一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠、小分子透明质酸钠组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠组合物及其应用。


背景技术：

2.近年来，因医疗技术的发展，人类的平均寿命得以延长，并且随着生活质量得以提高且对健康美好的生活的向往的提高，对皮肤美容及健康的关注正在增加。由此，为了保持健康的皮肤而开发出了多种美容功能性化妆品，尤其正在积极开展着用于预防、缓解及改善皮肤皱纹的形成的研究。此外，在当今化妆品成分到达皮肤真皮层来供给营养成分方面上存在局限性，并且随着在通过食品摄取来向皮肤供给营养成分或功能成分并呈现出皮肤美容增强效果的认识上的变化，还积极开展着发掘内在美食品材料的研究。
3.皮肤大致由表皮、真皮、皮下脂肪三层组成。表皮，尤其作为表皮的最外层的角质层起到皮肤屏障的作用，从而抑制皮肤中的水分和电解质的损失；真皮层具有通过胶原蛋白与弹性蛋白的合成来保持皮肤弹性并支撑结构的作用，即，胶原蛋白和弹性蛋白为成纤维细胞中所出品的主要蛋白质，并参与皮肤的机械稳固性、组织的结合力及弹性等。胶原蛋白根据形态和结构特征的不同构成多种同种型，1型和3型胶原蛋白形成真皮层的细胞间质组成成分，7型胶原蛋白为表皮与真皮连接区结构的主要组成物质。
4.皮肤老化是由存在于皮肤真皮组织中占据大部分蛋白质的胶原蛋白含量减少而引起的，胶原蛋白可为皮肤赋予张力和强度，因此，胶原蛋白的减少对皮肤老化及皱纹生成具有根深蒂固的关系。皮肤老化大致分为生理性老化引起的内源性老化，以及持续暴露于紫外线而引起的光老化。反复暴露于紫外线会导致胶原蛋白降解酶增加、胶原蛋白纤维的变性及破坏，并降低皮肤弹性，促进皱纹的生成。此外，皮肤含水量降低，皮肤水分散发过快，皮肤受体内自由基氧化等也会影响皮肤的老化。短期内进行皮肤补水对皮肤初老化有一定缓解和改善作用。提高皮肤弹性，提升皮肤含水量，改善皮肤保湿性，清除体内自由基等都可以改善皮肤老化的问题。
5.透明质酸钠属于分子比较小的透明质酸，它可以提高皮肤血液的微循环和营养吸收，帮助维持正常的新陈代谢。正由于它的超级保湿属性，透明质酸钠能够减轻皱纹使皮肤更光滑柔软。伴随着年龄的增加，皮肤中透明质酸含量急剧下降，皮肤保水能力因此减弱，从而产生皱纹。透明质酸钠，能渗透到真皮层，促进血液微循环，有利于皮肤对营养物质的吸收，起到抗皱的作用。毛华等人考察了不同分子量透明质酸钠在化妆品中的保湿功效，分子量高的透明质酸钠具有更好的防止皮肤水分流失的功效；分子量低的透明质酸在低浓度时基本没有防止皮肤水分流失的作用，但其增加皮肤水分含量的效果显著(毛华,王海英,栾贻宏,等.不同分子量透明质酸钠的保湿效果评价,第九届中国化妆品学术研讨会论文集,2012,19-22.)。可见，现有技术报道了不同分子量的透明质酸钠应用于化妆品中的保湿效果。
6.目前还没有关于通过口服透明质酸钠能够有效改善皮肤水分的合适分子量的报道。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠，通过口服达到有效改善皮肤水分的作用。
8.本发明的目的在于提供一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠组合物，极易被人体吸收，且具有改善皮肤水分功能。
9.本发明提供了一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠，所述小分子透明质酸钠水解物的平均分子量为82kda～800kda。
10.优选的，由以下步骤制备得到：将透明质酸钠在过氧化氢溶液条件下水解5～15h。
11.优选的，所述过氧化氢溶液的体积浓度为0.18％～0.22％；所述水解的温度包括60～80℃。
12.本发明提供了一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠组合物，包括以下重量份的组分：胶原蛋白肽水解液1～70份和所述小分子透明质酸钠1～70份；
13.所述胶原蛋白肽水解液中含有胶原三肽；所述胶原三肽的氨基酸序列为gly-pro-hyp。
14.优选的，所述胶原蛋白肽水解液中含有的胶原三肽的质量百分含量为8％～15％。
15.优选的，所述胶原蛋白肽水解液由以下步骤制备得到：
16.将鳕鱼皮用水解酶进行酶解，灭酶，分离水解液；
17.所述水解酶选自酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或几种；所述水解酶的添加量为鳕鱼皮质量的0.5
‰
～1.0
‰
；酶解的温度为45℃～60℃，酶解的时间为1h～4h，酶解的ph值为4.0～7.0。
