含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料或药物的制作方法

1.本技术属于201811085468.x的分案申请。
2.本发明属于两个六元碳环稠和的含有氧原子作为仅有的杂环原子的杂环化合物技术领域，具体涉及一种含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料或药物。


背景技术：

3.以猪肉为例，我国是世界上最大的生猪养殖和猪肉消费国，作为一种非常重要的经济动物，猪的遗传改良对于我国肉类产业的发展及人们的日常生活都有着非常重要的意义（“猪的骨骼肌生长发育研究进展”，赵晓等，生命科学，2011年第23卷第1期，第36-44页，公开日2011年01月31日）。然而，在过去的几十年中，长期以提高瘦肉率以及生长效率为目标的育种使许多畜禽的肉质品质严重下降，这不仅难以满足我国消费者日益增长的对猪肉质品质的要求，而且降低了肉质产品在国际上的竞争力，制约了我国畜牧业的可持续发展（“影响畜禽肉质的主要因素及其作用机制”，宋代军等，西南大学学报(自然科学版)，2014年第11期，第26-33页，公开日2014年11月26日）。
4.肉质是指与鲜肉或加工肉的外观和适口性有关的一些特性，包括肉的色泽、肉质结构、硬度、大理石纹和肌肉系水力等，而消费者在肉品质方面还讲究适口性，包括肉的嫩度、风味和多汁性等。通常所说的肉品质指肉的消费品质，主要性状为肉品的系水力、色泽和大理石纹以及肉中的脂肪酸、氨基酸组成和肉的风味特征等（“中草药提高猪肉品质研究进展”，刘瑞生，养猪，2014年第5期，第31-34页，公开日2014年12月31日）。
5.肌纤维是组成肉质的基本单位，肌纤维的组成和分布影响了肌肉的生产性能和质量，肌纤维的生长发育是影响肉品质性状方面的重要因素（“myoz1基因在肌纤维发育功能中的初步研究”，赵春丽，华中农业大学，2011年，第1-5页，公开日2011年12月31日）。因此，骨骼肌生长发育机制一直以来都是动物遗传学研究的热点。
6.肌肉细胞主要来自轴旁中胚层和侧中胚层。轴旁中胚层形成以后随即裂为块状细胞团，称体节，所有的骨骼肌都来自体节的生肌节区。骨骼肌细胞的胚胎发育包括以下几个步骤：第一，从中胚层干细胞定向发育为骨骼肌细胞系，发育的标志是能表达早期的肌源性标志-结蛋白（desmin），此时即称为成肌细胞（myoblast）（“重力因素对骨骼肌细胞的影响及其机理研究”，李伟刚，中国农业大学，2007年，第1-3页，公开日2007年12月31日）。脊椎动物的骨骼肌细胞是一种经过复杂的分化过程形成的具有收缩功能的多核细胞。在动物胚胎发育的过程中，来自中胚层的祖细胞首先进行增殖，随后退出细胞周期在生肌调节因子（myogenic regulatory factors, mrfs）的驱动下分化、融合成肌管，最终形成肌纤维（即成熟的骨骼肌细胞）。肌纤维经特殊染色可见到横纹。
7.根据肌肉色泽，可将骨骼肌纤维分为红肌和白肌。根据收缩速度，可将肌纤维分为慢肌、快肌a和快肌b（“关于骨骼肌纤维类型的研究”，缑奇锋，体育世界，2014年第6期，第134-135页，公开日2014年06月30日）。利用抗体和mrna原位杂交的方法，依据肌球蛋白重链（muscle heavy chains，myhc）的不同，可将骨骼肌纤维分为以下四种类型：慢速氧化型肌
30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射。
16.在本发明中，含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料，且染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射。用于畜产品养殖中，能够进一步提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
17.本发明的目的之二在于保护用于提高肌肉耐力或改善畜禽肉质品质的药物，含有染料木素。
18.发明人发现，含有染料木素的药物，能够提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
19.进一步，染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射。
20.在本发明中，染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射的药物，能够进一步提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
21.本发明的目的之三在于保护含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料在提高肌肉耐力或改善畜禽肉质品质中的应用。
22.发明人发现，含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料，能够提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
23.进一步，含有染料木素的畜禽饲料添加剂中染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射。
24.在本发明中，染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射，的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料。用于畜产品养殖中，能够进一步提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
25.本发明的目的之四在于保护含有染料木素的药物在提高肌肉耐力或改善畜禽肉质品质中的应用。
26.发明人发现，含有染料木素的药物，能够提高肌肉耐力或改善畜禽肉质品质中。
