γ-氨基丁酸检测方法和用于改善睡眠、抗焦虑的组合物与流程

1.本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种γ-氨基丁酸检测方法和用于改善睡眠、抗焦虑的组合物。


背景技术：

2.随着经济快速发展和生活节奏的加快，人们面临的生活压力不断加大，所以，存在睡眠障碍的人群数量不断增大。根据世界卫生组织统计，全球范围内大约有29％的人存在不同程度的睡眠障碍，而在中国比例高达38.2％。《2015中国睡眠质量白皮书》显示不良的睡眠习惯、工作压力、精神紧张、家庭生活上的重大变化等都可能引发失眠，失眠已严重影响人们的健康。《2015中国睡眠质量白皮书》还具体显示：只有37％的人在早晨是自然醒，30％的人要靠手机闹钟闹醒；59％的人有熬夜的习惯，而睡前听音乐、玩手机/平板电脑是导致熬夜的主要行为；93％的人在睡眠过程中会出现做梦、失眠、打鼾等情况；90％的人在睡醒后会感觉身体不舒服。
3.目前能够用来改善睡眠的物品主要有药物和保健食品，其中，药物主要是以佐匹克隆等安眠药为主，保健食品主要是以褪黑素为主要成分的保健食品。以佐匹克隆为主的药品虽然可以促进睡眠，但是长期服用有副作用和依赖性，而以褪黑素为主的保健食品虽然副作用相对较小，但是普遍存在睡眠改善效果不好的问题。


技术实现要素：

4.本发明实施例提供了一种γ-氨基丁酸检测方法和用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，以准确检测组合物中γ-氨基丁酸含量，进而提高组合物中γ-氨基丁酸含量，从而提高通过食品改善睡眠的效果，对抗精神焦虑。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下方案实现：
6.根据本发明实施例的一个方面，提供了一种γ-氨基丁酸检测方法，适用于检测包含米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中的γ-氨基丁酸含量，所述检测方法包括：
7.利用含水提取溶液制备待测组合物的试样溶液；利用所述提取溶液或水溶液和γ-氨基丁酸标准样品制备多个不同浓度的标准工作溶液；
8.在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪获取试样溶液的色谱图；基于各标准工作溶液对应的在所述设定检测条件下获得的色谱图，利用所述试样溶液的色谱图得到待测组合物的γ-氨基丁酸含量；其中，所述设定检测条件包括：流动相包含乙腈和三水合乙酸钠溶液且为梯度洗脱。
9.在一些实施例中，利用含水提取溶液制备待测组合物的试样溶液，包括：
10.称取第一数值克数的待测组合物的样品，并量取第二数值毫升的提取溶液，将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液；
11.对所述第一混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清
液，或者还进行至少一次利用所述第二数值毫升的提取溶液对从离心处理后的所述第一混合液提取上清液后剩余的样品残渣提取上清液的操作；
12.将各次提取的上清液合并在一起并利用所述提取溶液定容至第三数值毫升，摇匀后得到试样溶液；所述第二数值是所述第一数值的50～150倍，所述第三数值是第二数值的5～15倍；所述提取溶液为乙醇和水的混合溶液；
13.在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪获取试样溶液的色谱图；基于各标准工作溶液对应的在所述设定检测条件下获得的色谱图，利用所述试样溶液的色谱图得到待测组合物的γ-氨基丁酸含量，包括：
14.分别取相同毫升的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液，并分别进行衍生化反应；其中，所述多个不同浓度的标准工作溶液是通过利用提取溶液或水对标准品储备液逐级稀释得到的，所述标准品储备液是通过利用提取溶液或水溶解γ-氨基丁酸标准样品得到，所述空白样液为提取溶液；
15.在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪分别检测衍生化反应的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液的色谱图；
16.根据衍生化反应后的多个不同浓度的标准工作溶液的色谱图建立标准浓度曲线，并依据所述标准浓度曲线根据衍生化反应后的试样溶液和空白样液的色谱图得到待测组合物的样品的γ-氨基丁酸含量。
17.在一些实施例中，称取第一数值克数的待测组合物的样品，并量取第二数值毫升的提取溶液，将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液，包括：
18.称取第一数值克数的待测组合物的样品于离心管中，并在所述离心管中加入量取的第二数值毫升的提取溶液，对离心管中溶液依次进行超声、振荡及静置操作，以将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液；
19.对所述第一混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清液，还利用所述第二数值毫升的提取溶液对从离心处理后的所述第一混合液提取上清液后剩余的样品残渣提取上清液的操作，包括：
20.将所述第一混合液盛装在离心管中进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清液转入容量瓶中，并将样品残渣保留在离心管中；
21.向离心管中的样品残渣加入第二数值的提取溶液，对离心管中样品残渣和提取溶液的混合液依次进行超声、振荡及静置操作，得到第二混合液；
22.对所述第二混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第二混合液中提取上清液转入所述容量瓶，以将各次提取的上清液合并在一起；
23.分别取相同毫升的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液，并分别进行衍生化反应，包括：
24.利用水溶解γ-氨基丁酸标准样品并进行定容，得到标准品储备液；
25.利用提取溶液对所述标准品储备液进行逐级稀释，得到多个不同浓度的标准工作溶液；
26.取第四数值毫升的提取溶液作为空白样液，并取第四数值毫升的所述试样溶液及第四数值毫升的各不同浓度的标准工作溶液，放入相应的具塞试管中；
27.在各具塞试管中加入碳酸氢钠溶液和dabs-cl衍生试剂，分别混匀后在水浴中进
氨基丁酸粉为通过以l-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌生物发酵得到的γ-氨基丁酸粉。
46.在一些实施例中，所述γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量是上述任一实施例所述的γ-氨基丁酸检测方法确定。
47.本发明的有益效果是：
