一种具有抗氧化活性的天麻发酵产物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及植物发酵物领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的天麻发酵产物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.天麻是兰科植物天麻的干燥块茎，是国家卫生部批准的保健食品原料，具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络的功效。天麻主要化学成分为天麻素、对羟基苯甲醇等酚类化合物和天麻多糖、胡萝卜素、枸橼酸以及多种微量元素，其主要活性物质为天麻素。研究表明，天麻素具有抗氧自由基、镇静镇痛、抗脑损伤、保护心血管、改善肠道吸收、提高机体体液免疫等多种药理活性。
3.天麻中富含的活性成分天麻素及对羟基苯甲醇可通过氢离子转移阻断氧化链反应以及激活erk2/1-nrf2通路,上调过氧化氢酶(cat)和超氧化物歧化酶的活性(sod)来达到抗氧化作用。天麻的功效需要经过炮制才能显现，而传统的炮制工艺需要蒸制、烘干、整形回汗3—4次。工艺繁琐且需要耗费大量的能量，而且炮制工艺制备的天麻产品风味特殊，有明显的中药味。另外野生天麻有尿臭味，而人工种植天麻口感微酸且带苦味，直接食用口感不佳，令消费者也难以接受，故在进行以天麻为原料的产品开发中需要进行其他处理。
4.酵素是以蔬果、糙米、药食同源中药等植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制备的含有特定生物活性成分产品的总称。这些活性物质包括脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶等酶类以及乳酸、醋酸等有机酸，还含有酚类、黄酮类和多肽等生物活性成分。具有清除自由基、抗氧化、抑菌、解酒护肝、润肠通便、调节免疫、促进新陈代谢及净化血液等生理功能。


技术实现要素：

5.针对目前天麻原料在综合开发过程中因存在较差适口性、抗氧化性能较差的技术问题，本发明提供一种天麻发酵产物及其制备方法。
6.本发明中的天麻发酵产物是以天麻为原料，经过包含酶解、发酵、过滤得到天麻酵素产品，并对天麻酵素产品关键活性成分进行定量控制。本方法通过酶解处理首先改善了天麻产品的口感，提高活性组分提取率，其次通过调控发酵定向富集了天麻素等活性成分，实现产品功效品质的稳定可控。
7.本发明提供一种天麻发酵产物，以质量百分比计，所述发酵产物中含有天麻素0.62-0.68wt％、谷氨酸4.5-5.5wt％，丙氨酸2.9-3.5wt％和组氨酸3.1-4wt％。
8.优选地，以质量百分比计，所述发酵产物中含有天麻素0.67-0.68wt％、谷氨酸5.1-5.2wt％，丙氨酸3.4-3.5wt％和组氨酸3.9-4wt％。
9.优选地，所述发酵产物的乙醇含量为0.25-0.5wt％。
10.优选地，以质量百分比计，所述发酵产物中，以乳酸计，总酸含量为2.2-2.7％；
11.优选地，所述发酵产物的ph值为3.6-4.0。
12.优选地，以质量百分比计，所述发酵产物的对羟基苯甲醇含量为1.12-1.21wt％。
13.优选地，以质量百分比计，所述发酵产物中还含有苏氨酸0.27-0.3％，丝氨酸0.5-0.65％，甘氨酸0.7-1.2％，丙氨酸2.9-3.5wt％，组氨酸3.1-4wt％，天冬氨酸0.8-1.2％，谷氨酸4.5-5.5wt％，赖氨酸0.5-1.2％，酪氨酸0.6-0.8％和苯丙氨酸0.7-1.2％。
14.本发明提供所述的天麻发酵产物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
15.将天麻粉与水混匀得到混合液，加入酶制剂进行酶解，然后加入菌剂发酵20-25天后得到所述发酵产物；
16.所述酶制剂为质量比为1-2:1-2:1的纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶。
17.优选地，所述天麻粉与水的质量比为1:5-10。
18.优选地，酶解反应温度为50℃-55℃，
19.优选地，酶解反应ph值为5.5-6.5；
20.优选地，酶解反应时间为3-5h。
21.优选地，加入酶制剂的质量为混合液质量的1％-1.5％。
22.优选地，酶制剂为质量比为2:1:1的纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶。
23.优选地，酶解后的溶液灭菌后加入菌剂。
24.优选地，加入菌剂前还包含加入碳源，
25.优选地，加入碳源的质量为混合液质量的10％-15％；
26.优选地，所述碳源为蔗糖。
27.优选地，所述菌剂加入的质量为混合液质量的1％-2％。
28.优选地，发酵温度为35℃-40℃；
29.优选地，发酵方式为厌氧发酵。
30.优选地，发酵菌剂包含酵母菌和乳杆菌，优选地，酵母菌和乳杆菌的质量比为2:3；
31.优选地，酵母菌为酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母中的一种或两种以上的组合；
32.优选地，乳杆菌为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌中的一种或两种以上的组合。
33.优选地，所述制备方法还包括过滤过程；
34.优选地，将发酵后的溶液循环经过150-300目板框过滤，直至溶液澄清。
35.本发明还提供所述的发酵产物或所述的制备方法制备得到的发酵产物在饮品、皮肤美白产品、化妆品和日化洗护中的应用。
36.天麻通过微生物发酵处理，不仅能让天麻的功效物质得以显现，而且发酵过程中还会进一步丰富功能性组分的种类，且有效的改善了天麻的口感问题，便于消费者接受。
