紫苏醛在抑制真菌毒素合成中的应用

1.本发明涉及真菌毒素抑制技术领域，更具体的说是涉及紫苏醛在抑制真菌毒素合成中的应用。


背景技术：

2.果蔬含有丰富的营养物质，是人类必不可少的食物。然而，在生产、加工、贮藏、运输及销售过程中极易受到产毒真菌及真菌毒素的污染，经济损失巨大，同时，真菌毒素有致畸、致癌和致突变等有害作用，严重威胁人类健康。如赭曲霉毒素a(ota)和交链孢酚(aoh)是果蔬及其制品中常见的真菌毒素。动物实验结果表明，ota具有急性毒性、肾毒性、肝脏毒性、神经毒性等，早在1993年，ota已被国际癌症研究机构iarc定义为group 2b类致癌物，各国对农产品及其制品中ota都陆续制定了限量标准。aoh具有诱变性和致癌性，欧洲食品安全局风险评估结果表明，随膳食摄入的aoh等交链孢毒素对公众健康存在潜在风险。因此，果蔬及其制品中真菌毒素污染的防控是亟待解决的问题。
3.目前，施用农药类化学杀菌剂是控制果蔬中由产毒真菌引起的真菌病害和毒素污染的常见措施，但多数农药类化学杀菌剂易产生化学药剂残留/释放，对人体及环境均有一定的安全隐患，而且长期使用易使病原菌产生耐药性。
4.综上，如何提供一种天然、安全、高效的真菌毒素抑制剂是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了紫苏醛在抑制真菌毒素合成中的应用。紫苏醛是天然产物紫苏精油的主要成分之一，具有广谱的抗炎抑菌功效。目前紫苏醛在抑制真菌及真菌毒素应用方面的研究未见报道。本发明经研究发现，紫苏醛抑制炭黑曲霉合成ota毒素以及交链孢菌合成aoh毒素时的效果显著，可应用于防控果蔬中真菌毒素的污染。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.紫苏醛在抑制真菌毒素合成中的应用。
8.进一步的，所述真菌为炭黑曲霉(aspergillus carbonarius)或交链孢菌(alternaria alternata)。
9.进一步的，所述真菌毒素为赭曲霉毒素a(ota)或交链孢酚(aoh)。
10.进一步的，本发明的目的在于提供一种天然、安全的果蔬采后真菌毒素抑制剂及其制备方法与应用。
11.一种真菌毒素合成抑制剂，包括紫苏醛。
12.进一步的，包括如下质量份数的组分：紫苏醛0.6份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.2～0.25份和水1000份。
13.进一步的，包括如下质量份数的组分：紫苏醛0.6份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.25份和水1000份。
14.进一步的，紫苏醛、包埋剂、表面活性剂、交联剂的质量比为12:15:90:5。
15.进一步的，所述包埋剂为壳聚糖；所述表面活性剂为吐温80；所述交联剂为三聚磷酸钠。
16.上述的抑制剂的制备方法，将包埋剂溶解在1％醋酸水中后，加入表面活性剂充分混匀，在搅拌下加入紫苏醛，充分混匀，然后在搅拌下缓慢加入交联剂并充分混匀即可。
17.紫苏醛不溶于水、挥发性强且不稳定，为了改善这些弊端，本发明将紫苏醛进行包埋，形成稳定的白色乳状液，使其可以通过浸渍及喷洒的方式发挥作用，进而在果实上持续缓释，延长其使用时间，保持最佳的抑菌浓度，发挥紫苏醛较佳杀菌抑菌效果。
18.上述的抑制剂在抑制果蔬真菌毒素合成中的应用。
19.进一步的，在果蔬采收后，使用所述抑制剂处理即可。
20.进一步的，在果蔬采收后，使用所述抑制剂对果蔬进行喷施处理，晾干；或者将果蔬浸泡在所述抑制剂中2～10min，晾干。
21.进一步的，所述果蔬为果实。
22.进一步的，所述果实具体可为葡萄、番茄等。
23.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)本发明的抑制剂对葡萄中炭黑曲霉产生ota毒素的抑制率为93.9％；对交链孢菌在番茄病斑处和周围外延1cm处组织中产生aoh的抑制率分别为82.7％和73.7％，提升了果蔬的质量安全水平；(2)本发明中所述抑制剂的活性成分紫苏醛来源于《食品安全国家标准食品添加剂使用标准gb2760》中明确规定的可允许使用的食品用天然香料紫苏油的主要成分，也是《食品安全国家标准食品添加剂使用标准gb2760》中明确规定的可允许使用的食品用合成香料。