48.本发明实施例的利用本发明实施例的γ-氨基丁酸检测方法，不仅能够实现检出组合物中γ-氨基丁酸含量，而且可以取得较高检测准确性，提高了生产用于改善睡眠、抗焦虑的组合物的产品的可行性，为产品服用含γ-氨基丁酸组合物产品提供了安全保证。另外，本发明实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，通过利用发酵法生产的γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉得到用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，发现利用外源性γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉天然含有的维生素、矿物质、γ-氨基丁酸、各种营养物质等相互作用提高了改善睡眠的效果，而且与单独的γ-氨基丁酸相比，口感更好，提高了用户体验。解决了褪黑素改善睡眠效果不佳，助睡眠药物存在依赖性和副作用，保健品口感不佳不利于服用等问题。
附图说明
49.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
50.图1是本发明一实施例的γ-氨基丁酸检测方法的流程示意图；
51.图2是利用现有标准检测方法检测本发明实施例的组合物的γ-氨基丁酸的色谱图；
52.图3是利用本发明一实施例的γ-氨基丁酸检测方法检测本发明实施例的组合物的γ-氨基丁酸的色谱图；
53.图4是本发明一实施例的γ-氨基丁酸检测方法中标准工作溶液对应的标准曲线。
具体实施方式
54.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施方式，对本发明做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施方式及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
55.应该强调，术语“包括/包含”在本文使用时指特征、要素、步骤或组件的存在，但并不排除一个或更多个其它特征、要素、步骤或组件的存在或附加。
56.现有用来改善睡眠的保健食品主要以褪黑素为主要成分，但是该种保健食品普遍存在睡眠改善效果不好的问题。
57.针对上述问题，发明人在研究用于改善睡眠的食品的过程中，了解到，医学证实γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称gaba)能够降低神经元活性，防止神经细胞过热，能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢，所以能够起到一定的镇静神经和抗焦虑的作用。而且，目前尚未有研究发现人体对γ-氨基丁酸有依赖性等副作用。
58.目前γ-氨基丁酸主要是用在顽固性癫痫病药物、抗衰老药物等的制备中，用量限
制较小。但若将γ-氨基丁酸用在保健品中，用量限制较大，因为为了保证安全，国家卫生部限定外源性补充的γ-氨基丁酸每人每天不得超过500mg。若每人每天外源性补充的γ-氨基丁酸较少，则难以起到镇静药物作用，若较多，则超出了国家规定的安全用量。
59.发明人经过长期研究发现，γ-氨基丁酸粉、米胚芽粉等构成的组合物表现出极佳的镇静药物作用，但是目前主要依据中国农业部标准《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)检测γ-氨基丁酸含量，其虽然可以准确地检测γ-氨基丁酸粉中的γ-氨基丁酸含量，但难以准确检测组合物中的γ-氨基丁酸含量。在此情况下，若要保证满足国家规定的安全用量，就需要大大减少组合物中的γ-氨基丁酸粉配比，这会导致达不到较好的睡眠改善效果；若要保证达到较好的睡眠改善效果，就需要提高组合物中的γ-氨基丁酸粉配比，但这会导致组合物中的γ-氨基丁酸含量超过国家规定的安全用量的风险。因此，目前尚未有使用外源性γ-氨基丁酸并能达到很好的改善睡眠、抗焦虑作用的保健食品。
60.基于此，为了准确检测组合物(同时包含外源性γ-氨基丁酸粉和含天然γ-氨基丁酸的物质的组合物)中的γ-氨基丁酸含量，通过对现有中国农业部标准《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中的检测方法进行改进，本发明提供了一种γ-氨基丁酸检测方法，适用于检测包含米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中的γ-氨基丁酸含量。参见图1，所述γ-氨基丁酸检测方法包括以下步骤：
61.步骤s110：利用含水提取溶液制备待测组合物的试样溶液；利用所述提取溶液或水溶液和γ-氨基丁酸标准样品制备多个不同浓度的标准工作溶液；
62.步骤s120：在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪获取试样溶液的色谱图；基于各标准工作溶液对应的在所述设定检测条件下获得的色谱图，利用所述试样溶液的色谱图得到待测组合物的γ-氨基丁酸含量；其中，所述设定检测条件包括：流动相包含乙腈和三水合乙酸钠溶液且为梯度洗脱。
63.上述步骤s110中，在《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中，是使用乙腈溶解γ-氨基丁酸标准样品得到标准工作溶液，然而，本发明的发明人在实际研究操作过程中发现γ-氨基丁酸(即gaba)微溶于乙腈，这导致后续衍生反应后未出峰，所以改用水溶解γ-氨基丁酸标准样品得到标准工作溶液，另外，由于含水提取溶液中含有水，所以或者可以使用提取溶液溶解γ-氨基丁酸标准样品得到标准工作溶液。因此该步骤s110中，是利用含水提取溶液或水溶液而不是利用乙腈溶解γ-氨基丁酸标准样品得到标准工作溶液，以此能够帮助检测出组合物中的γ-氨基丁酸。
64.上述步骤s120中，γ-氨基丁酸检测是基于液相分离原理实现。发明人在实际操作过程中发现，利用现有检测方法中的洗脱方式进行检测时，例如，流动相为乙腈/三水合乙酸钠溶液＝35/65，柱效为12500，但未达到基线分离。现有检测方法中流动相洗脱过程中各组合物的比例不变，所以，本实施例改为梯度洗脱，可使流动相中各组合物的比例不断变化，例如，乙腈在25min内从30％提升至35％。通过在检测过程中不断改变流动相的极性，使得γ-氨基丁酸与干扰物能够更好的分离，以达到基线分离的要求。若未达到基线分离，则目标检测物(γ-氨基丁酸)的吸收峰与干扰物存在重叠，在计算目标检测物组分的峰面积时就会有影响，导致无法得到精确的目标检测物的含量。所以，本实施例通过将流动相改为梯度洗脱，基线分离达到一定程度，能够便于得到更精确的γ-氨基丁酸含量的检测结果。
通过改变流动相比例，采用梯度洗脱，能够控制流动相极性变化，有效抑制米胚芽粉中干扰物质对γ-氨基丁酸检测的影响，在高效液相色检测中，能够检出图谱中有效分离γ-氨基丁酸对应的峰以及干扰峰，从而能够有效、准确地检出γ-氨基丁酸的含量。