27.进一步，其中所述染料木素单独作为活性成分，或者，所述染料木素与额外的药物活性化合物联合应用。
28.进一步，染料木素的用量为：每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射。
29.在本发明中，每kg畜禽饲料中添加染料木素20-60mg，或按照10-30mg/kg体重灌胃或按照5-15mg/kg体重注射，的药物能够进一步提高肌肉耐力，改善畜禽肉质品质。
30.本发明的目的之五在于保护含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料在调节畜禽快肌和慢肌中肌球蛋白重链肌纤维各亚型的mrna的表达量和肌球蛋白重链肌纤维各亚型所占比例中的应用。
31.发明人发现，含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料能够调畜禽快肌和慢肌中肌球蛋白重链肌纤维各亚型的mrna的表达量和肌球蛋白重链肌纤维各亚型所占比例中的应用，从而改善畜禽肉质品质。
32.本发明的目的还在于保护含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料在调节畜禽快肌和慢肌中肌钙蛋白家族不同成员的mrna表达量中的应用。
33.发明人发现，含有染料木素的畜禽饲料添加剂或畜禽饲料能够调节畜禽快肌和慢
肌中肌钙蛋白家族不同成员的mrna表达量，从而改善畜禽肉质品质。
34.本发明的有益效果在于：本发明的饲料添加剂或饲料或药物，能够改善畜禽肉质品质。
35.本发明的饲料添加剂或饲料或药物，能够提高畜禽运动耐力。
附图说明
36.图1为染料木素对c2c12成肌细胞myhc各亚型及不同肌钙蛋白（tn）类型表达的影响，其中，0为对照组，10为实验组，“*”表示p＜0.05，差异显著；图1a为c2c12细胞诱导分化期处理染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0
µ
mol/l ；gen为实验组：染料木素浓度为10
µ
mol/l）96h，myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图1b为myhc各亚型所占的比例测试结果图，图1c为肌钙蛋白（troponin, tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图，图1d为c2c12细胞分化图；图2为染料木素对小鼠耐力和肌肉肉色的影响图，其中，nc为对照组，gen为实验组，图2a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠游泳运动力竭时间，平行测定12次，“*”表示p＜0.05，差异显著；图2b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠腿部肌肉颜色变化直观图；图2c为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠腿部肌肉色差值（l为亮度；a为红度；b为黄度），平行测试6次，“*”表示p＜0.05，差异显著；图3为染料木素对小鼠胫骨前肌的影响测试结果图，“*”表示p＜0.05，差异显著，nc为对照组，gen为实验组，图3a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠胫骨前肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图3b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠胫骨前肌myhc各亚型所占比例测试结果图，图3c为饲喂染料木素（nc为对照组）四周后检测小鼠胫骨前肌肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图；图3d为小鼠胫骨前肌atp酶染色切片图；图4为染料木素对小鼠比目鱼肌的影响测试结果图，平行测试6次，“*”表示p＜0.05，差异显著，nc为对照组，gen为实验组，图4a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠比目鱼肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图4b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠比目鱼肌myhc各亚型所占比例测试结果图，图4c为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠比目鱼肌肌钙蛋白（troponin, tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图，图4d为小鼠比目鱼肌atp酶染色切片图。
具体实施方式
37.所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述

技术实现要素：
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
38.以下染料木素购自天津士兰科技有限公司，纯度为98%。
39.实施例1体外试验（1）染料木素（纯度98%，质量纯度），溶解于二甲基亚砜（dmso）配制成浓度为以1mmol/l浓度的母液，于-20℃温度下贮存，留待细胞备用。
40.（2）c2c12细胞（来自干细胞库，中国科学院），于37℃，5% co2（体积百分比）条件下置于细胞培养箱中进行培养。使用改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle's medium ，简称dmem，gibco，usa)辅以10%胎牛血清（体积百分比）配成生长培养基（gm）维持细胞增殖。
