包含虫草素的组合物在制备抗衰老产品中的用途的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗衰老活性的组合物及其制剂，以及其在制备抗衰老产品中的用途。


背景技术：

2.生物体中的细胞、组织和器官会伴随着年龄的增长而逐渐老化，从而使机体表现为多系统的整体性衰老，其中最直观的就是皮肤衰老。皮肤老化是一个多因素过程，会影响其组织形态和生物学功能，由内在因素如年龄，遗传，激素等和外在因素如紫外线暴露，环境污染等多种因素导致。皮肤衰老伴随着明显的迹象，如皮肤变得薄而干燥，细皱纹，弹性下降，色素沉着，头发变白和脱发等。目前，很多抗衰老产品中都使用冬虫夏草作为活性成分。例如，cn113287745a公开了一种含有北虫草和冬虫夏草的含片，其具有抗氧化和延缓衰老的功效。cn114259442a公开了一种包含冬虫夏草提取物的抗衰老组合物。
3.冬虫夏草，最早记载于《本草纲目拾遗》中“冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化为草。若不取，至冬复化为虫”。冬虫夏草是虫草菌cordyceps sinensis感染蝙蝠蛾hepialus spp.幼虫形成的虫菌复合体，是一种被真菌感染后僵死的虫体。在世界范围内，冬虫夏草主要分布于喜马拉雅山脉，其中我国青海、西藏、四川和云南是虫草的主产区。冬虫夏草是我国传统中药材和重要滋补品，具有补肾兴阳、滋阴保肺、补虚损、补精髓、实腠理的功效，也是药食兼顾的补品。由于冬虫夏草价格昂贵且来源有限，因而多年来对冬虫夏草中活性成分的挖掘和研究受到科研工作者的持续关注。
4.然而，冬虫夏草具有生物活性的粗提取物，往往成分比较复杂，难以确认是单一组分还是多组分协同作用的体系，尚未从分子层面阐释其产生生物活性的机理，且冬虫夏草粗提取物的制备方法多种多样，不同条件下制取的提取物成分、含量均有差异。不同组分的提取物，可能体现出不同的生物活性。所以冬虫夏草粗提取物在商品化过程中经常存在活性差、毒副作用大以及不同批次产品之间存在较大差异的问题。
5.这样看来，仅局限于对冬虫夏草粗提取物研发并不能满足对冬虫夏草深入综合利用的需求。冬虫夏草的化学成分主要是多糖类、氨基酸类、蛋白质、核苷类和微量元素等，在众多活性成分中，研究最多的是生物活性更加明显的虫草素、虫草多糖和虫草酸等，这些单体活性成分具有显著的药理学作用。其中，有文献报道，虫草素作为一种来自蛹虫草的核苷类物质，具有广泛的药理活性，在抗肿瘤、抗白血病、免疫调节方面研究较多，其还具有抗衰老、抗炎、降血糖、降血脂等心血管保护作用。
6.然而，仅使用诸如虫草素等的天然产物单体作为抗衰老产品的活性成分虽然在可操控性和质量稳定性方面显著优于粗提取物，但是却也引入了新的问题，其中最主要的问题是虫草素的生产成本较高。因此，寻找能够与虫草素联合使用以显著降低其用量并增加其抗衰老活性，并且来源广泛、安全性高、生产成本较低的物质就成了研究人员亟待解决的问题，但是目前尚无针对这方面的文献报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供了一种具有抗衰老活性的组合物及其制剂，以及其在制备抗衰老产品中的用途。本发明人发现，将小剂量益生菌与虫草素联用能够显著增强虫草素的抗衰老活性，所述组合物及其制剂能够显著缓解年龄相关的皮肤自然衰老和外界不良因素导致的皮肤加速衰老，且没有明显的毒副作用。
8.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
9.在第一个方面中，本发明提供了一种具有抗衰老活性的组合物，所述组合物包含虫草素和益生菌，所述益生菌显著增强所述虫草素的抗衰老活性，两者之间协同发挥作用。
10.优选地，其中所述虫草素(cordycepin)为3
’‑
脱氧腺苷，其化学结构为
[0011][0012]
优选地，本发明中使用的虫草素可以采用常规天然产物提取和纯化方法从含有该活性成分的植物(例如，冬虫夏草、北虫草等)中提取分离得到，也可以购自市售产品。
[0013]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述虫草素与所述益生菌的重量比为15：1-5：1。
[0014]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述虫草素与所述益生菌的重量比为15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1或5：1。
[0015]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述虫草素与所述益生菌的重量比为7：1。
