一种黑枸杞花青素动物饲料添加剂及其制备方法

1.本发明属于饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种黑枸杞花青素动物饲料添加剂及其制备方法。


背景技术：

2.目前，畜禽细菌耐药性不断提高，不仅影响畜禽产品品质，而且威胁人用抑菌药物储备。促生长药物饲料添加剂的禁用推动了畜禽养殖无抗化的发展，但畜牧企业面临了饲养周期延长、畜禽发病率提高等一系列难题。中草药作为饲用抗生素的替代品逐步成为了无抗化养殖的重要添加剂之一，但具体作用机制仍存在空缺。饲用抗生素的应用促进了畜牧行业的高速发展，但也引发了药物残留、抗性筛选、环境污染等一系列问题。针对抗生素滥用的现状，农业农村部194号公告指出自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。饲料中促生长类药物的禁用，使得中草药、益生菌、酸化剂等替代产品迎来了发展机遇。中草药植物提取物中含有丰富的天然活性成分，并能够促进动物生长，其常在畜牧业中作为替代抗生素产品。植物提取物作为植物的次生代谢产物往往来源于传统的中药材，并分为多酚类、多糖类、多肽类等种类。植物提取物含有的天然生物活性成分具有代替饲用促生长抗生素的潜力。生物活性成分主要包括多酚类、多糖类、多肽类等营养物质。我国是天然产物品种最丰富的国家，得天独厚的资源优势促进了植物提取物在饲料添加剂领域的研究与应用。国内外科研人员对植物提取物作为饲料添加剂的应用有许多报道，主要集中在生长促进效果、调控脂质合成、增强疾病抗性、缓解氧化应激、干预肠道菌群、提高消化酶活性等方面。研究表明，杜仲提取物对断奶仔猪有显著的生长促进效果，且优于饲用抗生素。大蒜提取物通过抑制参与胆固醇和脂质合成的关键酶(如苹果酸酶)，对肉鸡、蛋鸡和鹌鹑等家禽表现出降低胆固醇的作用。大蒜中的多酚物质大蒜素作用于艾美球虫的细胞质膜，改变质膜阳离子渗透性，导致艾美球虫死亡，进而增强了家禽的球虫病抗性。饲粮中补充橄榄油生物活性提取物成功减轻了断奶母牛持续免疫激活的负面影响。补充玉屏风多糖后凡纳滨对虾肠道微生物多样性和丰富度下降以及与短链脂肪酸代谢相关功能基因表达增加的现象。断奶仔猪饲粮中补充适宜甜菜碱有助于猪肠道中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性的提升。
3.尽管国内外对植物提取物在畜禽养殖中进行了不同形式的实践获得了一系列良好应用效果，但植物提取物对畜禽的抗氧化能力，炎症的发生以及能量代谢的影响鲜见报道。
4.花青素又称“花色苷”，是普遍存在于某些植物细胞液泡中的水溶性天然色素，属于类黄酮的酚类物质。研究发现，花青素在抗炎和抗氧化等方面均具有一定的生物功效，并且对抑制癌细胞的生长有一定选择性，能通过阻碍细胞增殖、诱导凋亡等多种方式来抑制肿瘤发生；通过清除活性氧自由基等途径来发挥抗氧化作用，还有降低心血管疾病的发生率等多种功能。花青素能有效提高机体免疫，经过良好的开发利用后，花青素可广泛应用于调节机体免疫反应，改善动物健康状况，促进机体生长发育。花青素是一种强力的抗氧化
剂，能剔除机体的有害自由基团，使动物衰老变慢，增强动物抗氧化的能力。
5.现有的饲料添加剂不适用于动物保健，部分可提高动物免疫力的添加剂效果不佳。植物提取物对畜禽的抗氧化能力，炎症的发生以及能量代谢的影响鲜见报道。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
7.(1)现有的饲料添加剂未见有专一保护高海拔动物低氧适应，部分对提高低氧环境下动物免疫力的添加剂效果不佳；
8.(2)现有技术没有利用植物提取物制备饲料添加剂以提高高海拔畜禽的抗氧化能力以及影响炎症的发生、能量代谢的方法；
9.(3)现有的饲料添加剂没有专一提高高海拔动物的抗氧化能力、减少炎症、提高能量代谢水平，也不能提高动物免疫力、抗病能力、预防动物疾病发生。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黑枸杞花青素动物饲料添加剂及其制备方法。
11.本发明是这样实现的，一种黑枸杞花青素动物饲料添加剂，所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂由黑枸杞提取物组成。
12.进一步，所述黑枸杞提取物为黑枸杞花青素。
13.本发明的另一目的在于提供一种制备所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂的方法，所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂的制备方法包括：