65.用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中，米胚芽粉中复杂的化学成分会干扰组合物中γ-氨基丁酸成分的检测，使得难以检测出包含米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉中的γ-氨基丁酸含量。该实施例的检测方法通过将乙腈改为水或含水提取溶液，并调整流动相，能解决γ-氨基丁酸含量检测不准的问题。
66.具体实施例中，上述步骤s110中，利用含水提取溶液制备待测组合物的试样溶液，具体可包括步骤：
67.s111：称取第一数值克数的待测组合物的样品，并量取第二数值毫升的提取溶液，将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液；
68.s112：对所述第一混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清液，或者还进行至少一次利用所述第二数值毫升的提取溶液对从离心处理后的所述第一混合液提取上清液后剩余的样品残渣提取上清液的操作；
69.s113：将各次提取的上清液合并在一起并利用所述提取溶液定容至第三数值毫升，摇匀后得到试样溶液；所述第二数值是所述第一数值的50～150倍，所述第三数值是第二数值的5～15倍；所述提取溶液为乙醇和水的混合溶液。
70.该步骤s111中，该待测组合物的样品可以是本发明任一实施例所述的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物产品。所述提取溶液为乙醇和水的混合溶液，具体可以是，无水乙醇和水的混合溶液，可以是现有检测方法中的提取液，例如，无水乙醇和水的体积比可以为4/1。另外，可以称取两份平行的待测组合物的样品，用于进行后续同样步骤的操作，以此可以便于验证检测结果的偏差。
71.在《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中，称取的待测样品是1g，量取的提取溶液是10ml。
72.在步骤s111中，与现有检测方法相比，待测组合物的样品的称取量相对于提取溶液的量取量更少，可便于用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中的γ-氨基丁酸更好地溶解于提取溶液中，也就是更好地被提取出来。
73.例如，称取的样品可以小于1g，同时量取的提取溶液可以类似于10ml。具体例如，所述第一数值的范围可以为0.05～0.5，具体地，称取的组合物的样品可以是，0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.12g、0.15g、0.17g、0.2g、0.23g、0.25g、0.29g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g等；所述第二数值的范围可以为5～15，具体地，量取的提取溶液可以是，6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml等。
74.再例如，所述第二数值可以是所述第一数值的50～150倍，具体地，可以是60倍、80倍、90倍、100倍、120倍等。如此一来，因为现有检测方法中，量取的提取溶液的毫升数数值是称取的样品的克数数值的10倍，所以本实施例可以保证待测组合物的样品的称取量相对于提取溶液的量取量更少。
75.在一些实施例中，所述第一数值的范围为0.05～0.5，所述第二数值的范围为5～15，所述第三数值的范围为50～150。进一步的实施例中，所述第二数值是所述第一数值的100倍，所述第三数值是第二数值的10倍。
76.上述步骤s111中，可以采取一系列可行的操作称取样品，量取提取溶液，混匀样品和提取溶液，例如，通过超声、振荡等操作将样品和提取溶液均匀混合。
77.具体实施时，上述步骤s111，即，称取第一数值克数的待测组合物的样品，并量取第二数值毫升的提取溶液，将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液，具体可包括步骤：s1111，称取第一数值克数的待测组合物的样品于离心管中，并在所述离心管中加入量取的第二数值毫升的提取溶液，对离心管中溶液依次进行超声、振荡及静置操作，以将称取的样品和量取的提取溶液均匀混合，得到第一混合液。
78.该步骤s1111中，通过超声可将组合物中的γ-氨基丁酸溶解至提取液中，从而起到超声提取的作用。该第一数值可以为0.08g、0.1g、0.2g或0.3g左右，该第二数值可以与现有检测方法中每次量取的提取溶液的量相同，例如，可以是10ml左右，所使用的离心管可以是根据提取溶液的量取的量和提取溶液添加次数确定，例如，可以是50ml容量。
79.另外，超声、振荡及静置的参数可以根据一般经验确定。例如，超声提取的时长范围为20～40min，例如可以是25min、30min、35min等；振荡时长范围为1～8min，例如可以是2min、3min、5min、6min、7min等；静置时长范围可为3～10min，例如可以是4min、5min、7min、8min、9min等。具体实施时，超声的时长可为25～35min，振荡的时长可为1～3min，静置的时长可为3～7min。
80.该步骤s112中，可以经过一次提取得到后续步骤s113的试样溶液，或者可以进行两次或更多次提取，并将各次提取的上清液合并得到后续步骤s113的试样溶液。第二次及以上次数的上清液提取操作可以类似于第一次的上清液提取操作，或者可以简化少量步骤，后一次提取上清液的操作是基于前一次提取上清液操作后剩余的样品残渣进行。
81.在《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中，进行了两次提取上清液的操作，在本实施例的上述步骤s112中，同样也可以提取两次上清液。
82.具体实施时，上述步骤s112，即，对所述第一混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清液，还利用所述第二数值毫升的提取溶液对从离心处理后的所述第一混合液提取上清液后剩余的样品残渣提取上清液的操作，具体可包括步骤：
83.s1121：将所述第一混合液盛装在离心管中进行离心处理，并从离心处理后的所述第一混合液中提取上清液转入容量瓶中，并将样品残渣保留在离心管中；
84.s1122：向离心管中的样品残渣加入第二数值的提取溶液，对离心管中样品残渣和提取溶液的混合液依次进行超声、振荡及静置操作，得到第二混合液；
85.s1123：对所述第二混合液进行离心处理，并从离心处理后的所述第二混合液中提取上清液转入所述容量瓶，以将各次提取的上清液合并在一起。
86.该步骤s1121和步骤s1123中，离心处理的转速为3500～4500r/min，例如可以是4000r/min或4200r/min，离心处理的时长为10～20min，例如，可以是12min、15min或18min。该步骤s1121中，容量瓶的规格可以根据后续步骤s113所需定容的量确定，例如其最大容量可以大于或等于后续第三数值的毫升数。
87.该步骤s113中，若在上述步骤s112中提取了一次上清液，则该步骤中将一次提取的上清液定容至第三数值毫升数，若在上述步骤s112中提取了多次上清液，则该步骤中将多次提取的上清液定容至第三数值毫升数。
