一种抑制及清除单核细胞增生李斯特菌生物被膜的方法

本发明涉及食品微生物控制，具体涉及一种抑制及清除单核细胞增生李斯特菌生物被膜的方法。

背景技术：

1、单核细胞增生李斯特菌是一种威胁生命的食源性病原体，是一种常见于食品加工环境中的细菌病原体，可长期存在。单核细胞增生李斯特菌能够在生物和非生物表面形成生物被膜。在整个食品工业中，即使经过清洁和消毒程序，用于食品加工和处理的设备表面也会形成生物被膜。与浮游生物相比，生物被膜中细菌细胞的抵抗力更强，这主要是由于其分泌的胞外聚合物物质(eps)起到了支架的作用，可保护微生物细胞免受抗菌剂的侵袭。因此，传统的清洁和消毒操作往往无法有效清除生物被膜和消除生物被膜基质中的微生物。生物被膜基质主要由多糖、蛋白质和细胞外dna(edna)组成。

2、最近的研究表明，edna是生物被膜结构稳定性、细胞保护和致病性的关键组成部分。此外，即使抗菌剂能有效杀死生物被膜中的细胞而不破坏生物被膜结构，死亡的细胞仍能促进微生物细胞粘附和生物被膜再生。鉴于这些事实，近年来，研究人员越来越关注发现新型的单核细胞增生李斯特菌抗生物被膜制剂。

3、壳聚糖因其抗菌、抗氧化和螯合特性以及无毒性和生物相容性而广受欢迎。作为一种阳离子聚合物，壳聚糖能够穿透细胞屏障，流经上皮细胞内狭窄的细胞间连接，因此是纳米粒子的绝佳载体。它还对革兰氏阳性细菌(如单核细胞增生l.)具有广谱抗菌活性。nisin作为一种安全的抗菌剂，已被联合国粮食及农业组织(fao)/世界卫生组织(who)食品添加剂和配料委员会(ccai)批准用于食品中，并获得了美国食品和药物管理局的“公认安全”(gras)认证。尽管壳聚糖纳米颗粒对单核细胞增生李斯特菌的抗菌活性已经得到证实，但壳聚糖纳米颗粒对生物被膜灭活的有效性仍是未知数。考虑到edna是一种有效的抗生物被膜靶标，以生物被膜基质为靶标的纳米颗粒已在医学治疗领域得到确立；然而，壳聚糖纳米颗粒与dnase结合用于食品加工中的生物被膜控制效果尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抑制及清除单核细胞增生李斯特菌生物被膜的方法，解决以下技术问题：

2、怎样通过纳米粒子实现对食品接触表面单核细胞增生李斯特菌的有效控制。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

4、一种抑制及清除单核细胞增生李斯特菌生物被膜的方法，抑制及清除食品接触表面单核细胞增生李斯特菌生物被膜的纳米粒子包括：负载乳酸链球菌素(nisin)的壳聚糖纳米粒子(cs-n)、壳聚糖纳米粒子(csnps)、脱氧核糖核酸酶(dnase-i)功能化的负载乳酸链球菌素(nisin)的壳聚糖纳米粒子(dnase-cs-n)；

5、所述cs-n的制备方法包括：

6、将0.05-0.15g壳聚糖粉末溶解到浓度为1％冰醋酸中，持续搅拌过夜，形成浓度为0.5-1.5mg/ml壳聚糖溶液，并将壳聚糖溶液的ph值调至4.0-6.0；将浓度为0.3-0.5mg/ml焦磷酸硫胺素(tpp)和0.5-1.5mg/ml nisin分别溶解于100-300ml超纯水中，以规格为0.1-0.45μm的滤膜分别过滤上述三种溶液，除去杂质，备用；

7、在250-350r/min的磁力转速下将40-60ml nisin溶液滴加到40-60ml tpp溶液中搅拌25-45min形成混合物；并将混合物滴加到90-110ml壳聚糖溶液中在磁力转速为150-250r/min，转动0.5-1.5h，其中，cs和tpp质量比为5:1-3；在温度3-5℃、转速12,000-14,000rpm下离心25-45min收集纳米颗粒，弃去上清液，沉淀物用超纯水洗涤数次，然后分散在蒸馏水中，用功率为60w超声波细胞破碎机以5s超声和5s秒静止的顺序处理重复36次，获得cs-n。