[0016]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述益生菌选自以下一种或多种：动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis bb-12)、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis hn019)、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis bi-07)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)，瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、鼠李糖乳酪杆菌(lactobacillus rhamnosus lgg)或鼠李糖乳酪杆菌(lactobacillus rhamnosus hn001)。
[0017]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述益生菌选自以下一种或多种：瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)或短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)。
[0018]
作为可选的方式，在上述组合物中，所述益生菌由以下组分组成：瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)。
[0019]
优选地，以重量份数计，瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)的比例为4：1：1。
[0020]
本发明中使用的益生菌均已商品化，可以购买获得。
[0021]
在第二个方面中，本发明提供了一种具有抗衰老活性的制剂，所述制剂包含上述第一个方面所述的组合物，以及适宜的载体或辅料。
[0022]
作为可选的方式，在上述制剂中，所述组合物是口服制剂。
[0023]
优选地，所述口服制剂的剂型是口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0024]
上述各种剂型可以根据制剂领域的常规工艺制备而成。
[0025]
作为可选的实施方式，本发明组合物中的各种活性成分可以在同一制剂中施用，也可以在不同制剂中施用。在不同制剂中施用的情况下，各种活性成分的剂型可以是相同的，也可以是不同的。并且，各种活性成分可以同时或顺序施用。
[0026]
在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的组合物或者上述第二个方面所述的制剂在制备抗衰老以及衰老相关症状的产品中的用途。
[0027]
作为可选的方式，在上述用途中，所述产品是药物、保健品或功能性食品。
[0028]
作为可选的方式，在上述用途中，所述衰老以及衰老相关症状是皮肤衰老。
[0029]
优选地，皮肤衰老是皮肤皱纹、弹性下降或色素沉着。
[0030]
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
[0031]
(1)本发明首次发现，将小剂量益生菌与虫草素联用能够显著增强虫草素的抗衰老活性，所述组合物及其制剂能够显著缓解年龄相关的皮肤自然衰老和外界不良因素导致的皮肤加速衰老，且没有明显的毒副作用。
[0032]
(2)本发明组合物中使用的益生菌已有商品化的产品销售，且价格相对比较便宜，本发明组合物解决了单独使用包括虫草素在内的冬虫夏草提取物作为制备抗衰老产品的活性成分成本过高的问题，因此本发明组合物以及包含本发明组合物的抗衰老产品具有很高的商业价值。
具体实施方式
[0033]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0034]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0035]
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0036]
除非另外说明，否则本发明中涉及的百分比和份数均为重量百分比和重量份数。
[0037]
实施例1：本发明组合物对小鼠自然皮肤衰老模型的影响
[0038]
3月龄的雌性c57bl/6j小鼠购买自南京医科大学实验动物中心，饲养温度保持在25
±
5℃，相对湿度保持在50
±
10％，灯光12小时明暗交替。所有小鼠均饲喂普通维持饲料和高温灭菌水，饲养至12月龄。
[0039]
将小鼠随机分为6组，如下所示，分别为：
[0040]
(1)年老小鼠模型组；
[0041]
(2)虫草素组(28mg/kg)；
[0042]
(3)益生菌组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧
杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)1mg/kg)；