18.优选的，所述小分子透明质酸钠组合物还包括以下重量份的组分：弹性蛋白1～50份、燕窝粉1～50份、山竹粉1～40份、鲑鱼鼻软骨粉1～30份、紫菊花粉1～30份、虾青素1～20份、银耳多糖1～20份、维生素c 1～20份和浓缩果汁1～20份。
19.优选的，所述小分子透明质酸钠组合物还包括以下重量份的组分：胶原蛋白肽水解液20～50份、小分子透明质酸钠20～50份、弹性蛋白15～35份、燕窝粉15～35份、山竹粉15～35份、鲑鱼鼻软骨粉10～20份、紫菊花粉10～20份、虾青素5～15份、银耳多糖5～15份、维生素c 5～15份和浓缩果汁5～15份。
20.优选的，所述小分子透明质酸钠组合物还包括以下重量份的组分：所述胶原蛋白肽水解液25份、所述小分子透明质酸钠25份、弹性蛋白20份、燕窝粉20份、山竹粉20份、鲑鱼鼻软骨粉15份、紫菊花粉15份、虾青素8份、银耳多糖8份、维生素c 8份和浓缩果汁8份。
21.本发明提供了所述小分子透明质酸钠水解物或所述小分子透明质酸钠组合物在制备改善皮肤老化、敏感的保健食品中的应用。
22.本发明提供了一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠，所述小分子透明质酸钠的平均分子量为80kda～800kda。本发明分别酶解得到不同分子量范围的透明质酸钠水解物，将不同分子量的透明质酸钠水解物经口服评价其对皮肤水分含量的影响，与透明质酸钠(0.1～1.0mda)相比，试验组平均分子量80kda～100kda、200kda～400kda、500kda～
800kda的透明质酸钠水解物均能提高皮肤含水量，并且80kda～100kda的透明质酸钠水解物使皮肤含水量的平均值由试验前的8.33
±
1.09提高到11.944
±
1.44，与阳性对照组(口服汤臣倍健透明质酸钠果味饮品)相比皮肤含水率显著提高。可见，透明质酸钠水解液对皮肤改善水分有一定功效，且分子量越低对皮肤水分改善效果越好。
23.本发明提供了一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠组合物，包括以下重量份的组分：胶原蛋白肽水解液1～70份和所述小分子透明质酸钠水解物1～70份；所述胶原蛋白肽水解液中含有胶原三肽；所述胶原三肽的氨基酸序列为gly-pro-hyp。所述组合物中除包含具有提高皮肤水分含量的小分子透明质酸钠水解物外还包括胶原蛋白肽水解液。所述胶原蛋白肽水解液含有胶原三肽，与同质量的胶原蛋白相比，能够有效提高皮肤水分含量。同时本发明还证明所述组合物具有改善皮肤水分，减少经皮水分散失，同时还会增加皮肤弹性的作用。同时将胶原蛋白水解液与透明质酸钠水解液进行直接混合复配配方，可降低常规制备方法中因高温喷雾干燥工艺影响活性成分及含量，提高产品功效活性。
附图说明
24.图1为高效液相色谱法检测胶原三肽的结果。
具体实施方式
25.本发明提供了一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠，所述小分子透明质酸钠的平均分子量为80kda～800kda。
26.在本发明中，小分子透明质酸钠是透明质酸钠经过水解后得到的平均分子量分布在80kda～800kda范围的小分子透明质酸钠的混合物，优选由以下步骤制备得到：将透明质酸钠固体在过氧化氢条件下水解5～15h。
27.本发明对所述透明质酸钠固体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的透明质酸钠固体来源即可。在本发明实施例中，所述透明质酸钠固体的平均分子量优选为0.1～1mda；所述透明质酸钠固体的纯度优选为≥99％。所述透明质酸钠固体的制备方法，优选包括以下步骤：
28.(a)以酵母菌为菌种接种于液体培养基中发酵培养，得到发酵液；
29.(b)从所述发酵液中分离透明质酸钠粗品；
30.(c)将所述透明质酸钠粗品除杂去除水分，得到透明质酸钠固体。
31.在本发明中，所述发酵培养时，酵母菌菌液和液体培养基的体积比优选为1：(7～9)，更优选为1：8。所述发酵培养的通气量为0.7～0.9vvm，更优选为0.8vvm。所述发酵培养的搅拌转速优选为230～270rpm，更优选为250rpm，培养温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述发酵时间优选为58～62h，更优选为60h。
32.在本发明中，所述分离的方法，优选所述发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入体积浓度80％乙醇水溶液进行沉淀，过滤，收集固体得到透明质酸钠粗品。所述除杂优选采用80％乙醇水溶液洗涤。
33.在本发明中，所述过氧化氢的体积浓度优选为0.18％～0.22％，更优选为0.2％。所述水解的温度优选包括60～80℃，更优选为65～75℃，最优选为70℃。所述水解后，测定所得透明质酸钠水解物的平均分子量。结果表明，采用上述方法制备的透明质酸钠水解物
