黄梁木叶黄酮提取物及其在制备柱花草青贮饲料中的应用

1.本发明涉及饲料加工技术领域，具体地，涉及一种黄梁木叶黄酮提取物及其在制备柱花草青贮饲料中的应用。


背景技术：

2.随着经济水平和生产水平的提高，畜牧行业走向规模化和产业化。但是，饲料资源的短缺严重制约着畜牧业的发展。面对人民日益增长的对肉、蛋、奶类动物产品的需求与饲料短缺之间的矛盾，拓展饲料资源，降低饲料在贮藏和运输过程中的损耗，提高饲料转化率是促进畜牧业可持续发展的重要举措。
3.柱花草(stylosanthesguianensis)又名巴西苜蓿、热带苜蓿、斯太罗，是一种生长在热带和亚热带的生长旺盛，产量高，适应性强，营养丰富的优质牧草，广泛种植于我国南方。与苜蓿形成了“北苜蓿，南柱花草”的牧草格局。柱花草的刈割是季节性的，普遍收割于夏季。但是在南方夏季气候高温潮湿且多雨极不利于牧草的贮藏和保存。因此，合理贮存方式是提高牧草保存品质的关键。
4.青贮是一种在封闭环境中利用乳酸菌发酵产生乳酸，从而降低封闭环境中的ph值以抑制不良微生物消耗牧草中的有机物质，防止牧草腐败变质，减少牧草营养损失的一种加工储藏方式。青贮饲料具有鲜嫩多汁、易于消化吸收，耐贮藏，克服饲料季节分布不均，实现全年牧草的合理分配等优点，普遍适用于畜牧生产中。
5.研究表明，柱花草在青贮过程中，由于其纤维素含量高、可利用可溶性糖含量较低，并具有较高的缓冲性能，乳酸菌无法快速繁殖并产生足量的乳酸降低青贮过程中的ph值，从而不良微生物大量繁殖，导致不良发酵产生，使青贮腐败变质，造成营养物质的损失。研究表明，在青贮过程中添加青贮添加剂可以有效提高青贮的发酵品质。青贮添加剂主要分为四大类：(1)发酵促进剂；(2)不良发酵抑制剂；(3)抗氧化活性添加剂；(4)营养和吸附剂。随着绿色健康理念的贯彻落实，以及合成类添加剂日益突出的生物安全问题，天然的植物提取物以绿色安全、促进益生菌生长，抑制不良微生物，并且具有提高青贮饲料的抗氧化性，成为了青贮添加剂研发的热门领域。黄梁木又称团花树，许多文献中报道称黄梁木叶富含生物碱、黄酮、萜类以及多酚类等活性物质，具有抗菌、消炎和止泻等作用，在维持动物健康方面具有潜在的利用价值。在现有研究中，黄梁木主要用作饲料原料或是利用其提取物，关于黄梁木叶黄酮类提取物作为青贮添加剂促进青贮发酵却鲜有研究。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的第一个目的在于一种黄梁木叶黄酮类提取物。
7.本发明的第二个目在于提供黄梁木叶黄酮类提取物作为柱花草青贮添加剂在制备柱花草青贮饲料中的应用。相比于传统的青贮添加剂，黄梁木叶黄酮类提取物廉价易得且操作安全简单，有望用作于新型的青贮添加剂的替代品。
8.本发明的第三个目的是提供一种柱花草青贮饲料。
9.本发明的第四个目的是提供一种柱花草青贮饲料的制备方法。
10.本发明的第一个目的通过如下技术方案实现：
11.一种黄梁木叶黄酮类提取物，采用如下方法制备：
12.s1.将新鲜的黄梁木叶进行处理，得到黄梁木叶粉；
13.s2.将步骤s1得到的黄梁木叶粉浸泡在浸提液中，进行加热，并每隔一段时间搅拌一次，加热结束后，过滤，得到黄梁木叶黄酮类提取液；
14.s3.将步骤s2得到的黄梁木叶黄酮类提取液进行浓缩，得到黄梁木叶黄酮类浓缩液，最后将黄梁木叶黄酮类浓缩液进行真空冷冻干燥，得到黄梁木叶黄酮类提取物。
15.优选地，所述步骤s1中，所述切断处理的方法为将新鲜的黄梁木叶切断至2.5-3.0cm的小段；所述干燥处理的方法为将经切断处理后的黄梁木叶置于干燥通风处放至干燥；所述粉碎处理的方法为将干燥后的黄梁木使用植物粉碎机进行粉碎。
16.优选地，所述步骤s1中，所述黄梁木叶的处理具体包括如下步骤：
17.s11.将新鲜的黄梁木叶切断至2.5-3.0cm的小段后，将切断的黄梁木叶置于通风干燥处，风干至含水量低于5％；
18.s12.将风干后的黄梁木叶使用植物粉碎机进行粉碎后，过筛孔大小为1mm的筛，得到黄梁木叶粉。