14.步骤一，获取新鲜、粒大、无病虫害的黑枸杞，并浸泡一段时间；再利用流动的清水冲洗所述黑枸杞；利用烘干装置对所述冲洗后的黑枸杞进行烘干处理，得到黑枸杞干；
15.步骤二，利用粉碎装置对所述黑枸杞干进行粉碎处理，过60-80目筛，得到黑枸杞粉末；将得到的黑枸杞粉末与去离子水充分混合并搅拌均匀，得到黑枸杞液；
16.步骤三，向得到的黑枸杞液中添加柠檬酸以及果胶酶进行酶解处理，过滤得到酶解液与残渣；对所述酶解液进行真空抽滤以及真空旋转蒸发、真空冷冻干燥得到黑枸杞花青素提取物，所述黑枸杞花青素提取物为黑枸杞花青素动物饲料添加剂。
17.进一步，所述浸泡包括：利用盐水对黑枸杞浸泡15分钟。
18.进一步，所述黑枸杞粉末与去离子水的质量比为1:5。
19.本发明的另一目的在于提供一种添加有所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂的动物饲料，所述动物饲料按照质量份数由玉米粉20-30份、鱼粉15-20份、蛋白粉15-20份、松针粉10-15份、黑枸杞花青素动物饲料添加剂8-10份、大豆油5-8份以及氨基酸3-6份组成。
20.本发明的另一目的在于提供一种制备所述动物饲料的方法，所述动物饲料制备方法包括：
21.首先，按比例称取玉米粉、鱼粉、蛋白粉、松针粉、黑枸杞花青素动物饲料添加剂、大豆油以及氨基酸；
22.其次，利用粉碎装置对玉米粉、鱼粉、蛋白粉、松针粉分别进行粉碎，过筛，并混合均匀，得到混合物料；
23.然后，将称取的黑枸杞花青素动物饲料添加剂、大豆油以及氨基酸添加到所述混合物料中加水搅拌均匀，调质造粒得到动物饲料。
24.进一步，所述过筛包括：过30-40目筛。
25.本发明的另一目的在于提供一种所述动物饲料在饲喂动物中的应用。
26.本发明的另一目的在于提供一种所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂作为动物饲料的用途。
27.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明添加黑枸杞能够提高动物的免疫力的，减少动物患病率。且黑枸杞原料易获取，制备方法简单；能够促进动物消化，提高饲料的利用率；能够抗氧化，提高副产品的品质；且抗菌效果佳，能有效增强动物的免疫抵抗力，可作为一种保健型育肥动物饲料添加剂进行使用，保证动物健康、快速地成长，具有很好的使用价值。
28.本发明添加黑枸杞花青素能够促进动物消化，提高饲料的利用率；能够抗氧化，提高副产品的品质；提高动物抗病能力，预防动物疾病发生；且抗菌效果佳，能有效增强动物的免疫抵抗力。
附图说明
29.图1(a)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的cat含量对比示意图；
30.图1(b)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的sod含量对比示意图；
31.图1(c)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的gsh-px含量对比示意图；
32.图1(d)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的ho-1含量对比示意图；
33.图1(e)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的mda含量对比示意图；
34.图2(a)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的促炎因子tnf-α表达水平对比示意图；
35.图2(b)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的促炎因子il-6表达水平对比示意图；
36.图2(c)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的促炎因子il-10表达水平对比示意图；
37.图3(a)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的ca
2+
atp酶含量对比示意图；
38.图3(b)是本发明实施例提供的常氧组、常氧+花青素组、低氧组以及低氧+花青素组的na
+-k
+-atp酶含量对比示意图。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黑枸杞花青素动物饲料添加剂及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