的平均分子量分布在80kda～100kda。同时，采用上述水解方法，水解时间缩短为8～9h和5～7h时，分别得到200kda～400kda分子量和500～800kda的透明质酸钠水解物。实验证明，以阳性对照组(服用汤臣倍健透明质酸钠果味饮品)相比，试验组80kda～100kda、200kda～400kda、500kda～800kda的透明质酸钠水解液的皮肤含水量有显著提升，并且80kda～100kda一组试验前后批复水分要比200kda～400kda、500kda～800kda组有明显提升，提示分子量越低对皮肤水分改善效果越好。
34.本发明提供了一种小分子透明质酸钠组合物，包括以下重量份的组分：胶原蛋白肽水解液1～70份和所述小分子透明质酸钠1～70份；
35.所述胶原蛋白肽水解液中含有胶原三肽；所述胶原三肽的氨基酸序列为gly-pro-hyp。
36.在本发明中，所述胶原蛋白肽水解液中含有的胶原三肽的质量百分含量优选为8％～15％，更优选为10％～15％。所述胶原三肽的分子量优选为200～400da。所述胶原蛋白肽水解液优选由以下步骤制备得到：
37.将鳕鱼皮用水解酶进行酶解，灭酶，分离水解液。
38.在本发明中，所述水解酶优选选自酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或几种。在本发明实施例中，所述水解酶为由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合水解酶、由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶组成的复合水解酶、由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成的复合水解酶，由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成的复合水解酶、由酸性蛋白酶，中性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成的复合水解蛋白酶。各复合水解蛋白酶中，各酶的比例按照等质量复配。所述水解酶的添加量优选为鳕鱼皮质量的0.5
‰
～1.0
‰
，更优选为鳕鱼皮质量的0.6
‰
～0.8
‰
，最优选为0.7
‰
。酶解的温度优选为45℃～60℃，更优选为50～55℃。酶解的时间优选为1h～4h，更优选为2～3h。酶解的ph值优选为4.0～7.0。
39.在本发明中，为了进一步改善皮肤含水量、减少皮肤散失以及提高皮肤弹性等功能，本发明所述组合物优选增加了多种功效组分，所述小分子透明质酸钠组合物优选包括以下重量份的组分：所述胶原蛋白肽水解液1～70份、所述小分子透明质酸钠水解液1～70份、弹性蛋白1～50份、燕窝粉1～50份、山竹粉1～40份、鲑鱼鼻软骨粉1～30份、紫菊花粉1～30份、虾青素1～20份、银耳多糖1～20份、维生素c 1～20份和浓缩果汁1～20份；更优选包括以下重量份的组分：胶原蛋白肽水解液20～50份、小分子透明质酸钠水解液20～50份、弹性蛋白15～35份、燕窝粉15～35份、山竹粉15～35份、鲑鱼鼻软骨粉10～20份、紫菊花粉10～20份、虾青素5～15份、银耳多糖5～15份、维生素c 5～15份和浓缩果汁5～15份；最优选包括以下重量份的组分：所述胶原蛋白肽水解液25份、所述小分子透明质酸钠水解液25份、弹性蛋白20份、燕窝粉20份、山竹粉20份、鲑鱼鼻软骨粉15份、紫菊花粉15份、虾青素8份、银耳多糖8份、维生素c 8份和浓缩果汁8份。
40.在本发明中，实验证明，含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液的组合物，整体对皮肤含水，保湿及弹性增强优于胶原蛋白肽及透明质酸钠，且添加功能性食品和功能性化合物能明显提升相应的功效，具有协同增强的作用。经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)，说明含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液，添加功能性食品和功能性化合物能明显提升相应的功效，具有
协同增强的作用。
41.在本发明中，所述组合物的制备方法，优选包括以下步骤：将各组分混合即得。
42.基于上述组合物具有改善皮肤水分，减少经皮水分散失和增加皮肤弹性的功效，本发明提供了所述小分子透明质酸钠水解物或所述小分子透明质酸钠组合物在制备改善皮肤老化、敏感的保健食品中的应用。