88.在《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中，试样溶液
定容的量是25ml。在本实施例的步骤s113中定容的毫升数可以大于现有的试样溶液定容的量。通过减少样品量，增多定容的量，能够稀释干扰物，从而使得在检出过程中γ-氨基丁酸出峰更好地分离。
89.所述第三数值可以是第二数值的5～15倍，例如，可以是6倍、8倍、9倍、10倍、12倍等。以此本实施例的可使试样溶液定容的量大于现有检测方法中的试样溶液定容的量。具体实施时，所述第二数值可以是所述第一数值的100倍，所述第三数值可以是第二数值的10倍。在确定各数值(如第一数值、第二数值、第三数值等)的倍数关系后，可以约束试样溶液的溶度情况。另外，所述第三数值的范围可为50～150，例如，定容的量可以是60毫升、70毫升、80毫升、100毫升、120毫升等。各数值的具体数值可以基于待测液中γ-氨基丁酸浓度来确定。
90.进一步地，上述步骤s120中，在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪获取试样溶液的色谱图；基于各标准工作溶液对应的在所述设定检测条件下获得的色谱图，利用所述试样溶液的色谱图得到待测组合物的γ-氨基丁酸含量，具体可包括步骤：
91.s121：分别取相同毫升的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液，并分别进行衍生化反应；其中，所述多个不同浓度的标准工作溶液是通过利用提取溶液或水对标准品储备液逐级稀释得到的，所述标准品储备液是通过利用提取溶液或水溶解γ-氨基丁酸标准样品得到，所述空白样液为提取溶液；
92.s122：在设定检测条件下，利用高效液相色谱仪分别检测衍生化反应的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液的色谱图；
93.s123：根据衍生化反应后的多个不同浓度的标准工作溶液的色谱图建立标准浓度曲线，并依据所述标准浓度曲线根据衍生化反应后的试样溶液和空白样液的色谱图得到待测组合物的样品的γ-氨基丁酸含量。
94.在《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)中，仅使用试样溶液和标准工作溶液进行检测，试样溶液和标准工作溶液均是取出1ml，利用了0,20ml的碳酸氢钠溶液和0.40ml的dabs-cl衍生试剂(4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯衍生试剂)进行衍生反应，其中，碳酸氢钠溶液是通过将0.40g碳酸氢钠水溶解并稀释至10ml得到，碳酸氢钠溶液浓度为0.04g/ml，4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯衍生试剂是通过将20mg的4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯用乙腈溶解并稀释至10ml，浓度为2mg/ml。
95.该步骤s121中，相对于现有检测方法，不仅使用了标准工作溶液，还使用了空白样液(或称空白样)，用于确认反应所用的试剂对γ-氨基丁酸的检测没有干扰。
96.另外，该步骤s121中，所述的多种不同浓度的标准工作溶液可以与《稻米中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法》(ny/t 2890-2016)标准工作溶液具有类似的浓度梯度。各种不同浓度的标准工作溶液可以用提取溶液或水对标准品储备液逐级稀释得到的，其中，利用提取溶液进行逐级稀释，可以使得样品体系所用的溶液尽量保持一致，从而使检测结果更准确。
97.具体实施时，上述步骤s121中，分别取相同毫升的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液，并分别进行衍生化反应，具体可包括步骤：
98.s1211：利用水溶解γ-氨基丁酸标准样品并进行定容，得到标准品储备液；
99.s1212：利用提取溶液对所述标准品储备液进行逐级稀释，得到多个不同浓度的标
准工作溶液；
100.s1213：取第四数值毫升的提取溶液作为空白样液，并取第四数值毫升的所述试样溶液及第四数值毫升的各不同浓度的标准工作溶液，放入相应的具塞试管中；
101.s1214：在各具塞试管中加入碳酸氢钠溶液和dabs-cl衍生试剂，分别混匀后在水浴中进行衍生化反应；
102.s1215：利用微孔滤膜对各具塞试管中衍生化反应后的混合液进行过滤，得到衍生化反应后的空白样液、所述试样溶液及多个不同浓度的标准工作溶液。
103.通过上述步骤s1211和步骤s1212可以配制所需标准工作溶液。γ-氨基丁酸标准样品可以为现有检测方法中的γ-氨基丁酸标准样品。标准品储备液的定容容量可以与第二数值相同，可以与现有检测方法中的定容容量相同，例如，定容至10ml；标准品储备液的浓度可以类似于现有检测方法中标准品储备液的浓度，例如，10mg标准样品溶解于10ml水中，可以得到1000mg/l浓度的标准储备液。该实施例中，利用水溶解γ-氨基丁酸标准样品，而不是利用现有检测方法中的乙腈进行溶解，可以使得γ-氨基丁酸标准样品中的γ-氨基丁酸更好地溶解于液体中。另外，所述的多个不同浓度的标准工作溶液的浓度可以类似于现有检测方法，不同之处在于此处用提取溶液进行稀释，可以使得样品体系一致。
104.具体实施时，上述步骤s1211，即，利用水溶解γ-氨基丁酸标准样品并进行定容，得到标准品储备液，具体可包括步骤：s1411，利用水溶解γ-氨基丁酸标准样品并定容，得到浓度为1000mg/l的标准品储备液。
105.上述步骤s1212，即，利用提取溶液对所述标准品储备液进行逐级稀释，得到多个不同浓度的标准工作溶液，具体可包括步骤：s12121，利用提取溶液对浓度为1000mg/l的标准品储备液进行逐级稀释，得到浓度为2mg/l、5mg/l、10mg/l、50mg/l及100mg/l的标准工作溶液。
106.上述步骤s1213中，用于放入具塞试管的液体的毫升数可以与现有检测方法中的毫升数类似，例如，第四数值可以为1ml。
107.上述步骤s1214中，衍生反应的条件可以类似于现有检测方法中的衍生反应的条件或进行一定调整得到，例如，水浴温度可以为60℃～80℃，具体例如，可以是65℃、70℃或75℃，衍生反应的时长可以为15～25min，具体例如，可以为18min、20min、22min等。
108.具体实施时，上述步骤s1214，即，在各具塞试管中加入碳酸氢钠溶液和dabs-cl衍生试剂，分别混匀后在水浴中进行衍生化反应，具体可包括步骤：s12141，在各具塞试管中加入0.20ml的浓度为0.04g/ml的碳酸氢钠溶液和0.4ml的浓度为2mg/ml的dabs-cl衍生试剂，分别混匀后在70℃水浴中进行衍生化反应；dabs-cl衍生试剂为4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯经乙腈溶解的试剂。
