一种昆虫抗菌肽重组蛋白在制备水产养殖用免疫增强饲料添加剂中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学、酶学、生物工程，具体涉及一种昆虫抗菌肽重组蛋白在制备水产养殖用免疫增强饲料添加剂中的应用。

背景技术：

1、海参做为我国传统的名贵海珍品，有着很高的食用价值和药用价值，深受人们喜爱，是我国北方重要的水产经济动物之一。近年来随着市场需求的增加养殖规格也不断扩大，取得了显著的经济和社会效益[《2019中国渔业统计年鉴》,2020(03):2]。规模的扩大使得养殖过程中伴随的病害问题也越来越突显，严重制约了海参养殖行业的稳定发展。目前，常规的治疗和干预手段仍然是使用抗生素类药物，虽然这对应对疾病，保障海参产品数量上的稳定供应起到了一定的作用。但此类药物的超量、超范围的长期使用，势必会带来养殖水体污染，海参品质下降及药物残留等一系列环境和食品安全问题[于东祥等.《海参健康养殖技术》,2010]。使用抗生素类药物既牺牲掉了海参养殖行业的可持续能力，也不符合绿色、健康、环保的发展理念，从长远来看得不偿失。寻找一种无害、无残留、安全高效的海参免疫增强方式，对于海参养殖行业来说是个亟待解决的问题。

2、抗菌肽是生物体内一种重要的非特异性免疫因子，广泛的存在于自然界中各种动植物和微生物体内，对生物的免疫防御有着重要意义。研究发现，抗菌肽可以作用在致病菌细胞膜上，使膜蛋白凝聚、失活，从而改变细胞膜的通透性，形成离子通道，导致细胞内容物外泄而杀死致病菌[huang h w.bio-chemistry,2000,39:8347-8352]。抗菌肽分子量小、抗菌谱广泛、作用迅速、对哺乳动物细胞不敏感、对温度和ph变化具有较好的耐受性[haine,e.r.,et al.,science 2008,322(5905),1257-9]。同时，抗菌肽与现有的抗生素在杀菌机理上也完全不同，不易产生抗药性菌株，使用安全性更高[pandey,b.k.,et al.,biochem j2011,436(3),609-20]。另外，抗菌肽还普遍被认为具有抗病毒和增强免疫力的作用，且对人和动物无毒副作用。诸多优点使抗菌肽被视为抗生素的优良替代品，是一类很有发展前途的新型抗菌药物。将其应用在海参养殖中，对于减少病害发生，提升海参品质，改善养殖环境，降低抗生素类药物的使用有重要的意义，有益于海参的健康绿色养殖。[rong y.etal.,biotechnology information,2005,13(2):1-366]。

3、现已发现的抗菌肽主要可分为cecropins、attacins、moricins、drosocins、defensins等几类[boman,h.g.,j intern med 2003,254(3),197-215；zasloff,m.,nature2002,415(6870),389-95]。1995年在研究家蚕血淋巴对金黄色葡萄球菌的抑制作用时发现了moricin蛋白，由于它表现出了对革兰氏阴性菌更高的抑制活性，一经发现就备受关注[hara,s.et al.,j biol chem 1995,270(50),29923-7；meister,m.et al.,bioessays1997,19(11),1019-26]。随着研究的深入，有越来越多不同亚型的moricin被陆续发现，如：moricin a1，moricin b2，moricin b3等，逐渐形成了一个新的抗菌肽家族[oizumi,y.,et al.,biochim biophys acta 2005,1752(1),83-92]。

4、天然的抗菌肽获取困难，通常利用化学合成或工程菌表达制备。其中化学合成多采用多肽固相合成法。该方法成本高、稳定性差，合成过程中使用的dcm、dmf、哌啶等有机试剂用量大、毒性高，对周边环境有污染。而且合成的多肽产品很可能会有药物残留，存在着使用风险[陈心等,《生物技术》2006,16(1),81-83]。在利用工程菌制备抗菌肽的方法中，受限于抗菌肽蛋白对宿主的抑制作用或表达产量等问题，抗菌肽的稳定性、活性及安全性得不到保证，不利于大规模应用[冯兴军等，《中国生物工程杂志》2006,26(03),68-72]。