43.在本发明中，所述保健食品中除了所述组合物作为活性成分外，还包括保健食品领域可接受的辅料。本发明对所述保健食品的形式以及制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的保健食品的种类及制备方案即可。
44.下面结合实施例对本发明提供的一种改善皮肤老化、敏感的小分子透明质酸钠、小分子透明质酸钠组合物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.小分子透明质酸钠的制备方法
47.(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养20h，得到酵母菌液；
48.(b)将所得酵母菌液接种于发酵罐的液体培养基中，菌液与培养基的体积比为1：8，通气量为0.8vvm，搅拌转速为250rpm，培养温度为37℃，发酵时间60h，得到发酵液；
49.(c)分离：将所述发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入80％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；
50.(d)精制：透明质酸钠粗品经80％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；
51.(e)水解：将平均分子量0.1mda～1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为80℃，水解时间分别为10h、12h和15h；
52.(f)加热：将水解液加热至沸腾，持续45min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。测定所得水解液中透明质酸钠的平均分子量。
53.制备得到的小分子透明质酸钠的平均分子量分布在80kda～100kda之间。
54.实施例2
55.按照实施例1的方法制备小分子透明质酸钠水解液，区别仅在于将水解时间分别设置在8h和9h。按照实施例1的方法测定水解后的透明质酸钠的平均分子量。结果表明该方法制备的水分子透明质酸钠的平均分子量为200kda～400kda。
56.实施例3
57.按照实施例1的方法制备小分子透明质酸钠水解液，区别仅在于将水解时间分别设置在5h和7h。按照实施例1的方法测定水解后的透明质酸钠的平均分子量。结果表明该方法制备的水分子透明质酸钠的平均分子量为500kda～800kda。
58.实施例4
59.不同分子量透明质酸钠水解液对皮肤改善水分的影响
60.不同分子量透明质酸钠在化妆品中的保湿功效来看，分子量高的透明质酸钠具有更好的防止皮肤水分流失的功效。但口服不同分子量的透明质酸钠对皮肤改善水分的影响进行试验考察。
61.1.1实验器材
62.实验仪器：shp88皮肤分析仪：德国courage+khazaka公司；
63.实验样品：透明质酸钠水解液为实施例1～3制备得到的80～100kda、200kda～400kda、500kda～800kda三组不同分子量透明质酸钠水解液和0.1～1mda透明质酸钠，对照组为汤臣倍健透明质酸钠果味饮品，空白组为水。
64.1.2受试对象
65.根据《保健食品检验与评价技术规范》2003版中改善皮肤水分功能检验方法的相关规定，按自愿原则选择女性受试者，年龄30岁～50岁，皮肤水分≤12。受试者排除标准：
①
妊娠或哺乳期妇女，过敏体质者；
②
合并有心脑血管、肝、肾、造血系统性疾病和精神病患者；
③
短期内服用与试验样品有关的物品，影响到对结果的判断者；
④
未按试验要求服用样品或中途脱离，无法判定功效或资料不全影响疗效或安全性判断者。
66.1.3实验分组
67.符合纳入标准的150名女性志愿者，随机分为空白组、阳性对照组、80kda～100kda组、200kda～400kda、500kda～800kda 3组，每组各30名。80kda～100kda组、200kda～400kda、500kda～800kda组、阳性对照组、空白组一般资料差异无统计学意义，见表1。
68.表1试验人员年龄、皮肤水分均衡性检验
[0069][0070]
1.4实验方法
[0071]
试验组口服80kda～100kda组、200kda～400kda、500kda～800kda 3组，每组每日1次，每日95mg，共45d；空白对照组服用等量纯净水；阳性对照组口服汤臣倍健透明质酸钠果味饮品，每日1次，每日1瓶，1瓶含透明质酸钠95mg，共45d；受试者在试验期间停止使用与试验目的有关的药物、保健食品及化妆品。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。
[0072]
1.5安全性指标观测
[0073]
因本产品原料为食物来源，大量服用不会对身体造成影响，不考虑一般症状，包括
①
精神、睡眠、饮食、大小便等情况；
②