本发明中的包埋剂壳聚糖、表面活性剂吐温80、交联剂三聚磷酸钠均为食品安全国家标准中明确规定的食品添加剂(gb 29941食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)；gb 25554食品安全国家标准食品添加剂聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯(吐温80)；gb 1886.335食品安全国家标准食品添加剂三聚磷酸钠)。本发明的抑制剂不会危害人体健康，具有很高的食用安全性，且不会污染环境，可作为传统化学杀菌剂和防腐剂的替代品，应用前景广阔。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1附图为本发明实施例1中不同剂量紫苏醛对炭黑曲霉和交链孢菌在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上生长和产毒的影响，其中图1a为pda培养基上紫苏醛对炭黑曲霉菌落形态的影响，图1b为pda培养基上紫苏醛对炭黑曲霉生长和产毒的抑制率；图1c为pda培养基上紫苏醛对交链孢菌菌落形态的影响，图1d为pda培养基上紫苏醛对交链孢菌生长和产毒的抑制率；
26.图2附图为本发明实施例2中紫苏醛对炭黑曲霉菌丝及孢子形态影响的扫描电镜图片，其中图2a和图2b为紫苏醛处理前炭黑曲霉菌丝和孢子形态图，图2c和图2d为紫苏醛
处理后炭黑曲霉菌丝和孢子形态图；
27.图3附图为本发明实施例2中紫苏醛对交链孢菌菌丝及孢子形态影响的扫描电镜图片，其中图3a和图3b为紫苏醛处理前交链孢菌菌丝和孢子形态图，图3c和图3d为紫苏醛处理后交链孢菌菌丝和孢子形态图；
28.图4附图为本发明制备的抑制剂的外观图；
29.图5附图为本发明实施例3中紫苏醛对葡萄果实上炭黑曲霉病斑形态及产生ota毒素的影响，其中图5a为未处理和紫苏醛处理的葡萄果实上炭黑曲霉病斑形态图，图5b为未处理和紫苏醛处理后的葡萄果实贮藏5天后ota毒素含量；
30.图6附图为本发明实施例4中紫苏醛对番茄果实上交链孢菌病斑形态及产生aoh毒素的影响，其中图6a为未处理和紫苏醛处理的番茄果实上交链孢菌病斑形态图，图6b为未处理和紫苏醛处理后的番茄果实贮藏10天后aoh毒素含量。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
33.实施例1
34.紫苏醛对交链孢菌和炭黑曲霉在培养基中生长产毒的影响
35.制备炭黑曲霉和交链孢菌的孢子悬浮液，将2μl的孢子悬浮液接种于二分格培养皿中含有pda培养基一侧的中心位置，于培养皿另一侧对称位置放置滤纸片，分别添加不同剂量(0μl、0.625μl、1.25μl、2.5μl、5μl)的紫苏醛，25℃培养5天。其中不添加紫苏醛的作为对照组，其余的作为处理组。
36.测定菌落直径，并计算抑制率，抑制率计算公式：
37.抑制率(％)＝(1-处理组/对照组)
×
100％。
38.取菌饼后切碎，使用乙腈对其中的真菌毒素进行萃取后利用高效液相色谱进行毒素含量测定，并计算抑制率，抑制率计算公式同上。
39.本实施例对菌落大小和培养基上ota、aoh毒素的水平进行了测试，测试结果见图1，其中图1a为紫苏醛对炭黑曲霉菌落形态的影响，图1b为紫苏醛对炭黑曲霉生长和产毒的抑制率，图1c为紫苏醛对交链孢菌菌落形态的影响，图1d为紫苏醛对交链孢菌生长和产毒的抑制率。如图所示，紫苏醛对炭黑曲霉生长和产毒的抑制率分别为13.3％～100％和46.7％～100％；紫苏醛对交链孢菌生长和产毒的抑制率分别为35.5％～100％和22.5％～100％；体外培养基条件下，紫苏醛对交链孢菌和炭黑曲霉的生长和产毒均具有双重抑制效应，剂量为5μl的紫苏醛即可完全抑制炭黑曲霉和交链孢菌的生长，剂量为2.5μl的紫苏醛可几乎完全抑制aoh和ota毒素的产生。
40.实施例2
41.紫苏醛对炭黑曲霉和交链孢菌菌丝孢子的显微结构的影响
42.制备炭黑曲霉和交链孢菌的孢子悬浮液，浓度均为2
×
105个ml-1