41.本发明实施例提供的黑枸杞花青素动物饲料添加剂由花青素组成。
42.本发明实施例提供的黑枸杞花青素动物饲料添加剂制备方法包括：
43.步骤一，获取新鲜、粒大、无病虫害的黑枸杞，利用盐水对黑枸杞浸泡15分钟；再利用流动的清水冲洗所述黑枸杞；利用烘干装置对所述冲洗后的黑枸杞进行烘干处理，得到黑枸杞干；
44.步骤二，利用粉碎装置对所述黑枸杞干进行粉碎处理，过60-80目筛，得到黑枸杞粉末；将得到的黑枸杞粉末与5倍量的去离子水充分混合并搅拌均匀，得到黑枸杞液；
45.步骤三，向得到的黑枸杞液中添加柠檬酸以及果胶酶进行酶解处理，过滤得到酶解液与残渣；对所述酶解液进行真空抽滤以及真空旋转蒸发、真空冷冻干燥得到黑枸杞花青素提取物，所述黑枸杞花青素提取物为黑枸杞花青素动物饲料添加剂。
46.本发明实施例提供的动物饲料按照质量份数由玉米粉20-30份、鱼粉15-20份、蛋白粉15-20份、松针粉10-15份、黑枸杞花青素动物饲料添加剂8-10份、大豆油5-8份以及氨基酸3-6份组成。
47.本发明实施例提供的动物饲料制备方法包括：
48.首先，按比例称取玉米粉、鱼粉、蛋白粉、松针粉、黑枸杞花青素动物饲料添加剂、大豆油以及氨基酸；
49.其次，利用粉碎装置对玉米粉、鱼粉、蛋白粉、松针粉分别进行粉碎，过30-40目筛，并混合均匀，得到混合物料；
50.然后，将称取的黑枸杞花青素动物饲料添加剂、大豆油以及氨基酸添加到所述混合物料中加水搅拌均匀，调质造粒得到动物饲料。
51.经hplc-q-tof-ms分析，本发明实施例提供的黑果枸杞花青素中包含五种花青素化合物，总含量为64.4％。其中，c
49h50o28
，矮牵牛素-3-o-芸香糖(反式对香豆酸-7-o-葡萄糖苷)-5-o-葡萄糖苷，其分子量为1095.983，出峰时间为5.225，含量为4.2％；c
43h49o23
，矮牵牛素-3-o-芸香糖(反式对香豆酸)-5-o-葡萄糖苷，其分子量为933.842，出峰时间为16.952，含量为2.6％；c
44h51o24
，矮牵牛素-3-o-芸香糖(阿魏酰)-5-o-葡萄糖苷，其分子量为963.868，出峰时间为17.872，含量为47.6％；c
43h49o24
，矮牵牛素-3-o-芸香糖(咖啡酰)-5-o-葡萄糖苷，其分子量为949.841，出峰时间为18.390，含量为6.4％；c
44h51o23
，锦葵素-3-o-芸香糖(反式对香豆酸)-5-o-葡萄糖苷，其分子量为847.864，出峰时间为18.945，含量为3.6％(见表1)。
52.表1
[0053][0054]
本发明实施例提供的应用方法包括：将所述黑枸杞花青素动物饲料添加剂与其他饲料原材料混合均匀，得到动物饲料。
[0055]
下面结合具体实验对本发明的技术效果做进一步说明。
[0056]
1、本发明明确低氧诱导下黑枸杞花青素(anthocyanidin，ac)对h9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平、炎性因子、能量代谢的影响，本试验以h9c2大鼠心肌细胞为研究对象，将h9c2大鼠心肌细胞接种到96孔板上，分为对照组(常氧组)、常氧+花青素组(60μg/ml)、低氧组(1％氧浓度)和低氧(1％氧浓度)+花青素组(60μg/ml)，每组设置三个重复，首先四个组预处理24h，令细胞贴壁及生长到合适的细胞密度，将对照组与常氧+花青素组放置co2培养
箱中24h，将低氧组与低氧+花青素组放置细胞1％氧浓度低氧小室中，而后将低氧小室放置在co2培养箱中24h，每组共计培养48h。随后使用elisa试剂盒进行各项指标的测定。结果表明：与对照组相比，低氧组gsh-px、ho-1含量显著降低(p《0.05)，cat、sod含量均极显著降低(p《0.01)，mda含量极显著升高(p《0.01)；常氧+花青素组mda的含量显著降低(p《0.05)，cat、ho-1含量显著升高(p《0.05)，gsh-px、sod含量均极显著升高(p《0.01)。与低氧组相比，低氧+花青素组mda含量极显著降低(p《0.01)，cat、gsh-px、sod和ho-1含量均极显著升高(p《0.01)。与对照组相比，低氧组促炎因子tnf-α、il-6抗体表达水平均极显著升高(p《0.01)，抗炎因子il-10抗体表达水平极显著降低(p《0.01)；常氧+花青素组促炎因子tnf-α、il-6抗体表达水平均显著降低(p《0.05)，抗炎因子il-10抗体表达水平极显著升高(p《0.01)。与低氧组相比，低氧+花青素组促炎因子tnf-α、il-6抗体表达水平均极显著降低(p《0.01)，抗炎因子il-10抗体表达水平极显著升高(p《0.01)。与对照组相比，低氧组na
+-k