血、尿、便常规检查；
③
肝、肾功能检查；
④
心电图、腹部b超、x线胸透检查(在试验开始时检查一次)等指标检查。
[0074]
1.6功效性指标观测
[0075]
皮肤水分含量测定，测定部位为前额眉间皮肤。所有受试者在测前30min进入测试环境中安静待测。在安静状态下用洁净棉球蘸蒸馏水清洁被测部位，擦干后15min进行水分的测定，试验前后测定工作由同一台仪器、同一个人操作。
[0076]
1.7统计方法
[0077]
受试者采用自身和组间两种对照设计。自身对照采用配对t检验，组间对照采用成
组t检验。数据统计采用spss统计软件处理。
[0078]
2.实验结果与分析
[0079]
2.1水分测定结果
[0080]
表2水分测试结果
[0081][0082]
注：*为与试验前比较(p《0.01)；
△
为与空白组试验后比较(p《0.01)；
□
为与对照组试验后比较(p《0.05)。
[0083]
由表2可知，45天后，试验组80kda～100kda、200kda～400kda、500kda～800kda，阳性对照组试验前后以及与空白组组间比较，皮肤水分均有显著性差异(p《0.01)。80kda～100kda试验组皮肤含水量的平均值由试验前的8.33
±
1.09提高到11.944
±
1.44。阳性对照组皮肤含水量的平均值由试验前的8.42
±
1.11提高到10.34
±
1.67；80kda～100kda、200kda～400kda、500kda～800kda等试验组试验前后与阳性对照组间比较，皮肤水分有差异(p《0.05)。由此说明，本发明具有改善皮肤水分功能，且产品效果优于市售同类产品。不同分子量组间进行比较，80kda～100kda一组试验前后批复水分要比200kda～400kda、500kda～800kda组有明显提升，提示分子量越低对皮肤水分改善效果越好。
[0084]
可见，透明质酸钠水解液对皮肤改善水分有一定功效，且分子量越低对皮肤水分改善效果越好。
[0085]
实施例5
[0086]
1.胶原蛋白肽水解液的制备方法，具体如下：
[0087]
(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；
[0088]
(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.4mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡16h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：3；
[0089]
(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的1.0
‰
，酶解温度控制在60℃，酶解时间在3h，溶液ph值控制在6.0；
[0090]
(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到80℃，维持45min；
[0091]
(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；
[0092]
(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.8mpa，当质量浓度在45％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用。
[0093]
2.胶原蛋白肽水解液中蛋白肽的测定
[0094]
采用常规方法测定蛋白肽的氨基酸组成。经测定蛋白肽为三肽，具体序列是gly-pro-hyp，分子量范围在200～400da。
[0095]
采用高效液相法测定胶原蛋白肽的含量，具体如下：
[0096]
面积归一化进行计算；
[0097]
色谱柱：venusicasb-c18(250mm x 4.6mm，5um)；柱温：40℃；
[0098]
流动相：梯度洗脱(0-20min：乙睛(0.1％三氟乙酸)a：纯水(含0.1％三氟乙酸)b：98％-78％；
[0099]
20.1-25min：乙睛(0.1％三氟乙酸)a：100％，纯水(0.1％三氟乙酸)b：0％；25.1-35min：乙睛(0.1％三氟乙酸)a：2％，纯水(0.1％三氟乙酸)b：98％)；
[0100]
流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；进样量50μl。
[0101]
结果见图1。胶原蛋白肽水解液中含有胶原蛋白三肽含量为8％。
[0102]
实施例6
[0103]
不同含量胶原三肽的胶原蛋白水解液对皮肤改善水分的影响
[0104]
不同含量胶原三肽对皮肤改善水分的影响进行试验考察。
[0105]
实验仪器及实验方法同实施例1.