41.（3）在分化实验中c2c12细胞达到80%融合时，换成含2%马血清（gibco，体积百分比）的分化培养基（dm），进行分化培养。在细胞密度70%左右时进行消化传代，并均匀铺在12孔板中在细胞达到80%融合度时，使用分化液将染料木素母液稀释成10
µ
mol/l的浓度处理细胞（实验组），同时，设置对照组（对照组使用染料木素母液浓度为0
µ
mol/l的分化液处理细胞），4小时后换成正常分化培养基，每24h换液并处理一次，分化培养96h。使用pbs清新3次c2c12细胞，每孔加入1ml trizo试剂进行充分裂解。检测myhc各亚型mrna水平的相对表达量、myhc各亚型所占的比例和肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量。
42.其中，myhc各亚型mrna水平的相对表达量的检测方法为：实时荧光定量pcr，引物序列为：myhc i（上游扩增引物: gcctgggcttacctctctatcac；下游扩增引物: cttctcagacttccgcaggaa），myhc iia（上游扩增引物: cagctgcaccttctcgtttg；下游扩增引物: cccgaaaacggccatct），myhc iib（上游扩增引物: caatcaggaaccttcggaacac；下游扩增引物gtcctggcctctgagagcat） ，myhc iix（上游扩增引物: ggacccacggtcgaagttg；下游扩增引物: cccgaaaacggccatct），β-actin（上游扩增引物: tggaatcctgtggcatccatgaaac；下游扩增引物: taaaacgcagctcag taacagtccg）；myhc各亚型所占的比例为：某亚型相对表达量比上全部4种亚型之和再乘以100%；肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量的检测方法为：实时荧光定量pcr，引物序列为：tnni1（上游扩增引物: atgccggaagttgagaggaaa；下游扩增引物：tccgagaggtaacgcacctt），tnni2（上游扩增引物:gcacctgaagagtgtgatgct；下游扩增引物：tctccttctcagattctcggc），tnnc1（上游扩增引物：gcggtagaacagttgacagag；下游扩增引物：ccagctccttggtgctgat），tnnc2（上游扩增引物：gaggccaggtcctacctcag；下游扩增引物：
ggtgcccaactctttaacgct）；（4）对测试结果进行统计分析，以上试验平行测定3次，数据采用“平均值
±
标准差”形式表示，使用spss 20.0软件对不同组间数据进行单因素方差分析，采用t检验法检验显著性水平。
43.结果如图1所示，其中，0为对照组，10为实验组，“*”表示p＜0.05，差异显著；图1a为c2c12细胞诱导分化期处理染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）96h，myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图1b为myhc各亚型所占的比例测试结果图，图1c为肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图，图1d为c2c12细胞分化图。
44.由图1可知，与对照组相比，实验组可显著（p＜0.05）促进成肌细胞myhc i型、myhc iia型和myhc iix型肌纤维的表达，显著（p＜0.05）促进tnnc1、tnni1和tnnc2表达；同时myhc iia型和myhc iix型肌纤维所占比例增加，而myhc i型和myhc iib型肌纤维所占比例减少。而myhcⅰ型肌纤维所占比例与肌内脂肪呈负相关关系，而肌内脂肪含量又与肌肉嫩度、多汁性和风味等密切相关。myhcⅱb型肌纤维所占比例与肌肉嫩度呈负相关关系（“myoz1基因在肌纤维发育功能中的初步研究”，赵春丽，华中农业大学，2011年，第9-10页，公开日2011年12月31日）。由此证明，染料木素能够改善畜禽肉质品质。
45.实施例2体内实验（1）染料木素分别以0mg/kg（对照组），50mg/kg（实验组）的浓度逐级稀释拌入粉碎小鼠饲料（小鼠维持日粮，购于成都达硕实验动物有限公司）中再挤压成型在60℃烘箱中烘干，留待备用。
46.（2）选取8周龄健康icr雌性小鼠24只，随机分为对照组和实验组，每组12只，对照组和实验组小鼠分别饲喂0mg/kg和50mg/kg染料木素饲料4周，利用游泳运动实验（水深60cm，水温30
±
2℃）评估小鼠耐力，色差仪（型号 cr-300，minota，日本）进行小鼠游泳运动力竭时间、小鼠腿部肌肉颜色变化和小鼠腿部肌肉色差值检测。
47.其中，小鼠游泳运动力竭时间的检测方法：从小鼠入水开始计时，到小鼠无力游动后沉入水中8秒不能上浮停止计时，同时捞出小鼠；小鼠腿部肌肉色差值的检测方法为：将小鼠处死后，从背部剖开鼠皮露出后肢部分，使用色差仪（型号 cr-300，minota，日本）对腿部肌肉进行色差检测并读值记录。
48.（3）所有数据采用“平均值
±
标准差”形式表示，使用spss 20.0软件对不同组间数据进行单因素方差分析，采用t检验法检验显著性水平。
49.结果如图2所示，其中，nc为对照组，gen为实验组，图2a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠游泳运动力竭时间，平行测定12次，“*”表示p＜0.05，差异显著；图2b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠腿部肌肉颜色变化直观图；图2c为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠腿部肌肉色差值（l为亮度；a为红度；b为黄度）。平行测试6次，“*”表示p＜0.05，差异显著。
50.由图2可知，与对照组相比，实验组能够显著（p＜0.05）延长小鼠的游泳时间，显著