+-atp酶活性显著降低(p《0.05)，ca2
+-atp酶活性极显著降低(p《0.01)；常氧+花青素组na
+-k
+-atp酶活性极显著升高(p《0.01)，ca2
+-atp酶活性显著升高(p《0.05)。与低氧组相比，低氧+花青素组na
+-k
+-atp酶、ca2
+-atp酶活性均极显著升高(p《0.01)。黑果枸杞花青素能够通过减轻h9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤、增强低氧下心肌细胞的能量代谢、抑制低氧诱导的炎症的发生进而缓解h9c2大鼠心肌细胞的低氧损伤。
[0057]
2、材料与方法
[0058]
2.1实验材料
[0059]
h9c2大鼠心肌细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司；黑枸杞提取物——花青素，购于青海省自青海金麦杞生物科技有限公司。dmem干粉和胎牛血清购自于gibco公司；pbs购自hfart公司；胰蛋白酶溶液购自solarbio公司；超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒、丙二醛(mda)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)测定试剂盒、过氧化氢酶(cat)测定试剂盒、超微量ca
2+-atp酶测试盒、超微量na
+k+-atp酶测试盒、总蛋白(tp)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；大鼠血红素氧合酶1(ho-1)测定试剂盒、大鼠白细胞介素-6(il-6)测定试剂盒、大鼠白细胞介素10(il-10)测定试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(tnf-α)测定试剂盒，购自于江苏酶免实业有限公司；dmem干粉和胎牛血清购自于gibco公司；pbs购自hfart公司；胰蛋白酶溶液购自solarbio公司；青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin solution)混合液，购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。ripi(强)裂解液；购自于陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司。
[0060]
2.2主要仪器
[0061]
超净工作台(江苏通净净化设备有限公司)；co2细胞培养箱(美国nuaire公司)；mic-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓购自杭州艾普仪器设备有限公司；高速低温离心机(英国dynamica公司)酶标仪，购自意大利multiskan公司。
[0062]
2.3试剂配制
[0063]
黑枸杞提取物——花青素的配制：将黑枸杞提取物——花青素溶解于dmem培养基中，配置浓度为50μg/ml的黑枸杞提取物——花青素使用，4℃冰箱避光保存。
[0064]
2.4细胞培养及分组
[0065]
将h9c2大鼠心肌细胞置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养，用含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养液进行培养，每24h换一次液，待细胞生长约70％～80％融合时
将其传代，2～3d进行一次细胞传代，传代培养足够的细胞以备用。取处于对数生长期的细胞接种到96孔板上，用于试验细胞分为对照组(常氧组)、花青素组(50μg/ml)、低氧组(1％氧浓度)、低氧(1％氧浓度)+花青素(50μg/ml)，首先四个组预处理24h，令细胞贴壁及生长到合适的细胞密度，将对照组与常氧+花青素组放置co2培养箱中24h，将低氧组与低氧+花青素组放置细胞1％氧浓度低氧小室中，而后将低氧小室放置在co2培养箱中24h，每组共计培养48h。其中氧浓度使用mic-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓控制氧浓度，每组设置三个重复。
[0066]
2.5氧化损伤水平相关酶活性测定
[0067]
h9c2大鼠心肌细胞经96孔板培养后，96孔板每孔加入15μl裂解液。用微量移液器轻轻吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，用显微镜观察细胞情况，随后sod、mda、cat参照南京建成生物工程研究所的相应试剂盒流程测定，ho-1参照江苏酶免实业有限公司的相应试剂盒流程测定。