[0106]
实验样品：用实施例3制备的胶原蛋白肽水解液为基础进行稀释，得到8％胶原三肽、12％胶原三肽、15％胶原三肽三组不同含量的胶原蛋白肽水解液以及胶原蛋白，阳性对照组为汤臣倍胶原蛋白果味饮品，空白组为水。
[0107]
2.实验结果与分析
[0108]
2.1水分测定结果
[0109]
表3水分测试结果
[0110][0111]
注：*为与试验前比较(p《0.01)；
△
为与空白组试验后比较(p《0.01)；
□
为与对照组试验后比较(p《0.05)。
[0112]
由表3可知，45天后，试验组，阳性对照组试验前后以及与空白组组间比较，皮肤水分均有显著性差异(p《0.01)。试验组皮肤含水量的平均值由试验前的8.35
±
1.08提高到12.24
±
1.25。阳性对照组皮肤含水量的平均值由试验前的8.42
±
1.06提高到10.34
±
1.67；试验组试验前后与阳性对照组间比较，皮肤水分有差异(p《0.05)。由此说明，本发明
具有改善皮肤水分功能，且产品效果优于市售同类产品。
[0113]
胶原蛋白水解液对皮肤改善水分有一定功效，且胶原蛋白三肽含量越高，对皮肤水分改善效果越好。
[0114]
实施例7
[0115]
透明质酸钠组合物按重量份数计：胶原蛋白肽水解液60g，小分子透明质酸钠水解液60g，弹性蛋白40g，燕窝粉40g，山竹粉30g，鲑鱼鼻软骨粉20g，紫菊花粉20g，虾青素10g，银耳多糖10g，维生素c 10g，浓缩果汁8g。
[0116]
胶原蛋白肽水解液的制备工艺为：(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.5mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡18h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：3；(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的0.8
‰
，酶解温度控制在60℃，酶解时间在4h，溶液ph值控制在6.5；(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到90℃，维持60min；(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.5mpa，当质量浓度在50％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用；
[0117]
小分子透明质酸钠水解液的制备工艺为：(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养24h，然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种量为1：8，通气量为1.0vvm，搅拌转速为300rpm，培养温度为37℃，发酵时间50h；(d)分离：发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入85％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；(e)精制：透明质酸钠粗品经85％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；(f)水解：分子量0.1mda-1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为80℃，水解时间为15h；(g)加热：将水解液加热至沸腾，持续40min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。
[0118]
实施例8
[0119]
透明质酸钠组合物按重量份数计：胶原蛋白肽水解液50g，小分子透明质酸钠水解液50g，弹性蛋白35g，燕窝粉35g，山竹粉25g，鲑鱼鼻软骨粉15g，紫菊花粉15g，虾青素8g，银耳多糖8g，维生素c 8g，浓缩果汁8g。
[0120]
胶原蛋白肽水解液的制备工艺为：(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.4mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡16h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：3；(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的1.0
‰
，酶解温度控制在60℃，酶解时间在3h，溶液ph值控制在6.0；(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到80℃，维持45min；(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.8mpa，当质量浓度在45％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用；
[0121]
小分子透明质酸钠水解液的制备工艺为：(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养20h，然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种量为1：8，通气量为0.8vvm，搅拌转速为250rpm，培养温度为37℃，发酵时间60h；(d)分离：发酵液经300
目活性炭吸附处理后，加入80％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；(e)精制：透明质酸钠粗品经80％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；(f)水解：分子量0.1mda-1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为80℃，水解时间为12h；(g)加热：将水解液加热至沸腾，持续45min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。
[0122]
实施例9
[0123]
透明质酸钠组合物按重量份数计：胶原蛋白肽水解液45g，小分子透明质酸钠水解液45g，弹性蛋白30g，燕窝粉30g，山竹粉20g，鲑鱼鼻软骨粉15g，紫菊花粉15g，虾青素5g，银耳多糖5g，维生素c 5g，浓缩果汁8g。
[0124]