37.本发明提供的天麻发酵产物口感较好。天麻中存在的醚类物质以及所含的精氨酸(4.88％)和缬氨酸(4.05％)等苦味氨基酸、苦味肽类物质，导致了天麻气味和较差适口性。而本方法中联合蛋白酶解预处理及益生菌发酵环节将这些氨基酸和苦味肽进行生物转化，使鲜味和甜味组分增加，如谷氨酸(5.19％)、丙氨酸(3.40％)和组氨酸(3.96％)等，显著改善天麻呈味性。另外发酵环节还可使醚类物质减少，醇类和酯类物质增加，消除了天麻原料中药味以及尿臭味，提高适口性，且具有怡人的芳香气味。
38.本发明提供的天麻发酵产物天麻素等活性成分高、抗氧化活性显著，且口感适宜，适用于商业化综合开发价值及易实现工业化生产。
39.本发明提供的天麻发酵产物的制备方法，对天麻进行微粉碎和酶解处理，能有效的破坏天麻细胞壁，软化细胞组织，使天麻中的活性物质更好的溶出，最大程度的提取活性物质；另外酶解可将大分子纤维素、蛋白等有机物转化为可发酵性营养源，为益生菌发酵提供可直接吸收的营养源，促进快速生长，缩短发酵周期。
40.本方法相较于现有的天麻直接发酵、天麻浸提后再发酵等方法，工艺路线简明，酵素制备周期短。
具体实施方式
41.本发明提供一种天麻素等活性成分高、抗氧化活性显著，且口感适宜的天麻发酵产物。
42.本发明提供的天麻发酵产物，以质量百分比计，所述发酵产物中含有天麻素0.62-0.68wt％、谷氨酸4.5-5.5wt％，丙氨酸2.9-3.5wt％和组氨酸3.1-4wt％。
43.本发明中所用的试剂及仪器来源信息如下表1所示。
44.表1
[0045][0046]
克鲁维酵母kw-6(kluyveromyces marxious kw-6)于2020年06月02日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m 2020173，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。该菌株在现有技术cn114107082a中记载。
[0047]
植物乳杆菌s2菌株(lactobacillus plantarum s2)于2021年4月8日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m 2021340，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。该菌株在现有技术cn113755360a中记载。
[0048]
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制。
[0049]
实施例1
[0050]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过80目筛网，得到天麻粉。
[0051]
酶解：取1kg的天麻粉，加入5倍的水搅拌混匀得到混合液，升温至50℃，调节ph5.5，加入质量为混合液总质量1％的混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝1:1:1)，酶解3h。
[0052]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入质量为混合液总质量10％的蔗糖，并接入质量为混合液总质量2％发酵菌剂(质量比，耐高温酿酒酵母：嗜酸乳杆菌d24673：植物乳杆菌s2菌株：双歧杆菌d51579＝2：1：1：1)混匀。40℃密封发酵20天。
[0053]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过150目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0054]
实施例2
[0055]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0056]
酶解：取1kg的天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀得到混合液，升温至50℃，调节ph6.0，加入质量为混合液总质量1.2％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0057]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入质量为混合液总质量10％的蔗糖，并接入质量为混合液总质量1.5％发酵菌剂(质量比，的克鲁维酵母kw-6：嗜酸乳杆菌d24673：植物乳杆菌s2菌株：双歧杆菌d51579＝2：1：1：1)混匀。35℃密封发酵25天。
[0058]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0059]
实施例3
[0060]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0061]
酶解：取一定量的天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀得到混合液，升温至55℃，调节ph6.5，加入质量为混合液总质量1.5％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解4h。
[0062]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入质量为混合液总质量15％的蔗糖，并接入质量为混合液总质量1％发酵菌剂(质量比，马克斯克鲁维酵母：嗜酸乳杆菌：植物乳杆菌：双歧杆菌＝2：1：1：1)混匀。35℃密封发酵20天。
[0063]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过300目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0064]