（p＜0.05）降低肌肉亮度（l值）；同时，显著（p＜0.05）促进肌肉红度（a值），对黄度（b值）无显著影响。由此证明，饲料中添加50mg/kg染料木素能够改善肉质品质，显著提高小鼠的运动耐力。
51.（6）同时，采取胫骨前肌（快肌）和比目鱼肌（慢肌）在trizo中充分裂解，采用trizo法按照说明书提取总rna。检测4周后小鼠胫骨前肌和比目鱼肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量，胫骨前肌和比目鱼肌myhc各亚型所占比例，胫骨前肌和比目鱼肌肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量，并分别对胫骨前肌atp酶和比目鱼肌进行atp酶染色切片；其中，胫骨前肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量的检测方法为：实时荧光定量pcr，引物序列同实施例1；比目鱼肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量的检测方法同实施例1；胫骨前肌myhc各亚型所占比例的检测方法为：某亚型相对表达量比上全部4种亚型之和再乘以100%；比目鱼肌myhc各亚型所占比例的检测方法同实施例1；胫骨前肌肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量的检测方法为实时荧光定量pcr，引物序列同实施例1：；比目鱼肌肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量的检测方法同实施例1；对胫骨前肌atp酶染色切片的方法为：取小鼠胫骨前肌先异戊烷预处理，随后放入-80℃保存，切片时从-80℃冰箱取出与冰冻切片机内在-20℃切片，制备好切片atp酶染色，并脱水后封固，然后使用普通显微镜（型号te2000 ，nikon, 日本）拍照保存，照片分析及肌纤维计数（慢肌黑色，快肌灰白色）使用image-pro plus 6.0软件进行处理；比目鱼肌atp酶染色切片的方法同实施例1；除染色切片外，以上数据平行测试6次，所有数据采用“平均值
±
标准差”形式表示，使用spss 20.0软件对不同组间数据进行单因素方差分析，采用t检验法检验显著性水平。
52.结果如图3-4所示，其中，图3为染料木素对小鼠胫骨前肌的影响测试结果图，“*”表示p＜0.05，差异显著，nc为对照组，gen为实验组，图3a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠胫骨前肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图3b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠胫骨前肌myhc各亚型所占比例测试结果图，图3c为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠胫骨前肌肌钙蛋白（troponin，tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图；图3d为小鼠胫骨前肌atp酶染色切片图。
53.由图3可知，与对照组相比，实验组可显著（p＜0.05）促进胫骨前肌myhc i型、myhc iia型、myhc iix型以及慢肌肌钙蛋白tnnc1和tnni1的表达，对myhc iib型以及快肌肌钙蛋白tnnc2和tnni2的表达无显著影响；同时，myhc i型、myhc iia型和myhc iix型所占比例均增加，而myhc iib型所占比例减少，整体上慢肌纤维（myhc i型和myhc iia型总和）所占比例增加；同时，atp酶染色结果显示，实验组深染肌纤维（慢肌纤维）比例为25.64%
±
9.16%，
而对照组深染肌纤维（慢肌纤维）比例为18.71%
±
4.92%。由此证明，染料木素在小鼠胫骨前肌中可促进慢肌纤维的增加；同时，染料木素不影响快肌中快肌纤维的表达，而慢肌纤维比例增加有助于提升胫骨前肌耐力，增加肌肉抗疲劳性。
54.图4为染料木素对小鼠比目鱼肌的影响测试结果图，平行测试6次，“*”表示p＜0.05，差异显著，nc为对照组，gen为实验组，图4a为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠比目鱼肌myhc各亚型mrna水平的相对表达量测试结果图，图4b为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后小鼠比目鱼肌myhc各亚型所占比例测试结果图，图4c为饲喂染料木素（nc为对照组：染料木素浓度为0mg/kg；gen为实验组：染料木素浓度为50 mg/kg）四周后检测小鼠比目鱼肌肌钙蛋白（troponin, tn）家族不同成员mrna水平的相对表达量测试结果图，图4d为小鼠比目鱼肌atp酶染色切片图。
55.由图4可知，与对照组相比，实验组可显著（p＜0.05）促进比目鱼肌myhc i型、myhc iib型以及慢肌肌钙蛋白tnnc1和tnni1的表达，显著（p＜0.05）抑制myhc iix型的表达，对myhc iia型以及快肌肌钙蛋白tnnc2和tnni2的表达无显著影响；同时，myhc i型和myhc iib型纤维所占比例均增加，而myhc iia型和myhc iix型所占比例减少，但整体上慢肌纤维所占比例增加；同时，atp酶染色结果显示，实验组深染肌纤维（慢肌纤维）比例为47.82%
±
6.87%，而对照组深染肌纤维（慢肌纤维）比例为38.34%
±
8.22%。由此证明，染料木素在小鼠比目鱼肌中可促进慢肌纤维的增加，慢肌纤维比例的增加进一步提升了比目鱼肌的耐力，增加肌肉抗疲劳性。
56.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。