109.该步骤s12141中，可以类似于现有检测方法，碳酸氢钠溶液可以通过将0.40g碳酸氢钠水溶解并稀释至10ml得到，dabs-cl衍生试剂可以通过将20mg的4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯用乙腈溶解并稀释至10ml得到。
110.进一步的实施例中，其余检测条件可以参照现有检测方法中进行，例如，所述设定检测条件还可包括：色谱柱为250mm*4.6mm的c
18
柱，检测波长为436nm，柱温为30℃，进样量为10μl。另外，检测条件还可包括：流动相中的a相和b相分别为乙腈和三水合乙酸钠溶液，经25min乙腈的体积份数由30提升至35，三水合乙酸钠溶液的体积份数由70下降至65，流速
为1.0ml/min。其他实施例中，检测条件中的一个或多个参数可以在可行范围内做适当调整。
111.超声的时长可为25～35min，振荡的时长可为1～3min，静置的时长可为3～7min，离心处理的转速可为3500～4500r/min，离心处理的时长可为10～20min；衍生反应的时长可为15～25min。
112.上述步骤s123中，具体地，可以基于各浓度标准工作溶液对应的衍生化反应结果的色谱图计算各浓度标准工作溶液γ-氨基丁酸的峰面积，并结合相应浓度建立标准浓度曲线；并可以根据空白样液和试样溶液对应的衍生化反应结果的色谱图和该基线计算γ-氨基丁酸的峰面积，并在该标准浓度曲线中找到对应的浓度值。
113.在一些实施例中，还可以采集多个样本进行检测，将最终的检测结果求平均后，作为最终的检测结果。
114.在另一些实施例中，上述各实施例所述的γ-氨基丁酸检测方法，还可包括用来评价本发明检测方法的步骤。示例性地，上述步骤s111中，称取的第一数值克数的待测组合物的样品可以包括两份并行样品，例如，两份0.1g左右的待测组合物的样品，更具体地，例如，一份为0.1005g，另一份为0.1003g。每一份样品均进行上述实施例步骤中所述的操作，以得到相应的色谱图。
115.称取的第一数值克数的待测组合物的样品可包括两份并行样品。
116.进一步地，在一些实施例中，γ-氨基丁酸检测方法还可包括步骤：根据两份并行样品的色谱图计算两份并行样品的标准偏差。该步骤中，标准偏差(rsd)的计算方式可以根据现有检测方法中的方式进行计算。例如，相对标准偏差(rsd)可以通过计算标准偏差(sd)与计算结果算术平均值的百分比值得到。该相对标准偏差可以用来表示分析测试结果的精密度，或者可以用于确定标准偏差符合药典对分析方法分析平行样品的要求。药典对分析方法分析平行样品的要求可以为现有要求的标准。
117.在另一些实施例中，γ-氨基丁酸检测方法还可包括步骤：计算标准浓度曲线的相关系数。该步骤中，该标准浓度曲线为上述实施例的步骤得到的标准浓度曲线。可以利用现有的方法计算标准浓度曲线的相关系数。利用该标准浓度曲线可以确定该相关系数符合药典对分析方法相关系数的要求。
118.上述各实施例的γ-氨基丁酸检测方法，通过调整标准品溶解液及稀释剂和样品称样量，并利用基于相似相容的液相分离原理，通过采用梯度洗脱以调整流动相的比例，从而改进了流动相的极性，改变了待测成分的出峰顺序和时间，从而达到干扰成分与待测物达到基线分离，实现了γ-氨基丁酸的检出，提高了检测准确性。
119.另外，本发明实施例还提供了一种用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，按重量份数计算，所述组合物包括：75～99份的米胚芽粉和1～25份的通过生物发酵方法得到的γ-氨基丁酸粉；所述γ-氨基丁酸粉中的γ-氨基丁酸的含量不低于20％。
120.进一步的实施例中，所述米胚芽粉可为80～97份，所述γ-氨基丁酸粉可为1～10份；所述γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量可不低于90％。
121.其中，所述γ-氨基丁酸粉可以利用各种可行的菌种发酵得到，例如，希氏乳杆菌、乳酸菌、短乳杆菌和植物乳杆菌，发酵所采用的原料可以是各种可行的原料，例如，l-谷氨酸钠。具体实施时，γ-氨基丁酸粉可以是通过以l-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌生物发酵
得到的γ-氨基丁酸粉。具体地，可以以l-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成，其性状可为白色或淡黄色粉末，γ-氨基丁酸含量可大于等于90％，其余还可含有水分、灰分等。
122.米胚芽粉是由大米的营养精华米胚形成的粉，可通过对大米胚芽粉碎后得到，含有胚芽所有的营养成分，包括淀粉、蛋白质、脂肪、γ-氨基丁酸、多种维生素和矿物质等。米胚芽粉不同于玉米胚芽油，因为，玉米胚芽油主要是玉米胚芽经过提取得到的油，主要成分为植物油脂。用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的份数体现了其二者的重量比例，例如，若组合物包括90份的米胚芽粉和10的γ-氨基丁酸粉，则米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的称重比为90:10。再例如，米胚芽粉为85份，γ-氨基丁酸粉为5份，则米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的重量配比为85:5。在具体实施时，所述γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量可以是不低于95％。不同γ-氨基丁酸含量可以通过在制备γ-氨基丁酸粉过程中通过提纯得到。
123.该些实施例中，生物发酵方法得到的γ-氨基丁酸粉本身，基本无味，口感不佳，而且消费者服用耐受性不好。米胚芽粉含有胚芽所有的营养成分，尤其是含有天然的γ-氨基丁酸、多种维生素和矿物质等。将γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉混合在一起得到用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，一方面，通过一定量的米胚芽粉能够改善食品的口感，利于服用；另一方面，发明人发现，不仅米胚芽粉中含有天然的γ-氨基丁酸有助于改善睡眠，而且，米胚芽粉中的多种维生素和矿物质对γ-氨基丁酸的改善睡眠的效果有一定的促进作用，所以，将米胚芽粉和外源性的γ-氨基丁酸粉组合服用时改善睡眠的效果更佳。而且，通过实验研究发现，在γ-氨基丁酸粉中的γ-氨基丁酸含量不低于90％的情况下，按80～97份的米胚芽粉和1～10份的γ-氨基丁酸粉的配比得到的组合物，所达到的改善睡眠的效果更为显著，明显好于以褪黑素为主要成分的用于改善睡眠的保健品。米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉的具体配比数值，可结合γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸含量和服用量，在国家卫生部规定的用量内确定。