[0068]
2.6相关炎性因子指标测定
[0069]
h9c2大鼠心肌细胞经96孔板培养后，96孔板每孔加入15μl裂解液。用微量移液器轻轻吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，用显微镜观察细胞情况，随后sod、mda、cat参照南京建成生物工程研究所的相应试剂盒流程测定，ho-1参照江苏酶免实业有限公司的相应试剂盒流程测定。
[0070]
2.7能量代谢相关指标的测定
[0071]
h9c2大鼠心肌细胞经96孔板培养后，吸去上清，用胰酶室温消化2～3分钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入ep管，然后1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml pbs轻轻吹打，再次1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞待用，加入培养液制成细胞悬液，重新接种到96孔板，反复冻融三次，随后超微量ca
2+-atp酶测试盒、超微量na
+-k
+-atp酶测试盒参照南京建成生物工程研究所的相应试剂盒流程测定。
[0072]
2.8数据处理
[0073]
所有试验数据经excel软件初步处理后，采用spss statistics 26统计软件进行单因素方差分析(one-way anova)，lsd法进行多重比较，表中数据以“平均数
±
标准差”表示，以p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著，利用originpro 9.0软件进行绘图。
[0074]
3、结果与分析
[0075]
3.1黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平的影响
[0076]
如图1(a)所示，与对照组相比，常氧+花青素组的cat含量显著升高(p《0.05)，低氧组的cat含量极显著降低(p《0.01)；与低氧组相比，低氧组+花青素组cat含量极显著升高(p《0.01)。如图1(b)所示，与对照组相比，常氧+花青素组sod含量极显著升高(p《0.01)，低氧组sod含量极显著降低(p《0.01)；与低氧组相比，低氧+花青素组sod含量极显著升高(p《0.01)。如图1(c)所示，与对照组相比，常氧+花青素组gsh-px含量极显著升高(p《0.01)，低氧组gsh-px含量显著降低(p《0.05)；与低氧组相比，低氧+花青素组gsh-px含量极显著升高(p《0.01)。如图1(d)所示，与对照组相比，常氧+花青素组ho-1含量显著升高(p《0.05)，低氧组ho-1含量显著降低(p《0.05)；与低氧组相比，低氧+花青素组ho-1含量极显著升高(p《
0.01)。如图1(e)所示，与对照组相比，常氧+花青素组mda含量显著降低(p《0.05)，低氧组mda含量极显著升高(p《0.01)；与低氧组相比，低氧+花青素组mda含量极显著降低(p《0.01)。
[0077]
3.2黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞炎性因子的影响
[0078]
如图2(a)所示，与对照组相比，常氧组+花青素组促炎因子tnf-α表达水平显著降低(p《0.05)，低氧组促炎因子tnf-α表达水平极显著升高(p《0.01)；与低氧组相比，低氧组+花青素组促炎因子tnf-α表达水平极显著降低(p《0.01)。如图2(b)所示，与对照组相比，常氧组+花青素组促炎因子il-6表达水平显著降低(p《0.05)，低氧组促炎因子il-6表达水平极显著升高(p《0.01)；与低氧组相比，低氧组+花青素组促炎因子il-6表达水平极显著降低(p《0.01)。如图2(c)所示，与对照组相比，常氧+花青素组抗炎因子il-10表达水平极显著升高(p《0.01)，低氧组抗炎因子il-10表达水平极显著降低(p《0.01)；与低氧组相比，低氧+花青素组抗炎因子il-10表达水平极显著升高(p《0.01)。
[0079]
3.3黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞能量代谢的影响
[0080]
如图3(a)所示，与对照组相比，常氧+花青素组ca
2+
atp酶含量显著升高(p《0.05)，低氧组ca
2+
atp酶含量极显著降低(p《0.01)；与低氧组相比，低氧+花青素组ca
2+
atp酶含量极显著升高(p《0.01)。如图3(b)所示，与对照组相比，常氧+花青素组na
