一种加州鲈脂肪肝模型及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于模式动物疾病模型的构建方法技术领域，具体涉及一种脂肪肝模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.加州鲈(micropterus salmoides)又名大口黑鲈，是我国成功引进并推广养殖的淡水经济鱼类品种之一，近年来发展迅猛，已然跻身“第五大家鱼”。随着养殖规模的持续扩大，集约化程度不断提高，生产上愈发追求低成本高产出，过度投饵、饲料能量过高或变质以及水质恶化等因素导致鱼类脂肪代谢障碍，使其脂肪肝发病几率大大提高，病鱼生长缓慢，饲料系数升高，抗应激能力下降，不仅严重影响养殖效率和肌肉品质，还会造成鱼体免疫、抗应激能力大大下降，尤其高温季节易引起养殖鱼类的大批死亡，给生产造成巨大的损失，严重制约产业的健康可持续发展。由于加州鲈既是先天的“脂肪肝患者”(肝脏抗脂肪因子不足)，又是先天的“糖尿病患者”(对糖类的耐受能力低且对淀粉利用率低)，所以诊断评判其脂肪肝发生程度能有效指导加州鲈健康养殖生产。
3.目前对鱼类营养型脂肪肝模型的构建主要还是通过投喂高脂饲料来完成。而加州鲈因为其不耐高脂且不耐高糖的特殊消化习性，可以通过高脂高糖饲料来达到营养型脂肪肝协同诱导效应。目前，尚未见有加州鲈营养型脂肪肝模型构建的相关文献报道，而且，单纯投喂高脂高糖饲料仍相对耗时，因此急需一种简单高效的鱼类脂肪肝模型构建方法。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于提供一种饲料。
5.本发明的第二个目的在于提供上述饲料在构建脂肪肝模型中的应用。
6.本发明的第三个目的在于提供一种脂肪肝模型的构建方法。
7.本发明的第四个目的在于提供一种加州鲈脂肪肝分级评定方法。
8.本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一个方面，提供一种饲料，包含以下成分：脂肪10～20％，糖类5～8％，脂多糖0.1～0.3％。
10.在本发明的一些实施方式中，所述饲料由如下按重量份计的组分组成：鱼粉35～40份，鸡肉粉10～15份，去皮豆粕5～10份，玉米蛋白粉8～10份，高筋面粉5～10份，乌贼膏1～3份，食盐0.5～1份，磷酸二氢钙0.5～1.5份，豆油4～6份，鱼油2～10份，大豆磷脂1～2份，维生素预混料1～2份，矿物质预混料1～2份，脂多糖0～0.3份。
11.在本发明的一些优选实施方式中，所述饲料由如下按重量份计的组分组成：鱼粉38份，鸡肉粉10份，去皮豆粕6份，玉米蛋白粉10份，高筋面粉10份，乌贼膏2份，食盐0.5份，磷酸二氢钙1份，豆油6份，鱼油8份，大豆磷脂1份，维生素预混料1.5份，矿物质预混料1.5份，脂多糖0.2份。
12.本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述饲料在构建脂肪肝模型中的应
用。
13.在本发明的一些实施方式中，所述脂肪肝模型具体为加州鲈脂肪肝模型。
14.本发明的第三个方面，提供一种加州鲈脂肪肝模型的构建方法，给加州鲈鱼投喂本发明第一个方面所述饲料。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述投喂的时间为6～16周。
16.在本发明的一些优选实施方式中，所述投喂的时间为8周。
17.在本发明的一些实施方式中，所述加州鲈鱼的体质量为8～50g。
18.在本发明的一些实施方式中，所述日投喂量为体质量的1～5％。
19.本发明的第四个方面，提供一种加州鲈脂肪肝分级评定，通过检测本发明第三个方面所述方法构建而成的脂肪肝模型的阳性面积率和肝脏脂肪含量进行分级评定。
20.在本发明的一些优选实施方式中，所述检测肝脏具体为检测肝脏的阳性面积率和肝脏脂肪含量。
21.在本发明的一些实施方式中，所述分级评定的标准为：
22.当阳性面积率>3％，肝脏脂肪含量>5％定义为脂肪肝；
23.当阳性面积率3～8％，肝脏脂肪含量5～10％定义为轻度脂肪肝；
24.当阳性面积率8～12％，肝脏脂肪含量10～14％定义为中度脂肪肝；
25.当阳性面积率>12％，肝脏脂肪含量>14％定义为重度脂肪肝。
26.本发明的有益效果是：
27.本发明针对加州鲈不耐高脂且不耐高糖的特殊消化习性，在投饲高脂高糖饲料基础上，进一步增加脂多糖投喂以促进肝脏代谢损伤，进而达到其营养型脂肪肝快速高效协同诱导效应。
28.本发明以高脂高糖结合脂多糖协同诱导加州鲈营养型脂肪肝模型与自然发病过程最相似，且该造模方法简便易行、成模率高、重复性好、实用性强，建模时间可较常规高脂诱导方法缩短4周以上，可为后续实验研究提供可靠材料。另外，本发明结合了肝脏脂肪含量和肝脏组织形态相关指标，综合构建加州鲈营养型脂肪肝的分级诊断方法，可为加州鲈营养型脂肪肝的分级评价提供相对精准、高效的判断依据。
附图说明
29.图1为实施例2中的肝脏组织切片观察图。
30.图2为实施例3中的肝脏油红o染色组织切片观察图。
31.注：其中a代表对比例1；b代表对比例2；c代表实施例1；数字代表周，显微镜倍数：10