8、优选地，所述dnase-cs-n的制备方法包括：

9、通过离子交联将nisin包裹到壳聚糖纳米颗粒中形成优化后的cs-n，将浓度为100-300μg/ml dnase-i与优化后的cs-n分别在0.1medc和0.1m nhs溶液进行进一步混合30min，形成在壳聚糖上的游离氨基和dnase-i的羧基之间形成酰胺共价键的混合液，备用；

10、将形成酰胺共价键的混合液溶解在1％浓度的冰醋酸中，持续搅拌过夜，形成浓度为0.5-1.5mg/ml酰胺共价键的混合液的溶液，并将酰胺共价键的混合液的溶液ph值调至4.0-6.0；将浓度为0.3-0.5mg/ml焦磷酸硫胺素(tpp)和0.5-1.5mg/ml nisin分别溶解于100-300ml超纯水中，以规格为0.1-0.45μm的滤膜分别过滤上述三种溶液，除去杂质，备用；

11、在250-350r/min的磁力转速下将40-60ml nisin溶液滴加到40-60ml tpp溶液中搅拌25-45min形成混合物；并将混合物滴加到90-110ml形成酰胺共价键的混合液的溶液中，并在磁力转速为250-350r/min，转动0.5-1.5h，其中，dnase-cs和tpp质量比为5:1-3；在温度3-5℃、转速12,000-14,000rpm下离心25-45min收集纳米颗粒，弃去上清液，沉淀物用超纯水洗涤数次，然后分散在蒸馏水中，用功率为60w超声波细胞破碎机以5s超声和5s秒静止的顺序处理重复36次，获得dnase-cs-n。

12、优选地，所述csnps的制备方法包括：

13、将0.05-0.15g壳聚糖粉末溶解在浓度为1％的冰醋酸中，持续搅拌过夜，形成浓度为0.5-1.5mg/ml壳聚糖溶液，并将壳聚糖溶液的ph值调至4.0-6.0；将浓度为0.3-0.5mg/ml焦磷酸硫胺素(tpp)和0.5-1.5mg/ml超纯水分别溶解于100-300ml超纯水中，以规格为0.1-0.45μm的滤膜分别过滤上述三种溶液，除去杂质，备用；

14、在250-350r/min的磁力转速下将40-60ml超纯水溶液滴加到40-60ml tpp溶液中搅拌25-45min形成混合物；并将混合物滴加到90-110ml壳聚糖溶液中在磁力转速为150-250r/min，转动0.5-1.5h，其中，cs和tpp质量比为5:1-3；在温度3-5℃、转速12,000-14,00rpm下离心25-45min收集纳米颗粒，弃去上清液，沉淀物用超纯水洗涤数次，然后分散在蒸馏水中，用功率为60w超声波细胞破碎机以5s超声和5s秒静止的顺序处理重复36次，获得csnps。

15、优选地，所述壳聚糖粉末与冰醋酸的质量比为0.1:1-1.5。

16、优选地，所述csnps、cs-n、dnase-cs-n对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度(mic)的测定步骤包括：

17、s11、从低温冰箱将单核细胞增生李斯特菌接种到mhb液体培养基中，在温度为30-40℃，培养时间为12-36h培养两代后，在mha固体培养基上划板活化，继续在30-40℃培养12-36h；

18、s12、挑取单菌落于5-15ml液体培养基，30-40℃培养12-36h，得到细菌培养液；

19、s13、用mhb肉汤进行二倍稀释，在试管中制备1ml浓度为0-2.56mg/ml的纳米粒子；

20、s14、将细菌培养液经mhb肉汤稀释至0.5-1.5×105cfu/ml，将稀释后的1ml浓度为0.5-1.5×105cfu/ml的细菌悬浮液接种到含有浓度为0-2.56mg/ml纳米粒子样品的mhb肉汤中，置于30-40℃培养12-36h；