19.优选地，所述步骤s2中，所述水浴处理的温度为50℃，所述水浴处理的时间为2h。
20.优选地，所述步骤s2中，所述浸提液为50％的甲醇溶液；所述黄梁木叶粉与浸提液的料液比为1：20。
21.50％的甲醇溶液是指甲醇与水的体积比为1:1的甲醇水溶液。
22.优选地，所述步骤s3中，所述步骤s3中，所述浓缩的方法为：将所述黄梁木叶黄酮类提取液使用旋转蒸发仪蒸馏浓缩至原液体积的1/3后，得到黄梁木叶黄酮类浓缩液；所述旋转蒸发仪的真空度设定为0.1mpa，温度设定为50℃；所述真空冷冻干燥时的真空度设定为60pa以下，所述真空冷冻干燥时的温度设为-55℃以下。
23.本发明的第二个目的通过下述技术方案实现：
24.上述的黄梁木叶黄酮类提取物作为柱花草青贮添加剂在制备柱花草青贮饲料中的应用；通过将黄梁木叶黄酮类提取物作为柱花草青贮添加剂可提高柱花草青贮品质，解决柱花草青贮过程中出现的营养损失大，易腐败等问题。
25.本发明的第三个目的通过下述技术方案实现：
26.一种柱花草青贮饲料，所述柱花草青贮饲料包括上述的黄梁木黄酮类提取物和柱花草，所述黄梁木黄酮类提取物的添加量为柱花草质量的1％-2％。
27.本发明的第四个目的通过下述技术方案实现：
28.一种上述的柱花草青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将黄梁木黄酮类提取物加入至柱花草中，混合均匀后，进行密封处理，在室温下进行青贮。
29.优选地，将黄梁木黄酮类提取物加入至柱花草前，将所述柱花草切割成2-3cm的长度。
30.优选地，所述密封处理为袋装密封、桶装密封或捆扎密封。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
32.1、本发明提供的黄梁木叶黄酮类提取物，作为青贮添加剂可显著提高柱花草青贮品质，解决柱花草在青贮过程中出现的营养损失大，易腐败等问题。与传统的青贮添加剂相比，黄梁木叶黄酮类提取物含有多种生物活性成分，具有抑菌、消炎、提高免疫力等功能。在柱花草青贮中添加黄梁木叶黄酮类提取物可以有效抑制发酵过程中的不良微生物的生长，达到保存柱花草营养物质的目的。
33.2、在柱花草青贮中添加1％-2％的黄梁木叶黄酮类提取物，可较好地保持柱花草的营养特性，得到的柱花草青贮饲料不仅营养丰富，而且气味醇香，适口性好，易于消化。这样做既解决了南方柱花草原料保存的难题，又可以实现柱花草的规模化生产，扩大了饲料的种类和资源；并且有利于解决南方地区草食动物牧草饲料资源季节分布不均的问题。同时，黄梁木叶黄酮类提取物易于保存和跨产地使用，可以进一步扩大使用区域，解决我国饲草主产区的加工难题。并且作为一种木本植物，黄梁木叶黄酮类提取物有效利用可以进一步扩大饲料资源，为木本植物饲料化利用提供新的思路。
具体实施方式
34.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。另外，关于本说明书中的“份”、“％”，除非特别说明，分别表示“质量份”、“质量％”。
35.本发明所述的柱花草和黄梁木叶，其品种和来源都没有特殊的限制。以下实施例中，柱花草和黄梁木叶均采集于华南农业大学启林北试验田中，材料种植过程中未进行浇水和施肥处理等特殊化处理。
36.本发明对采集的柱花草和黄梁木的生长阶段均没有特殊的限制，以下实施例中，所述的柱花草均在生长的第二茬阶段采集获得，黄梁木叶直接从两年生的树木上采集获得。
37.本发明对柱花草青贮的加工工艺没有特殊的限制，以下实施例中，采用的是真空袋装密封法进行青贮，采用桶装密封青贮，罐装密封青贮，捆包密封青贮等加工方法亦可。
38.制备例1
39.黄梁木叶黄酮类提取物采用如下方法制备：
40.s1.取新鲜的黄梁木叶，切断至2.5-3.0cm的小段后混合均匀，置于通风干燥处，风干至含水量低于5％，用植物粉碎机将干燥后的黄梁木叶片粉碎，得到黄梁木叶粉；
