用限量法，设定剂量为10000 mg/kg，每组10只动物，雌雄各半。动物检疫3d，试验时雌性体重为18.8-20.9g，雄性体重为19.6-21.8g，试验前动物禁食4h，自由饮水。样品比重1.06，以原液按10ml/kg，1次灌胃给样，实际剂量为10600 mg/kg。全部动物连续观察14
天，记录中毒表现及死亡情况。
45.灌胃给予icr小鼠10600 mg/kg的菌菇饮料。雌、雄性动物14d试验观察期间，饮食和活动正常，生长良好，未见中毒表现及异常体征，无动物死亡（见表1）。所以，菌菇饮料的雌、雄性小鼠急性经口毒性试验ld
50
均为大于10600 mg/kg，属实际无毒。
46.表1 菌菇饮料小鼠急性经口毒性试验结果实验例2：本发明益生菌发酵黄金菇组合物提高免疫力低下动物体免疫力的效果2.1样品益生菌发酵黄金菇组合物，液体，5000 ml，由实施例1制备。
47.2.2构建免疫力低下动物模型40 只 cd-1 小鼠按体重随机驱组分为 4 组，每组 10 只。第 1 组为对照组，仅灌服生理盐水。其余小鼠腹腔注射环磷酰胺( 100mg/kg) 连续3d，复制免疫低下的动物模型；第 2 组为造模后模型组，每天灌服生理盐水；第3组为实验组（给予益生菌发酵黄金菇组合物，剂量为人用剂量10倍，16.67ml/kg）。
48.2.3 体重变化造模及给予受试物过程中，每天称量体重，各组之间动物体重无明显统计学差异（p》0.05），见表 2。
49.表2 实验对小鼠体重的影响（n=10，g）2.4 免疫力变化情况造模后、给予益生菌发酵黄金菇组合物 3 天、给予益生菌发酵黄金菇组合物 7 天，经眼眶静脉采血，西门子advia2120i 血细胞分析仪检测血常规造模结束后。
50.由表3可看出，与对照组比较，其余各组白细胞数、淋巴细胞数明显降低，而嗜中性白细胞数、红细胞数、血红蛋白浓度、血小板数无明显差异，说明造模成功。
51.表3 环磷酰胺对小鼠血常规的影响
给予益生菌发酵黄金菇组合物3天后，见表4，与对照组比较，模型组白细胞数、淋巴细胞数明显降低；实验组白细胞数、淋巴细胞数、血小板数较模型组均明显增加，说明实验组提高了小鼠的免疫。
52.表4 给予实验3天对小鼠血常规的影响（n=10） 给予益生菌发酵黄金菇组合物 7 天后，见表5，实验组的白细胞数、淋巴细胞数、血小板数依旧较模型组有较大增加，与对照组的差距降低，说明生命之路具有提高小鼠免疫力的作用。
53.表5 给予实验 7 天对小鼠血常规的影（n=10）