21、s15、根据肉眼判断抑制细菌生长的最低浓度定义为mic，计算csnps、cs-n、dnase-cs-n三种纳米粒子的mic值。

22、优选地，所述csnps、cs-n、dnase-cs-n对单核细胞增生李斯特菌生物被膜的抑制作用的步骤包括：

23、s21、从低温冰箱将单核细胞增生李斯特菌接种到mhb液体培养基中，在温度为30-40℃，培养时间为12-36h培养两代后，在mha固体培养基上划板活化，继续在30-40℃培养12-36h；

24、s22、挑取单菌落于5-15ml液体培养基，30-40℃培养12-36h，并稀释至约0.5-1.5×105cfu/ml，得到细菌培养液；

25、s23、在24孔板中，加入400-600ul浓度为0-2.56mg/ml的纳米粒子，再加入400-600ul细菌培养液；

26、s24、摇晃24孔板将材料混匀，取规格为1×1×0.1cm的不同材料的小方片放入孔中，置于30-40℃培养36-60h。

27、s25、用生理盐水清洗小方片三次，置于装有5-15ml生理盐水的15ml离心管中，以30-50khz超声2-4min，用力涡旋20-40s；

28、s26、将脱落的生物膜细胞悬浮液进行稀释并以适当的稀释度平铺在tsa培养基平板上；将tsa培养基平板在30-40℃培养12-36h，进行菌落计数。

29、优选地，所述csnps、cs-n、dnase-cs-n对单核细胞增生李斯特菌生物被膜的清除作用包括：

30、s31、将单核细胞增生李斯特菌从低温冰箱接种到tsb液体培养基，在温度为30-40℃，培养时间为12-36h培养两代后，在tsa固体培养基上划板活化，在30-40℃培养12-36h；

31、s32、挑取单菌落于5-15ml液体培养基，30-40℃培养12-36h，并稀释至约0.5-1.5×105cfu/ml，得到细菌培养液；

32、s33、在24孔板中，加入500ultsb，再加入500ul细菌培养液，将材料混匀，取规格为1×1×0.1cm的不同材料的小方片放入孔中，置于30-40℃培养36-60h。

33、s34、在24孔板中，加入400-600ul浓度为0-5.12mg/ml的纳米粒子，再加入400-600ulpbs溶液轻轻摇晃备用，用生理盐水清洗小方片三次，以洗去小方片上的浮游细菌，将清洗后的小方片转移到24孔板中，置于30-40℃培养6-24h。

34、s35、用生理盐水清洗小方片三次，以洗去小方片上的浮游细菌，置于装有5-15ml生理盐水的15ml离心管中，以30-50khz超声2-4min，用力涡旋20-40s；

35、s36、将脱落的生物膜细胞悬浮液进行稀释并以适当的稀释度平铺在tsa培养基平板上，将tsa培养基平板在30-40℃培养12-36h，进行菌落计数。

36、本发明的有益效果：

37、(1)本发明经过制备负载乳酸链球菌素(nisin)的壳聚糖纳米粒子(cs-n)、壳聚糖纳米粒子(csnps)、脱氧核糖核酸酶(dnase-i)功能化的负载乳酸链球菌素(nisin)的壳聚糖纳米粒子(dnase-cs-n)，三种粒子，通过平板计数法评价不同纳米粒子对单核细胞增生李斯特菌生物被膜的抑制作用和清除作用；分析发现经过三种纳米粒子的处理，dnase-cs-n纳米粒子在三种材料中均有最大生物膜去除量，制备的dnase-cs-n纳米粒子能有效去除不同材料上已形成的生物膜。

38、(2)本发明本发明中所用乳酸链球菌素、壳聚糖、三聚磷酸钠是我国批准使用的食品添加剂，脱氧核糖核酸酶是商业化的酶制剂，具有专一、高效、无污染的优势；dnase-cs-n对单核细胞增生李斯特菌生物被膜抑制率和清除率有显著作用，并且这种抑制和清除作用随着纳米粒子浓度的增加而增大。

39、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。