+-k
+-atp酶含量极显著升高(p《0.01)，低氧组na
+-k
+-atp酶含量显著降低(p《0.05)；与低氧组相比，低氧+花青素组na
+-k
+-atp酶含量极显著升高(p《0.01)。
[0081]
4、结果
[0082]
哺乳动物细胞中的多种生化反应必须在足够的氧气浓度下才能够顺利进行。机体长期处于低氧环境下会引发一系列生理/病理反应。长期低氧应激会导致器官在形态结构、代谢、机能等方面发生异常；如果机体长期处于低氧应激将导致组织器官功能衰竭，尤其会导致神经系统和心血管系统产生多种难以修复的损伤，最终造成脑和心等重要器官因能量供应不足而坏死。
[0083]
4.1黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平的影响
[0084]
低氧引起的氧化还原能力过强是由于ros生成过多和抗氧化系统受损所致。sod，cat，gsh-px，ho-1含量可直接反应细胞抗氧化程度，mda含量可间接反映细胞过氧化损伤程度。如图1(a)～(d)所示，与对照组相比，常氧+花青素组mda的含量显著降低(p《0.05)，cat、ho-1含量显著升高(p《0.05)，gsh-px、sod含量极显著升高(p《0.01)证实在常氧下，花青素可提高其抗氧化能力；与对照组相比，低氧组gsh-px、ho-1含量显著降低(p《0.05)，cat、sod含量均极显著降低(p《0.01)，mda含量均极显著升高(p《0.01)，证实低氧诱导下，h9c2细胞的抗氧化能力降低，引发了细胞在低氧应激下的氧化损伤；而与低氧组相比，低氧+花青素组mda含量极显著降低(p《0.01)，cat、gsh-px、sod和ho-1含量均极显著升高(p《0.01)，这证实黑枸杞花青素可通过上调抗氧化因子cat、gsh-px、sod和抗氧化酶ho-1的表达并下调过氧化产物mda的含量提高h9c2大鼠心肌细胞在低氧环境下的抗氧化能力，明显改善低氧诱导下造成的氧化应激下的氧化损伤。
[0085]
4.2黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞炎性因子的影响
[0086]
低氧诱导下可令细胞产生氧化应激，进而造成氧化损伤。这时细胞就会产生免疫
应答，分泌大量炎症因子，如促炎因子tnf-α，il-6，抗炎因子il-10等。如图2(a)、图2(b)、图2(c)所示，与对照组相比，常氧+花青素组促炎因子tnf-α、il-6表达水平均显著降低(p《0.05)，抗炎因子il-10表达水平极显著升高(p《0.01)证实其在常氧下，花青素也可提高其抗炎能力；与对照组相比，低氧组促炎因子tnf-α、il-6表达水平均极显著升高(p《0.01)，抗炎因子il-10表达水平极显著降低(p《0.01)证实在低氧诱导下可促使炎症的发生；而与低氧组相比，低氧+花青素组促炎因子tnf-α、il-6抗体表达水平均极显著降低(p《0.01)，抗炎因子il-10表达水平极显著升高(p《0.01)。证实黑枸杞花青素可通过抑制低氧诱导后的h9c2大鼠心肌细胞中促炎因子tnf-α、il-6的表达，促进抗炎因子il-10的表达，抑制低氧诱导的炎症的发生。
[0087]
4.3黑枸杞提取物——花青素对低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞能量代谢的影响
[0088]
细胞应对低氧环境的关键步骤之一是减少代谢率和代谢需求，因此在本发明中，如图3(a)、图3(b)所示，与对照组相比，常氧+花青素组na
+-k
+-atp酶活性极显著升高(p《0.01)，ca
2+-atp酶活性显著升高(p《0.05)，证实常氧下花青素可提高其能量代谢水平；低氧组na
+-k
+-atp酶活性显著降低(p《0.05)，ca
2+-atp酶活性极显著降低(p《0.01)，证实在低氧诱导下，其能量代谢水平降低。与低氧组相比，低氧+花青素组na
+-k
+-atp酶、ca
2+-atp酶活性均极显著升高(p《0.01)。证实在低氧诱导后，代谢率减少，加入花青素后，可以明显改善在低氧环境下的代谢率，改善其在低氧诱导下造成的氧化应激的氧化损伤的代谢需求。
[0089]
5、结果
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花青素提高低氧诱导下的h9c2大鼠心肌细胞的抗氧化能力，减少炎症因子的分泌、增加能量代谢率，有效增强动物的免疫抵抗力，为动物饲料添加剂领域提供了新思路。
[0091]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。