[0043]
(4)益生菌对照组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)1mg/kg)；
[0044]
(5)联用1组：虫草素组(28mg/kg)+益生菌组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)1mg/kg)；
[0045]
(6)联用2组：益生菌对照组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)1mg/kg)。
[0046]
第(2)-(6)组经灌胃给与相应剂量的药物，每三天给药一次，第(1)组给予等体积的生理盐水，直至小鼠达24月龄。实验结束后将小鼠用异氟烷麻醉后处死收取背部皮肤组织，使用3月龄的小鼠皮肤作为对照样品。
[0047]
样品处理：取部分样品固定于10％多聚甲醛溶液中，保存在4℃冰箱；其余皮肤组织冻存于-80℃冰箱或液氮中，用于后续指标分析。
[0048]
数据处理：本研究实验数据以平均值
±
标准差表示，采用单因素方差分析进行统计学分析。将p《0.05认为具有统计学显著性差异。
[0049]
透明质酸含量分析：用液氮充分研磨皮肤组织呈细碎状，收集到ep管中。按10％(mg/ml)加入ripa蛋白裂解液，使用自动组织匀浆机破碎皮肤组织。破碎后将样品放置冰上继续裂解30min，期间每隔10分钟涡旋10秒；4℃12000
×
g离心10min，收取上清。使用透明质酸elisa检测试剂盒测定上清中透明质酸的含量。
[0050]
实验结果如下表1所示。与3月龄对照小鼠相比，24月龄老年模型小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量显著降低。与24月龄老年模型小鼠相比，单独使用虫草素能够显著增加小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量(p《0.05)，单独使用低剂量的益生菌组和益生菌对照组所述益生菌组合并不会增加老年小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量。但是，从联用1组和联用2组的实验结果可以看出，将虫草素与益生菌组合物(如益生菌组和益生菌对照组)联用后能够非常显著增加小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量(p《0.01)，特别是联用1组，该组小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量同时还显著高于虫草素单用组(p《0.05)。对联用1组和联用2组的实验结果进行比较后还发现，益生菌组合中具体益生菌的种类也可能会对小鼠皮肤组织中i型胶原蛋白的含量产生显著影响，联用1组和联用2组小鼠i型胶原蛋白的含量分别为914.5
±
32.8ng/g和882.6
±
31.5ng/g。
[0051]
表1：小鼠皮肤组织中胶原蛋白含量
[0052][0053][0054]
注：数据以平均值
±
标准差表示，统计采用单因素方差分析，与年老模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01具有显著性差异；与虫草素组比较，
#
p《0.05具有显著性差异。
[0055]
saβ-gal染色检测：皮肤组织的saβ-gal染色过程如下，从液氮中取出皮肤组织后，放入o.c.t.包埋剂中；置于-20℃冷却包埋；纵向切皮肤组织，切片厚度为8μm；组织固定：1％甲醛溶液室温固定1分钟；用pbs洗涤切片3次，每次1分钟；sa-β-gal染色：滴加适量的sa-β-gal染色液，37℃反应过夜；放入湿盒中，以免干液。伊红苏木素染色：用水快速清洗掉多余的染色液，随即将切片放入95％的乙醇溶液中除水5秒，然后进行伊红染色2分钟，70％
乙醇溶液清洗伊红染液两次，将玻片放置通风处晾干，中性树脂封片后在光学显微镜下观察拍照。
[0056]
实验结果如下表2所示。与3月龄对照小鼠相比，24月龄老年模型小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数显著增加。与24月龄老年模型小鼠相比，单独使用虫草素能够显著降低小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数(p《0.05)，单独使用低剂量的益生菌组和益生菌对照组所述益生菌组合基本不会降低老年小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数。但是，从联用1组和联用2组的实验结果可以看出，将虫草素与益生菌组合物(如益生菌组和益生菌对照组)联用后能够非常显著降低小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数(p《0.01)，特别是联用1组，该组小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数同时还显著低于虫草素单用组(p《0.05)。对联用1组和联用2组的实验结果进行比较后还发现，益生菌组合中具体益生菌的种类也可能会对小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数产生显著影响，联用1组和联用2组小鼠皮肤组织中sa-β-gal阳性点数分别为16.49