对比例1
[0065]
鲜天麻切片后放入罐中，采用一层天麻片一层蔗糖的填装方法，八层纱布封住罐口，室温通风处发酵1个月，然后密封罐口，室温发酵6个月，最后过滤澄清得到天麻酵素。
[0066]
对比例2
[0067]
天麻粉碎后过200目筛得到天麻粉，然后称取1kg的天麻粉加入10倍纯水，在60℃、ph6.0的条件下浸提2小时，离心得到浸提液，将浸提步骤重复一次。然后将两次的浸提液混合并加入15％蔗糖搅拌均匀，灭菌后冷却至室温，接入1％复合菌剂(质量比，酵母菌:乳酸菌＝1:1)，35℃密封发酵5天，板框过滤后灭菌罐装得到天麻酵素。
[0068]
对比例3
[0069]
鲜天麻和5倍的纯水混合匀浆，升温至50℃后加入1％复合酶(质量比，纤维素酶:
果胶酶＝1:1)进行酶解，酶解作用时间3h。然后在酶解液中加入15％蔗糖搅拌均匀，灭菌后冷却至室温，接入1％复合菌剂(质量比，酵母菌:乳酸菌＝1:1)，35℃发酵60天，板框过滤后灭菌罐装得到天麻酵素。
[0070]
对比例4
[0071]
鲜天麻和5倍的纯水混合匀浆，升温至50℃后加入1％复合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:淀粉酶＝1:1:1)进行酶解，酶解作用时间3h。然后在酶解液中加入15％蔗糖搅拌均匀，灭菌后冷却至室温，接入1％复合菌剂(质量比，酵母菌:乳酸菌＝1:1)，35℃发酵60天，板框过滤后灭菌罐装得到天麻酵素。
[0072]
对比例5
[0073]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0074]
酶解：取1kg的天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀，升温至50℃，调节ph6.0，加入0.5％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0075]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入10％的蔗糖，并接入质量比1.5％发酵菌剂(质量比，酵母菌:乳酸菌＝1:1)混匀。35℃密封发酵25天。
[0076]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0077]
对比例6
[0078]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0079]
酶解：取1kg的天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀，升温至50℃，调节ph6.0，加入1.2％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0080]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入10％的蔗糖，并接入质量比1.5％植物乳杆菌混匀。35℃密封发酵25天。
[0081]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0082]
对比例7
[0083]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0084]
酶解：取1kg的天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀，升温至50℃，调节ph6.0，加入1.2％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0085]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入10％的蔗糖，并接入质量比1.5％混合菌剂(质量比，植物乳杆菌:醋酸菌＝1:1)混匀。35℃密封发酵25天。
[0086]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0087]
对比例8
[0088]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0089]
酶解：取1kg天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀，升温至50℃，调节ph6.0，加入1.2％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0090]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入10％的蔗糖，并接入质量比1.5％混合菌剂(质量比，植物乳杆菌:酵母菌:醋酸菌＝1:1:1)混匀。35℃密封发酵25天。
[0091]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐
装，得到天麻酵素。
[0092]
对比例9
[0093]
原料预处理：鲜天麻切片后烘干，然后粉碎机粉碎，过100目筛网，得到天麻粉。
[0094]
酶解：取1kg天麻粉，加入10倍的水搅拌混匀，升温至50℃，调节ph6.0，加入1.2％混合酶(质量比，纤维素酶:果胶酶:木瓜蛋白酶＝2:1:1)，酶解3h。
[0095]
发酵：将酶解后的溶液灭菌后冷却至35℃，加入10％的蔗糖，并接入质量比3％混合菌剂(质量比，植物乳杆菌:酵母菌:醋酸菌＝1:1:1)混匀。35℃密封发酵25天。
[0096]
过滤罐装：将发酵后的溶液循环经过200目板框过滤，直至溶液澄清，然后灭菌罐装，得到天麻酵素。
[0097]
检测发酵前的天麻以及实施例1-3、对比例1-9得到的天麻酵素中游离氨基酸含量，以及检测实施例1-3、对比例1-9得到的天麻酵素的ph值、乙醇含量、天麻素含量和对羟基苯甲醇含量。天麻素和对羟基苯甲醇的检测方法依照《中国药典》rp-hplc法。检测结果如表3和表4所示。