。取2μl的悬浮液滴加到二分格培养皿中一侧的pda培养基上，二分格培养皿另一侧对称位置放置滤纸片，添加1.25μl的紫苏醛，25℃培养3天后插入无菌的破碎盖玻片。其中不添加紫苏醛的作为对照组，添加紫苏醛的作为处理组。生长2天后取出，经2.5％戊二醛固定过夜，0.1mol/l磷酸缓冲液漂洗后，利用30％、50％、70％、80％、90％梯度乙醇溶液脱水，100％乙醇脱水处理2次，最后用叔丁醇替换乙醇处理样品，经冷冻干燥、镀膜后扫描电镜观察分析。利用扫描电镜hitachi s-3400对炭黑曲霉和交链孢菌的菌丝及孢子形态进行显微结构分析。观察结果见图2和图3。其中图2a和2b分别为正常生长状态下炭黑曲霉的菌丝和孢子，2c和2d分别为紫苏醛胁迫下炭黑曲霉的菌丝和孢子；图3a和3b分别为正常生长状态下交链孢菌的菌丝和孢子，3c和3d分别为紫苏醛胁迫下交链孢菌的菌丝和孢子。由图2可以看出，炭黑曲霉正常菌丝光滑均匀、呈线形，孢子形态规整，呈圆形，紫苏醛处理后，炭黑曲霉的菌丝发生明显的干瘪、皱缩，部分菌丝缠结并出现断裂，孢子表面出现凹陷、皱褶及不规则皱缩。由图3可以看出，与对照相比，紫苏醛处理后交链孢菌菌丝不规则生长，孢子表面凹陷且皱缩。可能原因为紫苏醛破坏了炭黑曲霉和交链孢菌的细胞壁和细胞膜系统，导致菌丝生长和孢子萌发受阻。
43.实施例3
44.抑制剂对葡萄果实中ota毒素产生的抑制作用
45.本实施例提供本发明的抑制剂，并进一步检测其对葡萄果实采后炭黑曲霉导致的病害及真菌毒素累积的抑制效果。
46.所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：将壳聚糖溶解在1％的醋酸水中形成壳聚糖溶液，在壳聚糖溶液中加入表面活性剂吐温80充分混匀，在搅拌下加入紫苏醛，充分混匀，然后在搅拌下缓慢加入交联剂三聚磷酸钠并充分混匀后形成稳定的白色乳状液(图4)。将所述抑制剂对炭黑曲霉的抑制效果进行检测，设置一组对照，每组抑制剂成分及质量分数比如下：
47.对照组：紫苏醛0份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.25份、水1000份。
48.处理组：紫苏醛0.6份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.25份、水1000份。
49.分别制备上述各组抑制剂并将洗净消毒后的葡萄浸泡2～5min，捞出晾干后，在果实表面穿刺并接种5μl炭黑曲霉孢子悬浮液(1
×
105个孢子ml-1
)，自然晾干后贮藏5天。贮藏结束后观察果实上的病斑形态并利用高效液相色谱测定病斑处ota毒素含量，明确紫苏醛对ota毒素的抑制效果，具体检测结果见图5。
50.如图5所示，葡萄果实上炭黑曲霉病斑形态见图5a。贮藏5天后病斑处ota毒素含量比对照组减少了93.9％(参见图5b)。
51.实施例4
52.抑制剂对番茄果实中aoh毒素产生的抑制作用
53.本实施例提供本发明的抑制剂，并进一步检测其对番茄果实采后黑斑病和aoh毒素累积的抑制效果。
54.所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：将壳聚糖溶解在1％的醋酸水中形成壳聚糖溶液，在壳聚糖溶液中加入表面活性剂吐温80充分混匀，在搅拌下加入紫苏醛，充分混
匀，然后在搅拌下缓慢加入交联剂三聚磷酸钠并充分混匀后形成稳定的白色乳状液(图4)。将所述抑制剂对交链孢菌的抑制效果进行检测，设置一组对照，每组抑制剂成分及质量分数比如下：
55.对照组：紫苏醛0份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.25份、水1000份。
56.处理组：紫苏醛0.6份、包埋剂0.75份、表面活性剂4.5份、交联剂0.25份、水1000份。
57.分别制备上述各组抑制剂并将洗净消毒后的番茄浸泡10min，捞出晾干后，在果实表面穿刺并接种10μl交链孢菌孢子悬浮液(1
×
105个孢子ml-1
)，自然晾干后贮藏10天。贮藏结束后观察番茄果实上的病斑形态并测定病斑处及周围外延1cm处组织中的aoh毒素含量，明确紫苏醛对aoh毒素的抑制效果，具体检测结果见图6。
58.如图6所示，番茄果实上交链孢菌病斑形态见图6a。贮藏10天后病斑处aoh毒素含量比对照组减少了82.7％；病斑周围外延1cm处组织中aoh毒素含量比对照组减少了73.7％(参见图6b)。
59.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
60.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。