41.s2.按照料液比1：20，将黄梁木叶粉浸泡在50％的甲醇溶液里，在50℃水浴加热2小时，并每隔半小时搅拌一次，加热结束后，过滤，去掉滤液，得到黄梁木叶黄酮类提取液；
42.s3.将黄梁木叶黄酮类提取液用旋转蒸发仪进行蒸馏浓缩，将真空度设定为0.1mpa，将温度设定为50℃，将黄梁木叶黄酮类提取液浓缩至原液体积的1/3后，得到黄梁木叶黄酮类浓缩液；
43.s4.将黄梁木叶黄酮类浓缩液预冻凝固后，置于真空冷冻干燥机中进行干燥处理，将真空度设为小于60pa，冷阱温度设为低于-55℃，当样品温度达到室温时，即为干燥结束，得到黄色固体粉末状的黄梁木叶黄酮类提取物，常温密封保存备用。
44.制备例2
45.柱花草的采集和前处理：在离地3-5cm处对柱花草进行刈割。将收割回来的柱花草
用手动式铡刀将其切割为2-3cm的片段，充分混合，常温放置备用。
46.实施例1
47.一种柱花草青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
48.取300g切碎处理后的柱花草，添加1％的黄梁木叶黄酮类提取物，与柱花草原料搅拌充分混合后，分装在3个青贮袋中，密封保存，在常温下进行青贮，得到柱花草青贮饲料(记为1-ne)。
49.实施例2
50.一种柱花草青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
51.取300g切碎处理后的柱花草，添加2％的黄梁木叶黄酮类提取物，与柱花草原料搅拌充分混合后，分装在3个青贮袋中，密封保存，在常温下进行青贮，得到柱花草青贮饲料(记为2-ne)。
52.对比例1
53.一种柱花草青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
54.取300g切碎处理后的柱花草，分装在3个青贮袋中，密封保存，在常温下进行青贮，得到柱花草青贮饲料，作为对照组(记为ck)。
55.实施例1、实施例2和对比例1中的青贮待均选用塑料真空包装袋，均用微型真空封口机排出空气后进行密封处理，室温保存。
56.实施例3
57.将制备例1制备得到的黄梁木叶黄酮类提取物的总黄酮和酚类物质含量进行测定，测定结果如表1所示。该黄梁木叶黄酮类提取物总黄酮和酚类物质含量通过如下方法进行测定。
58.称取0.2g黄梁木叶黄酮类提取物，加入10ml50％甲醇溶解，得到黄梁木叶黄酮类提取物溶解液。
59.(1)取稀释前后的上述黄梁木叶黄酮类提取物溶解液0.5ml，加入0.15ml的5％亚硝酸钠溶液，6min后加入0.15ml的10％三氯化铝溶液，再过6min加入2ml的4％氢氧化钠溶液，加入2.2ml纯水，组成总体积为5ml的体系，等待5min，测定510nm处的吸光值，用芦丁溶液绘制标准曲线，测定黄梁木叶黄酮类提取物的黄酮含量。
60.(2)取稀释前后的上述黄梁木叶黄酮类提取物溶解液20μl于10ml离心管中，加入980ul蒸馏水，0.5ml folin酚试剂和2.5ml20％的碳酸钠溶液，25℃恒温匀速震荡40min。然后测定725nm处的吸光值，没食子酸溶液绘制标准曲线，测定黄梁木叶黄酮类提取物总酚含量。
61.(3)称量0.1g聚乙烯吡咯烷酮，与1ml蒸馏水和1ml上述黄梁木叶黄酮类提取物溶解液，漩涡混匀；3000r离心10min；取上清液100μl于10ml离心管中，加入900ul蒸馏水，0.5mlfolin酚试剂和2.5ml20％的碳酸钠溶液；25℃恒温匀速震荡40min。然后测定725nm处的吸光值，用没食子酸溶液绘制标准曲线，测定黄梁木叶黄酮类提取物简单酚含量。
62.(4)水解单宁含量为上述(2)中测定的黄梁木叶黄酮类提取物总酚含量减去上述(3)中测定的黄梁木叶黄酮类提取物简单酚含量含量。
63.(5)称取黄梁木叶黄酮类提取物样品20mg到10ml离心管中，加入10ml盐酸-丙酮-丁醇溶液，在70℃水浴中加热2.5h。然后，放置冷却，以8000r/min的转速离心5min，测定
