增加蛋鸡肠黏膜吸收面积并提高蛋重的添加剂及制备和应用

1.本发明属于蛋鸡饲养领域，涉及一种增加蛋鸡肠黏膜吸收面积并提高蛋重的添加剂及制备和应用。


背景技术：

2.(1)当前存在问题：我国是鸡蛋的生产和消费大国，鸡蛋也是我国居民的主要蛋白来源。自1985年之后，中国的鸡蛋产量一直位居世界第一，近年来的产量一直维持在全球总产量的40％左右。近年来，关于鸡蛋中抗生素检出的问题频繁出现，原因在于兽用抗菌药物在养殖过程中的滥用，这将导致细菌耐药性升高，给人类和动物健康带来巨大隐患。因此，研发可替代抗生素的饲料添加剂具有广阔的应用前景。益生菌是一类可改善动物胃肠道微生态平衡的有益微生物，近年来在畜禽生产中常用的益生菌主要为乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌3大类。目前，饲料中添加乳酸菌主要采用直接饲喂的方法，但养殖环境中影响活菌活性的因素十分复杂，这将导致乳酸菌效果的不稳定。因此，研发具有高稳定性的乳酸菌添加剂产品势在必行。
3.(2)产品背景：益生菌可有效改善动物肠道菌群生态平衡，增强动物消化吸收能力，提高饲料转化率和养殖效率，是推动畜禽养殖业提质增效的有效手段。乳杆菌是一类能将糖类发酵为乳酸的革兰氏阳性菌，其代谢产物中含有较高的过氧化物歧化酶，可有效提升蛋鸡体液免疫和细胞免疫的水平。此外，乳杆菌可粘附于肠黏膜以形成屏障，还可与病原体竞争营养素和上皮粘附部位。因此，乳杆菌在增强动物体抗病能力方面具有重要作用。目前，应用于蛋鸡养殖的益生菌种类繁多，功能不尽相同。本课题组在前期对振宁土鸡肠道菌群的16srdna测序中，发现了两株在产蛋高峰期有较高丰度的乳杆菌——唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)和敏捷乳杆菌(lactobacillus agile)，之后分别将该两株乳杆菌的培养上清液和菌体沉淀进行不同组合，结合动物试验与体外试验，发现该两株乳杆菌的培养上清液组合对增加蛋鸡小肠黏膜吸收面积以及提高单枚蛋重具有显著促进作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种增加蛋鸡肠黏膜吸收面积并提高蛋重的添加剂，所述添加剂为由体积比1:1的唾液乳杆菌培养上清液与敏捷乳杆菌培养上清液的组合。通过在常规蛋鸡饲料中添加适宜浓度的该培养上清液组合，实现增加小肠黏膜吸收面积并提升单枚蛋重的目的。
5.本发明的另一个目的是提供所述添加剂的制备方法，通过以下步骤实现：(1)在无菌条件下，取唾液乳杆菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号：1.1881)和敏捷乳杆菌(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株编号：1.3914)，分别涂布于mrs琼脂平板，于37℃生化培养箱中培养36h，分别挑取唾液乳杆菌和敏捷乳杆菌单菌落至50ml mrs肉汤培养基中，于37℃生化培养箱中
培养24h，并用mrs肉汤培养基调整菌液浓度为108～109cfu/ml；(2)在无菌条件下，分别将上述唾液乳杆菌和敏捷乳杆菌的菌液进行离心，离心条件为：4℃，1250
×
g，离心2min；(3)离心后，在无菌条件下，分别将上述唾液乳杆菌和敏捷乳杆菌的上清液分装至无菌离心管内(10ml/管)，封口后立即冻存于
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20℃冰箱。
6.本发明的再一个目的是提供所述添加剂在增加蛋鸡肠黏膜吸收面积与提高蛋重中应用。
7.本发明饲料的应用，通过以下步骤实现：
8.(1)将上述唾液乳杆菌培养上清液与敏捷乳杆菌培养上清液各10ml按1:1混合后与12kg蛋鸡常规饲料(100羽蛋鸡每天的饲料量)按等量递增法混匀：先将混合上清液与1kg常规饲料充分搅拌混匀，之后再加入新的1kg常规饲料充分搅拌混匀，以此类推，直至完成12kg饲料的混匀。
9.(2)在蛋鸡产蛋高峰期(约280日龄～580日龄)，饲喂如步骤(1)所述拌入添加剂的常规饲料，连续饲喂30天以上。实现蛋鸡小肠黏膜吸收面积的增加，实现单枚蛋重的提高。
10.其中制备添加剂的两种乳杆菌浓度分别为107～108cfu/鸡/天。
11.其中混匀后的饲料可供100羽蛋鸡食用1天，平均120g/鸡/天，现配现用。
12.在现有的蛋鸡养殖技术中，抗生素常被用于防治动物疾病、提高畜禽生产性能等方面，是抗生素滥用的主要原因。本发明通过在饲料中添加适宜浓度的唾液乳杆菌培养上清液与敏捷乳杆菌培养上清液的组合，实现蛋鸡小肠黏膜吸收面积增大与单枚蛋重提升的目的。本发明提供的饲料添加剂具有安全、无毒、无害、无残留的特性，可有效缓解蛋鸡养殖业中抗生素滥用的问题。本发明提供的饲料添加剂为乳杆菌的培养上清液，制备过程仅需生化培养箱与离心机，操作人员仅需掌握基本无菌操作方法，操作难度低。同时，本发明提供的添加剂制备成本低廉，折合0.001元/鸡/天，适合大规模推广应用。