5、柞蚕核型多角体病毒载体表达系统是以柞蚕核型多角体病毒为表达载体，以柞蚕蛹为生物反应器进行外源蛋白的一种杆状病毒表达体系，具有外源蛋白表达量高、生物安全性好、重组蛋白通常具有自然的折叠构象和适当的翻译后修饰等特点[叶博等,《蚕业科学》,2014,40(2):277-283]。使用这一系统表达外源蛋白不需要进行较高成本的昆虫细胞培养和繁琐的昆虫幼虫饲喂过程，也省去工程菌高密度发酵表达所需的生产和设备成本，适用于目标蛋白的大规模制备。同时做为宿主的柞蚕蛹在生产重组蛋白的同时也可为海参生长提供优质的昆虫蛋白，有利于在养殖行业上使用。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种昆虫抗菌肽重组蛋白在制备水产养殖用免疫增强饲料添加剂中的应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种昆虫抗菌肽重组蛋白在制备水产养殖用免疫增强饲料添加剂中的应用，所述昆虫抗菌肽重组蛋白为如seq id no.1所示氨基酸的柞蚕抗菌肽通过表达系统在柞蚕蛹体内表达制备得到，所述表达系统为柞蚕核型多角体病毒载体表达系统；所述应用包括抵抗水产生物致病菌。

4、进一步地，所述水产生物包括海参；所述水产生物致病菌包括：弧菌属致病菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌中的一种或两种以上。

5、进一步地，所述弧菌属致病菌包括溶藻弧菌、河流弧菌、副溶血性弧菌或海洋致病弧菌中的一种或两种以上。

6、进一步地，所述饲料添加剂中包括吸附剂和填充剂，所述吸附剂和填充剂用于吸附包埋所述昆虫抗菌肽重组蛋白。

7、进一步地，所述的吸附剂为硅藻土、沸石粉、活性炭中的一种或两种以上的混合物，所述填充剂为玉米淀粉、木薯淀粉、麦芽糊精中的一种或两种以上的混合物。

8、进一步地，所述填充剂为玉米淀粉、木薯淀粉和麦芽糊精的混合物时，玉米淀粉、木薯淀粉与麦芽糊精的质量比为0.5～7：0.5～5：0.5～3。

9、进一步地，所述饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：将表达昆虫抗菌肽重组蛋白的柞蚕蛹匀浆处理，滤去不溶物；按照柞蚕蛹匀浆液与吸附剂的比例为0.5～5：1(v/m)，将柞蚕蛹匀浆液加至吸附剂中，搅匀后静置；吸附结束后再添加1-2倍质量的吸附剂，搅匀后冷藏；向混合物中添加填充剂，搅匀，实现对昆虫抗菌肽重组蛋白的包埋，即得。

10、进一步地，所述填充剂占吸附剂与柞蚕蛹匀浆的重量的10～50％。

11、进一步地，所述饲料添加剂以1％～10％的质量百分比添加至水产生物的饲料中，或者制成颗粒饲料投喂。

12、进一步地，所述饲料添加剂适用于水产生物生长过程的每个时期，用于提升饲料营养，增加海参体重，增强海参在养殖过程中对水产养殖致病菌的抵抗能力。

13、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

14、1.本发明首次利用柞蚕核型多角体病毒载体表达系统在柞蚕蛹体内表达抗菌肽moricin c4重组蛋白。该方法适用于抗菌肽重组蛋白的大规模制备，无需使用化学合成的药品，也无需采购工程菌表达所用的高密度发酵设备和培养基，柞蚕蛹感染重组病毒后恒温静置即可。它的公布对于丰富这类抗菌蛋白的获取途径、降低其使用成本，开发针对性产品，特别是在水产养殖上应用具有重要意义，对未来开展功能性重组蛋白产品的应用开发也具有参考的价值。

15、2.本发明将表达抗菌肽moricin c4重组蛋白的柞蚕蛹进行匀浆处理后应用于海参饲料中，除其中的抗菌肽蛋白可为海参对抗病原物侵害提供免疫保护外，做为宿主的柞蚕蛹还富含优质昆虫蛋白和多种不饱和脂肪酸，这些物质可以丰富饲料中蛋白质的种类和数量。对于改善饲料品质，增加海参营养，促进其生长发育具有积极的作用。

16、3.本发明提供了一种方便柞蚕蛹匀浆后的蛋白原料在海参养殖上使用的加工方法。通过柞蚕蛹匀浆液与适当比例的吸附剂和填充剂按顺序和比例依次混合，实现了对抗菌肽重组蛋白和宿主昆虫蛋白的吸附包埋保护。此方法无需对样品进行冷冻或喷雾干燥处理，大幅节省了时间和人工成本，也减少了能源消耗，低碳环保。经包埋处理，有利于增强液态的蛋白原料在固态饲料中使用的可操作性，也方便添加剂的存储和运输。投喂时包埋后样品可快速沉降在水底，方便海参摄食，也可延缓抗菌肽蛋白在水中的释放时间，降低溶失率，减少浪费。

17、4.本发明对于减少海参养殖过程中病害发生，提升产量和品质，改善养殖环境，降低抗生素类药物使用，开发针对养殖中的致病菌，特别是弧菌属致病菌的抗菌药物具有重要的意义。