胶原蛋白肽水解液的制备工艺为：(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.3mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡14h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：2；(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，菠萝蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的0.5
‰
，酶解温度控制在50℃，酶解时间在3h，溶液ph值控制在5.5；(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到80℃，维持45min；(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.6mpa，当质量浓度在50％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用；
[0125]
小分子透明质酸钠水解液的制备工艺为：(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养18h，然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种量为1：8，通气量为0.6vvm，搅拌转速为250rpm，培养温度为37℃，发酵时间55h；(d)分离：发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入75％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；(e)精制：透明质酸钠粗品经75％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；(f)水解：分子量0.1mda-1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为75℃，水解时间为10h；(g)加热：将水解液加热至沸腾，持续40min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。
[0126]
实施例10
[0127]
透明质酸钠组合物按重量份数计：胶原蛋白肽水解液40g，小分子透明质酸钠水解液40g，弹性蛋白25g，燕窝粉25g，山竹粉15g，鲑鱼鼻软骨粉10g，紫菊花粉10g，虾青素5g，银耳多糖5g，维生素c 5g，浓缩果汁5g。
[0128]
胶原蛋白肽水解液的制备工艺为：(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.25mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡12h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：2；(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，菠萝蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的0.5
‰
，酶解温度控制在50℃，酶解时间在2.5h，溶液ph值控制在5.0；(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到75℃，维持40min；(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.5mpa，当质量浓度在45％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用；
[0129]
小分子透明质酸钠水解液的制备工艺为：(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养16h，然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种量为1：8，通
气量为0.5vvm，搅拌转速为200rpm，培养温度为37℃，发酵时间50h；(d)分离：发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入70％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；(e)精制：透明质酸钠粗品经70％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；(f)水解：分子量0.1mda-1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为70℃，水解时间为10h；(g)加热：将水解液加热至沸腾，持续35min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。
[0130]
实施例11
[0131]
透明质酸钠组合物按重量份数计：胶原蛋白肽水解液35g，小分子透明质酸钠水解液35g，弹性蛋白20g，燕窝粉20g，山竹粉15g，鲑鱼鼻软骨粉15g，紫菊花粉12g，虾青素10g，银耳多糖8g，维生素c10g，浓缩果汁10g。
[0132]
胶原蛋白肽水解液的制备工艺为：(a)破碎：将新鲜鳕鱼鱼皮放入破碎机中进行破碎；(b)清洗：将破碎的鳕鱼鱼皮放入清洗池中，用0.2mol/l naoh溶液进行清洗并浸泡12h，然后用清水洗至中性，加入纯化水，配制成料液比为1：2；(c)酶解：采用复合水解酶进行酶解，复合水解酶为酸性蛋白酶，中性蛋白酶，菠萝蛋白酶，添加量为鳕鱼皮质量的0.7
‰
，酶解温度控制在45℃，酶解时间在2h，溶液ph值控制在4.5；(d)灭酶：酶解后，将酶解罐的温度升高到70℃，维持60min；(e)分离精制：将灭酶后的料液从酶解罐中放出，经过板框过滤器进行一次过滤，再经过膜过滤进行二次过滤，通过纳滤膜除盐，得到精制鳕鱼鱼皮水解液；(f)浓缩：鳕鱼皮水解液通过负压浓缩器，控制真空度在0.5mpa，当质量浓度在40％，停止浓缩将胶原蛋白肽浓缩液用泵输送到中间储罐备用；
[0133]
小分子透明质酸钠水解液的制备工艺为：(a)发酵：以酵母菌为菌种，先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养14h，然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种量为1：8，通气量为0.8vvm，搅拌转速为180rpm，培养温度为37℃，发酵时间45h；(d)分离：发酵液经300目活性炭吸附处理后，加入70％乙醇沉淀，过滤得到透明质酸钠粗品；(e)精制：透明质酸钠粗品经70％乙醇洗涤，加热干燥得到99％透明质酸钠；(f)水解：分子量0.1mda-1.0mda透明质酸钠固体在0.2％双氧水中进行水解，水解温度为65℃，水解时间为10h；(g)加热：将水解液加热至沸腾，持续30min后，冷却至室温用泵输送到中间储罐备用。
[0134]
实施例12