±
3.63/mm2和22.52
±
3.91/mm2。
[0057]
表2：小鼠皮肤组织中saβ-gal的活性
[0058]
[0059][0060]
注：数据以平均值
±
标准差表示，统计采用单因素方差分析，与年老模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01具有显著性差异；与虫草素组比较，
#
p《0.05具有显著性差异。
[0061]
实施例2：本发明组合物对小鼠紫外线所致皮肤衰老模型的影响
[0062]
8月龄的雌性c57bl/6j小鼠购买自南京医科大学实验动物中心，饲养温度保持在25
±
5℃，相对湿度保持在50
±
10％，灯光12小时明暗交替。所有小鼠均饲喂普通维持饲料和高温灭菌水，适应性喂养一周后进行实验。
[0063]
将小鼠随机分为7组，如下所示，分别为：
[0064]
(1)紫外线照射模型组；
[0065]
(2)虫草素组(28mg/kg)；
[0066]
(3)益生菌组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)1mg/kg)；
[0067]
(4)益生菌对照组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)1mg/kg)；
[0068]
(5)联用1组：虫草素组(28mg/kg)+益生菌组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)1mg/kg)；
[0069]
(6)联用2组：益生菌对照组(瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)2mg/kg、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)1mg/kg和长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)1mg/kg)；
[0070]
(7)正常对照组。
[0071]
第(2)-(6)组经灌胃给与相应剂量的药物，每天给药一次，连续给药两周。第(1)组和第(7)组给予等体积的生理盐水。两周后进行紫外线照射构建皮肤衰老模型，除正常对照组外，其余小鼠每天uvb紫外照射一次，初始剂量为50mj/cm2，第二周为100mj/cm2，第三周为200mj/cm2，第三周到第六周为300mj/cm2。最后一次照射后24小时，将小鼠用异氟烷麻醉后
处死收取背部皮肤组织，固定于10％多聚甲醛溶液中，保存在4℃冰箱，用于后续指标分析。按照常规方法进行he染色。
[0072]
实验结果如下表3所示。与正常对照小鼠相比，紫外线照射模型小鼠表皮和真皮厚度均显著降低。与紫外线照射模型小鼠相比，单独使用虫草素能够显著增加小鼠表皮和真皮厚度(p《0.05)，单独使用低剂量的益生菌组和益生菌对照组所述益生菌组合并不会增加小鼠表皮和真皮厚度。但是，从联用1组和联用2组的实验结果可以看出，将虫草素与益生菌组合物(如益生菌组和益生菌对照组)联用后能够非常显著增加小鼠表皮和真皮厚度(p《0.01)，特别是联用1组，该组小鼠表皮和真皮厚度同时还显著高于虫草素单用组(p《0.05)。对联用1组和联用2组的实验结果进行比较后还发现，益生菌组合中具体益生菌的种类也可能会对紫外线照射致衰老模型中小鼠表皮和真皮厚度产生显著影响，联用1组和联用2组小鼠表厚度分别为38.77
±
4.06μm和36.07
±
3.85μm，真皮厚度分别为239.6
±
20.2μm和225.8
±
17.6μm。
[0073]
表3：在紫外线致小鼠皮肤衰老模型中小鼠表皮和真皮的厚度
[0074]
[0075][0076]
注：数据以平均值
±
标准差表示，统计采用单因素方差分析，与紫外线照射模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01具有显著性差异；与虫草素组比较，
#
p《0.05具有显著性差异。
[0077]
综上所述，实验结果表明，将小剂量益生菌组合与虫草素联用能够显著增强虫草素的抗衰老活性，本发明组合物能够显著缓解年龄相关的皮肤自然衰老和外界不良因素导致的皮肤加速衰老，且没有明显的毒副作用。
[0078]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。