554nm处的吸光值，用花青素溶液绘制标准曲线，测定黄梁木叶黄酮类提取物缩合单宁含量。
64.表1黄梁木叶黄酮类提取物总黄酮和酚类物质含量
65.项目含量
±
标准差总黄酮(g rutin/kg dm)623.04
±
69.50总酚(g gallic acid/kg dm)73.03
±
5.35简单酚(g gallic acid/kg dm)2.23
±
0.49水解单宁(g gallic acid/kg dm)70.80
±
5.30缩合单宁(g anthocyanin/kg dm)61.79
±
5.22
66.注：表1中，dm，代表干物质。
67.由表1可知，本发明得到的黄梁木叶黄酮类提取物总黄酮含量高达623.04grutin/kg dm，并含有少量的酚类物质。因此，可以认为该黄梁木叶黄酮类提取物具有较高的抗氧化性及抑菌活性。
68.实施例3
69.将制备例2中采集到的柱花草的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和水溶性碳水化合物等营养成分，以及乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌等微生物数量进行检测，检测结果如表2所示。
70.表2柱花草原料营养成分和微生物数量
71.项目柱花草干物质(g/kg fm)322
±
2.96粗蛋白(g/kg dm)107
±
4.47中性洗涤纤维(g/kg dm)621
±
1.68酸性洗涤纤维(g/kg dm)469
±
11.20水溶性碳水化合物(g/kg dm)17.9
±
0.57乳酸菌(log10cfu/g fm)4.52
±
0.26大肠杆菌(log10cfu/g fm)4.80
±
0.10酵母菌(log10cfu/g fm)3.32
±
0.11霉菌(log10cfu/g fm)2.98
±
0.05
72.注：表2中，dm，代表干物质；fm，代表鲜样。
73.由表2可知，柱花草原料的水溶性碳水化合物低于50g/kg dm，大肠杆菌数量接近5.0log10 cfu/g fm，乳酸杆菌低于5.0log10 cfu/g fm，中性洗涤纤维含量为621g/kg dm。上述成分和微生物数量均不利于柱花草青贮保存，因此有必要添加青贮添加剂促进发酵过程，抑制发酵过程中的不良微生物的生长，提高发酵品质，达到保存柱花草营养物质的目的。
74.实施例5
75.将实施例1、实施例2和对比例1在柱花草青贮第3、7、14和30天进行青贮袋开袋，分别将每袋青贮柱花草混合均匀后，测定青贮相关品质指标，以检测黄梁木叶黄酮类提取物添加对柱花草青贮品质的效果，测试结果如表2和表3所示。具体的指标及其测试方法如下：
76.(1)干物质测定：取约60g混合均匀后的柱花草青贮样品，称重记录取样放在65℃
恒温烘箱中，烘48小时，干物质含量＝烘后重量/烘前重量。
77.(2)ph值测定：取10g柱花草青贮样品，并加入90ml无菌蒸馏水，充分混合，然后用家用水果榨汁机榨汁，先用4层纱布滤去粗滤渣，然后中速定性滤纸过滤，得到浸提液，用ph计(phs-3c，上海雷磁)测量浸提液的ph值即为青贮的ph值。
78.(3)粗蛋白和氨态氮的测定：取0.5g柱花草青贮干粉，采用全自动凯氏定氮(kjeltec 8400，foss，丹麦)测定粗蛋白的含量；用苯酚—次氯酸钠比色法测定氨态氮的含量。
79.(4)真蛋白和非蛋白氮的测定：取0.5g柱花草青贮干粉，将其与15％的三氯乙酸溶液充分混合，静置1小时，用中性定性滤纸过滤，将滤纸连同滤渣无损转移至65℃的烘箱中烘干，然后采用全自动凯氏定氮(kjeltec 8400，foss，丹麦)测定真蛋白的含量；非蛋白氮含量即为粗蛋白含量减去真蛋白含量的差值。