124.调查显示，虽然成年人的失眠患病率高达57％，但73％的患者从未服用过药物或采用其他方法改善睡眠，原因包括：人们担心服药会带来依赖性和副作用，考虑到现有保健品改善睡眠的效果不好，而且，因药物或保健品的口感不佳而存有排斥心理。而本发明实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，因以γ-氨基丁酸为主要作用成分，并配合米胚芽粉使用，能够具有显著的改善睡眠的效果，而且口感更好，并且尚未有研究发现其中的γ-氨基丁酸存在依赖性和副作用，所以能够带来更好的用户体验。
125.进一步的实施例中，本发明各实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物除了γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉外，还可包括其他成分，以进一步提高组合物的口感和效果。例如，用于改善睡眠、抗焦虑的组合物还可包括茶氨酸粉、酸枣仁粉、维生素b6、葡萄糖酸镁及水果粉中的一种或多种。其中，按重量份数计算，所述茶氨酸粉可以为0.04～0.5份，所述酸枣仁粉可以为0.2～2份，所述维生素b6可以为0.0004～0.001份，所述葡萄糖酸镁可以为0.25～0.5份，所述水果粉可以为5～10份。另外，在组合物含有上述一种或多种成分的情况下，所述组合物中的米胚芽粉可以为81～94份。此外，所述组合物中的γ-氨基丁酸粉可以不低于90％或95％。
126.更具体地，所述γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量不低于95％；所述γ-氨基丁
酸粉为通过以l-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌生物发酵得到的γ-氨基丁酸粉。
127.在生产食品或保健品(如本发明各实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物)需要检测其中组分的含量。所以在生产本发明各实施例所述的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物时需要检测组合物中的γ-氨基丁酸的含量。所以，进一步地，上述各实施例所述的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中，所述γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量是利用上述任一实施例所述的γ-氨基丁酸检测方法确定。
128.该些实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，能够作为保健食品改善睡眠，而且能够达到比以褪黑素为主要成分的保健食品更显著的睡眠改善效果。
129.另外，本发明实施例还提供了一种组合物制备方法，适用于制备上述任一实施例所述用于改善睡眠、抗焦虑的组合物。该些实施例所述组合物制备方法可包括以下步骤：
130.s210：在25～28℃的温度条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中以转速为180～230rpm的条件振荡培养24～48h，得到种子菌液；
131.s220：按1％～5％的接种量，在28～30℃的温度条件下，将所述种子菌液在种子扩大培养基中培养48～72h，得到扩大培养发酵液；
132.s230：分批流加l-谷氨酸钠至所述扩大培养发酵液，并流加2～4mol/l的盐酸至所述扩大培养发酵液，以及将扩大培养发酵液的ph保持为3.0～5.0，将反应温度保持为30℃～40℃，并持续反应3～5天，以发酵扩大培养发酵液；
133.s240：将发酵后的扩大培养发酵液升温至80℃～100℃，并在保持20～40min后灭菌；
134.s250：将灭菌后的扩大培养发酵液冷却至40℃～65℃；
135.s260：在冷却后的扩大培养发酵液中加入占其质量0.1％～1.0％的活性炭，并在40℃～65℃温度下搅拌20～40min以进行脱色；
136.s270：利用直径为0.20μm～0.24μm的钛棒对脱色后的扩大培养发酵液进行过滤，直至得到澄清滤液；
137.s280：将所述澄清滤液按每2000g～4000g离心10～20min的方式进行离心处理，并收集离心处理后的澄清液中的上清液；
138.s290：利用离子交换法对收集的上清液进行脱盐，得到γ-氨基丁酸含量为5％～10％的γ-氨基丁酸溶液；
139.s2100：在60℃～85℃的温度条件下，对所述γ-氨基丁酸含量为5％～10％的γ-氨基丁酸溶液进行真空浓缩，得到γ-氨基丁酸含量为30％～40％的γ-氨基丁酸浓溶液；
140.s2110：利用食用酒精对所述γ-氨基丁酸含量为30％～40％的γ-氨基丁酸浓溶液结晶，得到γ-氨基丁酸粉；
141.s2120：按上述用于改善睡眠、抗焦虑的组合物的配比，根据γ-氨基丁酸粉的γ-氨基丁酸含量确定米胚芽粉的份数和γ-氨基丁酸粉的份数；
142.s2130：根据确定的米胚芽粉的份数和γ-氨基丁酸粉的份数，以等量递增法混合相应份数的米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉，得到用于改善睡眠、抗焦虑的组合物。
143.在一些实施例中，还包括步骤s2140：采用上述步骤s110～s160中的γ-氨基丁酸检测方法对组合物进行检测得到组合物中γ-氨基丁酸含量，用于在食品质量检验过程中对该用于改善睡眠、抗焦虑的组合物中γ-氨基丁酸含量进行测定。
144.上述步骤s230中，反应3～5天后即停止反应。通过上述步骤s210～s230完成发酵过程。通过上述步骤s240完成加热杀菌过程。通过上述步骤s250对加热杀菌后的发酵液进行冷却，其中，可以使用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至40-65℃，并导入脱色罐中。通过上述步骤s260进行脱色，可以采用活性炭脱色，可将发酵液加入占发酵液质量0.1-1.0％的活性炭，保持40-65℃，搅拌20-40min进行脱色。
145.上述步骤s270中，脱色后的发酵液可以进行趁热过滤，可采用0.20-0.24μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清。上述步骤s280中，进行离心固液分离，可将上述澄清液进行离心，2000-4000g离心10-20min，收集含γ-氨基丁酸的上清液。
146.上述步骤s290中，离子交换法脱盐具体可包括：将上述上清液以1-2倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/l稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5％～10％。
147.上述步骤s2100中，可采用外循环式真空浓缩。上述步骤s2110中，进行结晶干燥，具体地，可在γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比可为1∶5-10，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤、甩干，60℃真空干燥4～8小时，得到γ-氨基丁酸结晶。γ-氨基丁酸结晶可为白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度可达95％以上。