[0135]
1.试验设计
[0136]
30名符合条件的志愿者参加测试，在6周的测试周期中，志愿者每日早晚各饮用实施例7，阳性对照组为汤臣倍胶原蛋白果味饮品，空白组为水。连续饮用6周，在测试期间其它的护肤产品维持不变。在样品使用前(初始值)、使用2周、4周、6周后，对志愿者面颊处进行皮肤水分含量、经皮水分散失、皮肤弹性测试，通过使用前后对比，评价样品的功效，并在使用2周、4周、6周后，志愿者以回答调查问卷的形式自我评估皮肤的改善情况。
[0137]
皮肤水分含量测试
[0138]
皮肤水分含量测试仪(cm 825，courage and khazaka，德国)基于电容的原理进行皮肤水分含量测试。常温下，水的介电常数是81，角质层中其他物质的介电常数通常小于7，水是皮肤上介电常数最大的物质。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值分析皮肤表面的相对含水量。
[0139]
经皮水分散失tewl测试
[0140]
皮肤水分散失测试仪aqua flux(af200，biox，英国)通过在封闭式冷凝腔体中收
集皮肤扩散的水蒸气进行测试的。水蒸气扩散，在-7.65℃的冷凝板上结成冰。在测试腔体中靠近皮肤的部位空气湿度高，靠近冷凝器板的部位空气湿度低，两者的湿度差使得水汽以被动扩散的方式从皮肤表面往冷凝器移动，通过测量该湿度梯度可以计算该测试区域的水蒸气流量密度。仪器内使用单硅晶芯片作为水蒸气温度和湿度的传感器，测量水蒸气的流量密度，进而测定皮肤水分散失量。
[0141]
皮肤弹性测试
[0142]
皮肤弹性测试仪(mpa580，courage and khazaka，德国)基于吸力和拉伸原理测试皮肤弹性，测试时在皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进探头内，通过非接触式的光学测试系统测量皮肤被吸进去的深度，从而评价皮肤的弹性。
[0143]
测试环境：温度：20～22℃，湿度：40～60％。
[0144]
1.2志愿者筛选减少
[0145]
志愿者入选标准
[0146]
符合下列所有条件的志愿者将入选：
[0147]
1)年龄30～40岁的志愿者；
[0148]
2)经乳酸刺痛试验验证为敏感皮肤者；
[0149]
3)测试时志愿者身体健康；
[0150]
4)自愿参加并签署知情同意书；
[0151]
5)能按测试方案要求完成规定内容者。
[0152]
志愿者排除标准
[0153]
符合下列任一项者将被排除：
[0154]
1)计划怀孕或妊娠或哺乳期以及产后六个月内的妇女；2)患有严重系统疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；3)患有过敏性疾病或最近1-2年有过化妆品过敏者；4)测试区域患有皮肤科疾病或正在接受药物治疗者；5)皮肤科大夫认为不适合参加者；6)现在或最近一月受试部位参加其它测试者；7)面部有伤口，磨损，纹身，痤疮，丘疹，红斑或其他影响试验结果判定的志愿者；8)测试期间计划外出去海边、草原日晒强的地区或进行高强度日晒户外运动者。
[0155]
1.3数据分析
[0156]
仪器测量数据和图像分析数据，包括皮肤水分含量、经皮水分散失、皮肤弹性，应用spss statistics 20进行分析，双尾检验，检验水平α＝0.05。
[0157]
表4各样品对皮肤水分含量、经皮水分散失及皮肤弹性影响
[0158][0159]
注：*为与与空白组试验(p《0.05)；
△
为对照组比较(p《0.05)。
[0160]
由表4可知，与空白组相比，试验组和阳性对照组第2周、4周、6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)；与阳性对照组相比，试验组第2周，4周，6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)。说明本品具有改善皮肤水分，减少经皮水分散失。同时，还会增加皮肤弹性。
[0161]
实施例13
[0162]
考察胶原蛋白肽，含有胶原三肽的胶原蛋白肽水解液，透明质酸钠，小分子透明质酸钠水解液等组合，与功能性化合物及功能性食品搭配对皮肤水分含量，经皮经皮水分散失及皮肤弹性影响，组方及测试结果如下：
[0163]
表5制备组方明细
[0164][0165]
表6各样品对皮肤水分含量、经皮水分散失及皮肤弹性影响
[0166][0167]
注：*为与与对照组试验(p《0.05)。
[0168]
由表6可知，与对照组相比，组方1～组方4第2周，4周，6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)；与组方2相比，组方3，组方4第2周，4周，6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)。说明含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液，整体对皮肤含水，保湿及弹性增强优于胶原蛋白肽及透明质酸钠，且添加功能性食品和功能性化合物能明显提升相应的功效，具有协同增强的作用。与组方3相比，组方4第2周，4周，6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)，说明含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液，添加功能性食品和功能性化合物能明显提升相应的功效，具有协同增强的作用。
[0169]
实施例14
[0170]
考察胶原蛋白肽，含有胶原三肽的胶原蛋白肽水解液，透明质酸钠，小分子透明质酸钠水解液等组合对皮肤水分含量，经皮水分散失及皮肤弹性影响，组方及测试结果如下：
[0171]
表7制备组方明细
[0172][0173]
表8各样品对皮肤水分含量、经皮水分散失及皮肤弹性影响
[0174][0175][0176]
注：*为与与对照组试验(p《0.05)。
[0177]
由表8可知，与对照组相比，组方1-组方4第2周，4周，6周的皮肤水分含量测试，经皮水分散失测试以及皮肤弹性测试整体有一定差异性(p《0.05)；从组方1-组方4来看，含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液，整体对皮肤含水，保湿及弹性增强优于胶原蛋白肽及透明质酸钠，且含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液整体协同作用要优于胶原蛋白肽和透明质酸钠的协同作用。组方3和组方4对比来
看，含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液搭配燕窝粉、紫菊花粉、虾青素、银耳多糖、鲑鱼鼻软骨粉协同作用整体效果要优于含胶原三肽的胶原蛋白肽水解液和小分子透明质酸钠水解液。
[0178]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。