80.(5)乳酸菌数量测定：取柱花草青贮10g，加入90ml无菌的生理盐水，均匀混合后逐级稀释。采用平板计数法测定乳酸菌数量，用mrs琼脂培养基(蛋白胨10.0g；牛肉浸5.0g；酵母提取物4.0g；葡萄糖20.0g；吐温-80，1.0ml；磷酸氢二钾2.0g；乙酸钠5.0g；柠檬酸三铵2.0g；七水合硫酸0.2g；四水合硫酸锰0.05g；琼脂15.0g；最终ph值为6.2
±
0.2)对乳酸菌进行培养。
81.(6)大肠杆菌数量测定：取柱花草青贮10g，加入90ml无菌的生理盐水，均匀混合后逐级稀释。采用平板计数法测定乳酸菌数量，用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(蛋白胨7.0g、酵母提取物3.0g、乳糖10.0g、氯化钠5.0g、胆汁盐3号1.5g、中性红0.03g、结晶紫0.002g、琼脂15.0g；最终ph值为7.4
±
0.2)对大肠杆菌进行培养。
82.(7)干物质体外消化率的测定：取0.5g第30天的柱花草青贮样干粉于滤袋中，密封置于含20ml瘤胃液和40ml mcdougal缓冲液的血清瓶中，置于摇床中培养48小时(39℃，150r
·
min-1
)。取出滤袋洗涤干净，将洗涤后滤袋放置在65℃的烘箱中干燥48h至恒重，测定剩余干物质的重量。干物质消化率＝(剩余干物质重量/初始干物质重量)*100％。
83.表3柱花草青贮饲料的相关品质指标
[0084][0085][0086]
注：表3中，tn代表总氮(total nitrogen)；fm代表鲜物质(fresh matter)，同列不同小写字母a-c表示差异显著，p＜0.05；d表示青贮时间对柱花草青贮的影响；t表示处理对柱花草青贮的影响；d
×
t表示青贮时间和处理交互作用对柱花草的影响。
[0087]
由上表3可知，实施例1和实施例2中添加了黄梁木叶黄酮类提取物作为青贮添加剂得到的柱花草饲料品质，明显优于对比例1即对照组得到的柱花草饲料的品质。实施例1
和实施例2中得到的柱花草青贮饲料，干物质含量高、真蛋白的含量以及乳酸菌数量高；而非蛋白氮、氨态氮和肠杆菌的含量低，品质优异。表明了添加黄梁木叶黄酮类提取物对柱花草品质的提升有积极作用。黄梁木叶黄酮类提取物显著提高了柱花草青贮的干物质含量，同时降低了柱花草青贮的ph值，并显著降低了非蛋白氮和氨态氮的含量，抑制了大肠杆菌的数量；显著提高了真蛋白的含量以及乳酸菌数量，对于柱花草青贮品质的改善和营养成分的保护有显著效果，表明了黄梁木叶黄酮类提取物能显著提高柱花草青贮的品质。
[0088]
表4第30天柱花草青贮体外干物质消化率
[0089][0090][0091]
注：表4中，t表示处理对柱花草青贮体外消化率的影响。
[0092]
由上表4可知，与对比例1相比，实施例1和实施例2得到的柱花草青贮饲料具有更高的体外消化率，表明了黄梁木叶黄酮类提取物显著提高了柱花草青贮的体外干物质消化率，意味着提高了柱花草青贮的可消化利用率，提高了柱花草青贮的在畜牧生产中能量转换效率。
[0093]
综上所述，本发明提供了一种黄梁木叶黄酮类提取物，其总黄酮含量高，并含有少量的酚类物质，具有较高的抗氧化性及抑菌活性。本发明还提供了一种黄梁木叶黄酮类提取物作为青贮添加剂的用途，该黄梁木叶黄酮类提取物作为青贮添加剂加入到柱花草中，可显著提高柱花草青贮的干物质含量，同时降低了柱花草青贮的ph值，并显著降低非蛋白氮和氨态氮的含量，抑制大肠杆菌的数量；显著提高真蛋白的含量以及乳酸菌数量，对于柱花草青贮品质的改善和营养成分的保护有显著效果，显著提高了柱花草的品质。最后，本发明还提供了一种柱花草青贮饲料及其制备方法，该柱花草青贮饲料品质显著、适口性好、易于消化；解决了南方柱花草原料保存的难题，又可以实现柱花草的规模化生产，扩大了饲料的种类和资源；并且有利于解决南方地区草食动物牧草饲料资源季节分布不均的问题。
[0094]
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。