148.下面结合一个具体实施例对上述方法进行说明，然而，值得注意的是，该具体实施例仅是为了更好地说明本技术，并不构成对本技术的不当限定。
149.在具体实施例中，以包含制备米胚芽粉96.8份和γ-氨基丁酸粉(γ-氨基丁酸含量为95％)3.2份的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物产品为例，组合物的制备方法可包括以下步骤：
150.s2.1，粉碎：取米胚芽，结果组织破碎机粉碎。
151.s2.2，过筛：米胚芽粉过80目筛，取筛下物。
152.s2.3，混合：按配方比例称取米胚芽粉和γ-氨基丁酸粉，以等量递增法混合。
153.s2.4，罐装：利用全自动粉体罐装机进行罐装，装量例如10g/袋。
154.s2.5，检测：根据产品标准对产品进行出厂检验。
155.s2.6，入库：检测合格产品入库。
156.上述步骤s2.3中所用的γ-氨基丁酸粉的发酵方法可包括以下步骤：
157.s1，发酵：25～28℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，180～230rpm振荡培养24～48h，获得种子菌液，按照接种量1～5％，在温度28～30℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养48-72h，分批流加l-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，同时流加2～4mol/l的盐酸，控制ph3.0～5.0和反应温度30～40℃，继续反应3-5天，即停止反应；
158.s2，加热杀菌：发酵结束，将体系升温80～100℃，保持20～40min，杀灭菌体；
159.s3，冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至40-65℃，并导入脱色罐中，待用；
160.s4，活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.1～1.0％的活性炭，保持40～65℃，搅拌20～40min进行脱色；
161.s5，过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.20～0.24μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
162.s6，离心固液分离：将上述澄清液进行离心，2000～4000g离心10～20min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
163.s7，离子交换法脱盐：将上述上清液以1～2倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/l稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5-10％；
164.s8，喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度60～85℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到30～40％；
165.s9，结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1:5～1:10，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥4-8小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度95％以上。
166.对于本发明实施例的包含米胚芽粉以及γ-氨基丁酸粉的组合物，在利用现有的检测标准流程进行检测时，如采用nyt2890-2016《稻米中γ-氨基丁酸的测定》时，高效液相色谱的色谱图中，存在干扰峰与γ-氨基丁酸对应的峰重叠，无法分离，导致无法检测。
167.上述步骤s2.5中，可以利用本发明一实施例的检测方法检测γ-氨基丁酸的含量，该检测方法可包括以下步骤：
168.(1)标准工作溶液配置：准确称取10mg左右γ-氨基丁酸标准品，用水溶解并定容至10ml，得到1000mg/l标准储备液。用提取液(无水乙醇/水＝4/1)逐级稀释成2mg/l、5mg/l、10mg/l、50mg/l、100mg/l的标准工作溶液。
169.(2)样品处理：准确称取两份平行0.1g样品于50ml离心管中，加入10ml提取溶液(无水乙醇/水＝4/1)，超声提取30min后，振荡2min，静置5min，于4000r/min，离心15min，将上清液转入100ml容量瓶中，样品残渣再用10ml提取溶液提取1次，合并2次提取液，用提取液定容至100ml，摇匀。
170.(3)衍生化：准确吸取1ml空白(无水乙醇/水＝4/1)、试样溶液和标准工作溶液于具塞试管中，加入0.20ml碳酸氢钠溶液和0.4ml dabs-cl衍生试剂，混匀后在70度水浴中衍生反应20min，用微孔滤膜过滤，待测。
171.(4)检测条件：色谱柱为c
18
，规格为250mm*4.6mm，检测波长为436nm，柱温为30℃，进样量为10μl；流动相：a相为乙腈(0-25min 30-35)，b相为三水合乙酸钠溶液(0-25min 70-65)；流速为1.0ml/min；仪器可采用agilent 1260配紫外检测器。
172.上述实施例的检测方法相对于现有标准检测方法具有以下改进及效果：(1)对标准品溶解液和稀释剂的调整：按照ny/t 2890-2016《稻米中γ-氨基丁酸的测定》的要求，标准品储备液是用乙腈溶解，实际操作过程中发现gaba在乙腈中微溶，衍生化反应后未出峰，因此，标准品改用水溶解，为了与样品体系尽量保持一致，标准工作液的稀释溶剂改为提取液。(2)对样品称样量和稀释倍数的调整：根据组合物中γ-氨基丁酸的理论含量计算，将称样量由1g调整为0.1g，提取液由定容到25ml调整为定容到100ml。(3)对流动相洗脱比例的调整：标准中流动相为乙腈/三水合乙酸钠溶液＝35/65，分离图谱如图2所示，柱效为
12500，但由图2可见γ-氨基丁酸对应的检出峰101和干扰物峰102未达到基线分离，本实施例在此基础上，将流动相改为梯度洗脱，乙腈体积比在25min内由30％升高到35％，分离图谱如图3所示，由图3可见γ-氨基丁酸对应的检出峰201和干扰峰202分离开了，达到了基线分离。其中，图2和图3两个检出图谱中的最高峰为γ-氨基丁酸对应的检出峰，其他为干扰物对应的检出峰。
173.对上述步骤s2.5中γ-氨基丁酸的含量的检测结果进行分析如下。
174.γ-氨基丁酸标准品信息如表1所示，建立的标准曲线如图4所示，相应的标准曲线的数据如表2所示，样品的检测结果的数据如表3所示。图4中拟合曲线的表达式为y＝74.451x+1.3137，其中，x和y分别表示横坐标和纵坐标，另外，r2＝0.9997，r为相关系数。