附图说明
13.图1为本发明添加剂对海兰蛋鸡日均产蛋率及单枚蛋重的影响。其中a,b：直方图带有不同小写字母代表组间差异显著(p值<0.05)。
14.图2为本发明添加剂对海兰蛋鸡试验期总蛋重的影响。
15.图3为本发明添加剂对海兰蛋鸡肠黏膜吸收面积的影响。黑色箭头指示肠绒毛表面褶皱。a,b：直方图带有不同小写字母代表组间差异显著(p值<0.05)。
16.图4为本发明添加剂对海兰蛋鸡肠黏膜氨基酸转运体基因相对丰度的影响。a
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c：直方图带有不同小写字母代表组间差异显著(p值<0.05)。
具体实施方式
17.本发明结合附图和实施例作进一步说明。
18.实施例1120羽处于产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡，随机分为对照组(饲喂常规饲料)与添加剂组(包括：唾液乳杆菌培养上清液组、敏捷乳杆菌培养上清液组、唾液+敏捷乳杆菌培养上清液组)，每组30羽。在试验期间，分别饲喂常规饲料和含有培养上清液组合的饲料，连续饲喂
40天。每天对各试验组的鸡蛋进行计数与称重。
19.在饲喂期间，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组的日均产蛋率比对照组高0.11％，无统计学差异性(图1a)。对单枚蛋重的分析结果(图1b)显示，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组比对照组高1.47％，差异显著(p值＝0.003)。
20.实施例2120羽处于产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡，随机分为对照组(饲喂常规饲料)与添加剂组(包括：唾液乳杆菌培养上清液组、敏捷乳杆菌培养上清液组、唾液+敏捷乳杆菌培养上清液组)，每组30羽。在试验期间，分别饲喂常规饲料和含有培养上清液组合的饲料，连续饲喂40天。之后，对饲喂期间各组的总蛋重进行分析，结果(图2)显示，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组的总蛋重比对照组高1.58％。
21.实施例3120羽处于产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡，随机分为对照组(饲喂常规饲料)与添加剂组(包括：唾液乳杆菌培养上清液组、敏捷乳杆菌培养上清液组、唾液+敏捷乳杆菌培养上清液组)，每组30羽。在试验期间，分别饲喂常规饲料和含有培养上清液组合的饲料，连续饲喂40天。
22.在饲喂试验的第40天，从各组随机选取5羽蛋鸡，分离十二指肠制作石蜡切片进行组织学分析。对肠绒毛周长的分析结果(图3a)显示，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组比对照组高12.35％，差异显著(p值＝0.028)；对小肠绒毛褶皱数的分析结果(图3b)显示，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组比对照组高87.5％，差异显著(p值＝0.001)。该结果提示唾液+敏捷乳杆菌培养上清液可有效增加肠黏膜的吸收面积。
23.实施例4120羽处于产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡，随机分为对照组(饲喂常规饲料)与添加剂组(包括：唾液乳杆菌培养上清液组、敏捷乳杆菌培养上清液组、唾液+敏捷乳杆菌培养上清液组)，每组30羽。在试验期间，分别饲喂常规饲料和含有培养上清液组合的饲料，连续饲喂40天。
24.在饲喂试验的第40天，从各组随机选取5羽蛋鸡，分离十二指肠提取总rna，采用qpcr法分析其氨基酸转运体(pept1、eaat3、b0at)的mrna相对丰度。结果显示，“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组的十二指肠pept1相对丰度比对照组高94.22％，差异显著(p值＝0.020)(图4a)、“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组的十二指肠eaat3相对丰度比对照组高53.58％，差异显著(p值＝0.043)(图4b)、“唾液+敏捷乳杆菌培养上清液”组的十二指肠b0at相对丰度比对照组高44.94％，差异显著(p值＝0.024)(图4c)。