[0098]
游离氨基酸检测：
[0099]
称取试样0.5g～1g(精确到0.001g)，置于50ml容量瓶中。加入20ml磺基水杨酸超声至充分溶解后，定容至50ml刻度，充分混匀，静置1h后准确吸取上清液1ml于25ml容量瓶中，加入柠檬酸钠缓冲液定容至刻度，混匀后经0.45μm微孔滤膜过滤至进样瓶，采用氨基酸自动分析仪检测。
[0100]
感官评价：
[0101]
随机选取40人按下表2所示感官评价标准进行评分。
[0102]
表2
[0103][0104]
[0105]
表3所示为实施例1-3、对比例1-9得到的天麻酵素中游离氨基酸含量。
[0106]
表3
[0107]
[0108][0109]
下表4所示为实施例1-3和对比例1-9中得到的天麻酵素的ph值、乙醇含量、总酸含量、天麻素含量、对羟基苯甲醇含量和感官评价得分。
[0110]
表4检测结果
[0111][0112][0113]
通过上表4数据表明，本方法制备的天麻酵素产品ph和乙醇含量都符合行业标准(qb/t 5323-2018)。而对比例2和对比例3中的乙醇含量都不符合标准。对比各组产品的总
酸含量，对比例中的总酸含量整体比实施例偏高，会造成口感酸涩，需要进行后续口味调配。均达到药典标准(天麻素和对羟基苯甲醇的总量不得少于0.25％)，且该两种活性成分总和均高于对比例。且最优条件的实施例2中的天麻素和对羟基苯甲醇的总量最高，达到18.82mg/g。
[0114]
应用评价：
[0115]
对实施例1-3和对比例1-9进行抗氧化功效的相关指标检测，具体方法如下：
[0116]
1、dpph自由基清除能力测定
[0117]
分别将实施例1-3和对比例1-9制得的天麻酵素样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入1ml0.1mmol/l dpph-无水乙醇溶液，混匀，室温避光条件下反应30min，得样品液，测量其在波长517nm处的吸光值(记为a1)，空白组用无水乙醇代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用无水乙醇代替dpph-无水乙醇溶液，测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。dpph自由基清除率根据以下公式进行计算，检测结果如表5所示。
[0118]
dpph自由基清除率(％)＝[1-(a1
–
a2)/a0]
×
100
[0119]
2、超氧阴离子自由基清除能力测定
[0120]
分别将实施例1-3和对比例1-9制得的天麻酵素样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入5ml50mmol/l的tris-hcl缓冲液(ph8.2)，混均，在25℃的恒温水浴锅中水浴20min后，加入同样预温至25℃的0.4ml 25mmol/l的邻苯三酚溶液，混均后反应5min，最后加入0.5ml浓盐酸终止反应，得样品液，测试其在波长325nm处测吸光值(记为a1)。空白组用蒸馏水代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。超氧阴离子自由基清除率根据以下公式进行计算，检测结果如表5所示。
[0121]
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(a1
–
a2)/a0]
×
100
[0122]
3、羟基自由基清除能力测定
[0123]
分别将实施例1-3和对比例1-9制得的天麻酵素样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入1ml6mmol/l feso4溶液和1ml 2.4mmol/l h2o2溶液，混匀，反应10min后，再加入1ml 6mmol/l水杨酸溶液，在37℃条件下反应30min，得样品液，测定其在波长510nm下的吸光值(记为a1)。空白组用蒸馏水代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用蒸馏水代替h2o2溶液测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。羟基自由基清除率根据以下公式进行计算，检测结果如表5所示。
[0124]
羟基自由基清除率(％)＝[1
–
(a1
–
a2)/a0]
×
100
[0125]
4、超氧化物歧化酶(sod)活力测定
[0126]
分别实施例1-3和对比例1-9制得的天麻酵素样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释样，取1ml稀释样(v)，分别向其中加入15ml 0.05mol/l磷酸缓冲液(ph7.8)、3ml 130mmol/l甲硫氨酸溶液、3ml 750μmol/l nbt溶液、3ml 20μmol/l核黄素溶液、3ml100μmol/l edta-na2溶液和2ml的纯化水，混匀，在25℃、4500lx日光下反应20min，反应结束后用黑布遮住，终止反应。在560nm下测定反应液吸光度(记为a1)。空白组用磷酸缓冲液代替样品，一直置于黑暗中，用于检测调零。对照组用磷酸缓冲液代替样品，同样品一样置于日光下20min后黑布盖住，检测吸光度(记为a0)。超氧化物歧化酶活力根据以下公式进行计
算，检测结果如表5所示。
[0127]
超氧化物歧化酶酶活(u/ml)＝(a0-a1)/(0.5
×
a0
×
v)
[0128]
表5
[0129][0130][0131]
通过上述表5数据证明，4种抗氧化性能的特征指标整体水平优于对比例，且实施例2抗氧化效果最明显。证实了本发明制备的天麻酵素具备抗氧化功能。