175.表1γ-氨基丁酸标准品信息
[0176][0177]
表2标准曲线数据
[0178]
编号取样ml定容ml浓度mg/l峰面积14101.96140.025104.91345.132109.81712.0451049.073746.0511098.147265.3
[0179]
表3样品的检测结果
[0180][0181][0182]
从上述检测结果来看，如图4所示，标准曲线相关系数为0.9997，符合药典对于分析方法相关系数的要求，即达到了0.998以上。如表3所示，两个平行样品标准偏差rsd为1.97％，符合方法对平行样品的要求。如表3所示，得到了γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸含量的检测结果，具体地，组合物中gaba含量约为297.22mg/10g。
[0183]
另外，选用本发明一实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，该组合物按照重量份数计算包括：96.8份的米胚芽粉，3.2份的γ-氨基丁酸粉，其中，γ-氨基丁酸粉中γ-氨基丁酸的含量为95％，对本实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物的改善睡眠和抗焦虑效果进行对比研究分析如下。
[0184]
首先，选取研究对象并设计实验方法进行实验。
[0185]
(1)试验对象：为睡眠一般的在校女大学生，无感冒和其他重大疾病史，以志愿者的形式招募，平均年龄在21.3
±
0.7岁，共160位。
[0186]
(2)实验方法：将试验对象分为4大组，即安慰剂组、褪黑素组、γ-氨基丁酸粉组以及组合物组，每组40人。安慰剂组受试者到达后，休息10分钟，然后被带至实验室，每人服用
安慰剂麦芽糊精冲剂10g；褪黑素组受试者到达后，休息10分钟，然后被带至实验室，每人服用某品牌保健食品褪黑素胶囊1粒；γ-氨基丁酸粉组受试者到达后，休息10分钟，然后被带至实验室，每人服用含量30.4％的γ-氨基丁酸粉1克；组合物组受试者到达后，休息10分钟，同样被带到准备好的实验室，服用本技术的组合物10克，以保证对γ-氨基丁酸摄入量相同，每天1次，连续10天。第一天，在试验前，采用欧姆龙hem－6021智能电子血压计对受试者进行血压测量，测量时，要求试验对象保持平静状态，视线向前直视，不能低头观察读数，测量后填写匹兹堡睡眠质量指数问卷(psqi)以及状态—特质焦虑问卷(stai)各一份。第10天试验结束后，三组受试者休息10分钟后，用同样的方法，测量血压，并分别填写匹兹堡睡眠质量指数问卷(psqi)以及状态—特质焦虑问卷(stai)各一份。
[0187]
对实验数据进行处理与分析，具体地，可将计量资料以均数
±
标准差表示，统计分析用可spss17.0软件进行统计。然后，对研究结果进行分析。
[0188]
(1)血压变化：
[0189]
如表4所示，研究数据显示四组收缩压和舒张压，试验后都低于试验前，且四组数据比较，对收缩压和舒张压的降低作用方面，四组没有明显差异(显著性差异p＞0.05，差异不明显)。
[0190]
表4各组收缩压和舒张压降低作用比较
[0191][0192]
(2)psqi量表结果：
[0193]
匹兹堡睡眠质量指数(psqi)总分大于11分的，说明睡眠质量一般。临床上，如果总分有3分的提高，就说明睡眠障碍上升了一个层次。
[0194]
如表5所示，本结果显示，试验前得分均超过了10分，说明各组受试者普遍睡眠质量一般，试验前后比较，除安慰剂组外的几组得分均明显下降，前后对比，有了较显著的改善(显著性差异p＜0.05，差异明显)。从改善的程度上，褪黑素组和组合物组分别与安慰剂组比较，均有较显著的改善(显著性差异p＜0.05，差异明显)，组合物组与褪黑素组比较，组合物组比褪黑素组效果改善更显著(显著性差异p＜0.05，差异明显)，说明组合物改善睡眠的效果比褪黑素更好。组合物组与γ-氨基丁酸粉组比较，效果普遍有所提升(显著性差异p＜0.05，差异明显)，可见米胚芽粉作为辅料在提升口感的同时提高了γ-氨基丁酸改善睡眠的作用效果。
[0195]
表5各组psqi量表比较结果
[0196]
[0197]
(3)stai量表结果：
[0198]
状态—特质焦虑问卷(stai)分为两部分，状态焦虑问卷(s-ai)和特质焦虑问卷(t-ai)，前者描述一种不愉快的短期的情绪体验，如紧张、恐惧、忧虑等，常伴有植物神经系统功能亢进，后者则用来描述相对稳定的，作为一种人格特征且具有个体差异的焦虑倾向。
[0199]
如表6所示，本试验stai量表结果显示安慰剂组和褪黑素组s-ai和t-ai量表结果试验前后均没有发生明显变化(显著性差异p＞0.05，差异不明显)，说明褪黑素对于缓解焦虑没有明显效果。组合物组和γ-氨基丁酸粉组s-ai和t-ai量表结果较试验前，均明显降低，说明组合物组具有明显的缓解焦虑作用，组合物组相对于γ-氨基丁酸粉组，对焦虑的缓解效果更明显。
[0200]
表6各组s-ai和t-ai量表结果比较
[0201][0202]
由此可见，经过人体试验证明本实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物口在感好的同时具有缓解睡眠和抗焦虑的作用。通过将米胚芽粉和γ-氨基丁酸进行合适的配比混合，能够使得米胚芽粉中的脂多糖、谷维素、角鲨烯和维生素e等天然生物活性物质促进γ-氨基丁酸对神经的作用，提高改善睡眠的效果，相比于常用的褪黑素不易产生依赖性。同时，通过调节米胚芽粉的用量可以调节组合物的口感，易于食用。
[0203]
综上所述，本发明实施例的利用本发明实施例的γ-氨基丁酸检测方法，不仅能够实现检出组合物中γ-氨基丁酸含量，而且可以取得较高检测准确性，提高了生产用于改善睡眠、抗焦虑的组合物的产品的可行性，为产品服用含γ-氨基丁酸组合物产品提供了安全保证。另外，本发明实施例的用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，通过利用发酵法生产的γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉得到用于改善睡眠、抗焦虑的组合物，发现利用外源性γ-氨基丁酸粉和米胚芽粉天然含有的维生素、矿物质、γ-氨基丁酸、各种营养物质等相互作用提高了改善睡眠的效果，而且与单独的γ-氨基丁酸相比，口感更好，提高了用户体验。解决了褪黑素改善睡眠效果不佳，助睡眠药物存在依赖性和副作用，保健品口感不佳不利于服用等问题。
[0204]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一个具体实施例”、“一些实施例”、“例如”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。各实施例中涉及的步骤顺序用于示意性说明本发明的实施，其中的步骤顺序不作限定，可根据需要作适当调整。
[0205]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。