×
20倍。
具体实施方式
32.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.一种饲料，包含以下成分(按风干物质的重量份计的组分)组成：鱼粉38份，鸡肉粉10份，去皮豆粕6份，玉米蛋白粉10份，高筋面粉10份，乌贼膏2份，食盐0.5份，磷酸二氢钙1份，豆油6份，鱼油8份，大豆磷脂1份，维生素预混料1.5份，矿物质预混料1.5份，脂多糖0.2份。饲料中粗脂肪含量19.97％、糖类含量7％、脂多糖含量0.2％。
35.对比例1
36.一种饲料，包含以下成分(按风干物质的重量份计的组分)组成：鱼粉38份，鸡肉粉10份，去皮豆粕6份，玉米蛋白粉10份，高筋面粉7份，乌贼膏2份，食盐0.5份，磷酸二氢钙1份，豆油6份，鱼油3份，大豆磷脂1份，维生素预混料1.5份，矿物质预混料1.5份，脂多糖0份。饲料中粗脂肪含量13.79％、糖类含量5％、脂多糖含量0％。
37.对比例2
38.一种饲料，包含以下成分(按风干物质的重量份计的组分)组成：鱼粉38份，鸡肉粉10份，去皮豆粕6份，玉米蛋白粉10份，高筋面粉7份，乌贼膏2份，食盐0.5份，磷酸二氢钙1份，豆油6份，鱼油8份，大豆磷脂1份，维生素预混料1.5份，矿物质预混料1.5份，脂多糖0份。饲料中粗脂肪含量19.97％、糖类含量5％、脂多糖含量0％。
39.实施例2
40.加州鲈营养型脂肪肝模型构建：选取加州鲈幼鱼(体质量为8～50g)分别投喂实施例1、对比例1～2的饲料8周。分别在实验开始后的第1、2、4、6、8周采样。采样鱼经100mg/l的ms
‑
222麻醉后，迅速取肝脏用4％的多聚甲醛固定，用于he病理组织切片观测。
41.建模成功的判定标准：
42.采用青鏘鱼非酒精性脂肪肝模型计分系统(nas)，从肝细胞(核)形态，空泡化以及脂肪变性程度计分，通过image pro
‑
plus 6.0分析来判断脂肪肝发展状况。当三项评分平均达到2分时，即可判定加州鲈高脂营养型脂肪肝模型构建成功，其中评分标准见表1，干燥组织切片染色结果见图1，统计结果见表2。
43.表1非酒精性脂肪肝模型计分系统(nas)计分标准
44.45.表2各实验组nas系统计分统计
[0046][0047][0048]
结果表明，在本实验条件下，虽然对比例2和实施例1组饲料均能成功构建营养型脂肪肝模型，但实施例1明显快于对比例2，其中实施例1中的饲料在第4周即可成功构建营养性脂肪肝模型，对比例2中在第6周才能构建成功。
[0049]
实施例3
[0050]
加州鲈营养型脂肪肝分级诊断方法
[0051]
选取加州鲈幼鱼(体质量为8～50g)分别投喂实施例1、对比例1～2的饲料16周。分别在实验开始后的第0、1、2、4、6、8、10、16周采样，样品鱼经浓度为100mg/l的ms
‑
222麻醉，无菌注射器尾静脉取血后，4℃下静置2h，待血液分层后离心(1000g，4℃，10min)，收集血清于2ml离心管内，
‑
20℃保存，用于血清生化指标分析。此后，迅速解剖分离肝脏，部分置于液氮中速冻，用于肝脏脂肪含量的测定，部分用4％的多聚甲醛固定，用于油红o染色切片分析脂肪含量，检测结果见表3。油红o染色结果见图2，通过油红o染色结果进一步分析肝脏的阳性面积率，结果见表4。
[0052]
表3各组加州鲈肝脏脂肪含量变化
[0053][0054]
相同采样点上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。
[0055]
从表3可以看出。从第4周开始，各实验组肝脏脂肪含量均出现显著差异，且随着饲料脂肪和糖类添加水平的升高和脂肪肝程度的加重，肝脏脂肪积累含量升高(p<0.05)。
[0056]
从图2可以看出，油红o染色可以指示细胞内出现的红色脂滴，图中肝细胞被染成
蓝色的为细胞核，被染成橘红色的为脂肪滴。从第4周开始，实施例1组开始出现明显的橘红色脂滴；对比例2组从第6周开始出现明显的脂滴；对比例1组至第10周才有明显的脂滴出现。到第16周，三组均出现明显的橘红色脂滴聚集，且随着饲料添加水平的升高和脂肪肝程度的加重，颜色逐渐加深。
[0057]
表4肝细胞阳性面积率(％)分析
[0058][0059][0060]
相同采样点上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。
[0061]
结果表明，自第4周开始，不同实验组的肝脏阳性面积率出现显著性差异，且随着饲料脂肪糖类水平的升高和脂肪肝程度的加重，阳性面积率增大(p<0.05)。
[0062]
综合上述实验结果，构建营养型脂肪肝诊断和分级评价标准：
[0063]
(1)当阳性面积率>3％，肝脏脂肪含量>5％定义为脂肪肝；
[0064]
(2)当阳性面积率3
‑
8％，肝脏脂肪含量5
‑
10％为轻度脂肪肝；
[0065]
(3)当阳性面积率8
‑
12％，肝脏脂肪含量10
‑
14％为中度脂肪肝；
[0066]
(4)当阳性面积率>12％，肝脏脂肪含量>14％定义为重度脂肪肝。
[0067]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。