专利名称：一种云芝糖肽(psp)的生产方法
技术领域：
本发明涉及的是一种云芝糖肽(Polysaccharide-pepetideofCoriodevorsicolor简称PSP)的生产方法。
自七十年代起，各国对真菌多糖及其生产方法研究甚多。研究成果表明，在担子菌纲多孔菌科中有众多的属、种能提取到具有抗癌活性的多糖。在1985年召开的第14届国际化疗会议上，属于这类抗癌多糖的研究文献就有68篇。查阅文献，已报导的专利共6篇。其中4篇涉及云芝菌株特性及培养基碳氮源比例与菌丝体产量的关系;涉及到从云芝深层培养菌丝体中提取抗癌多糖的专利有1977年的美国4051314专利和1981年的美国4289688专利2篇。其中，美国4051314专利的云芝深层培养基的碳源为麦芽膏，培养时间240小时，制得的有效成份是葡聚糖(Glucan);美国4289688专利介绍的云芝深层培养基的氮源为蛋白胨和酵母膏，但由于采用静止培养，培养时间需要600小时(25天)，其有效成份结合蛋白多糖(Proteinboundpolysaccharide)的提取采用硫酸铵盐析法，该产物抑制的瘤谱为动物Sarcoma-180和Ehrlich细胞。分析上述两项专利，尚存在以下不足之处培养时间长、培养基配方成本高、提取物抑瘤谱窄，也未见对人体癌细胞的抑癌作用。
本发明旨在创造一种发酵时间短、培养基成本低廉、菌丝体内B组分高的云芝糖肽(PSP)的生产方法，从而获得一种具有广泛抑制人癌细胞与提高机体免疫功能的无毒免疫调节剂-云芝糖肽(PSP)。
本发明方法采用如下技术、步骤实现发明任务。
一、菌株的选育与特征本发明使用的菌株是从中国吉林、湖南、四川、广东、福建、云南、浙江、上海等地分离和蒐集的46株云芝(Coriolusversicolor)中经筛选、驯化而得到的一株优良菌株，它特别适合于深层发酵，在培养过程中会散发出浓郁的水果香味。其沉没菌丝体不是丝状而呈球状。中国云芝菌株Cov-1对培养基的适应性强，可用廉价原料作碳、氮源。所产糖肽能直接抑制人癌细胞的增殖。
本发明使用的中国云芝菌株Cov-1，可用普通真菌筛选技术和液体深层培养、驯化技术在彩绒革盖菌〔Coriolusversicolor(Fr)Quel)中选育。
二、菌株的培养本发明采用三级通气发酵法生产云芝菌丝体，因而发酵周期短，每次生产只需48-72小时。与静止培养法比，不仅生产规模大，时间也缩短5～10倍。本技术的生产流程如下
种子罐、繁殖罐和发酵罐的投料量为70%，接种量为10%，罐温24-30℃，通气量1∶0.5～1∶1.0(V/V)，搅拌转速100～200rpm。发酵氮源不用蛋白胨和酵母膏，碳源也不用麦芽膏，而是选用黄豆饼粉、花生饼粉和糖蜜。种子罐和繁殖罐的发酵时间为48小时，发酵罐的发酵时间为60～72小时。
三、云芝糖肽(PSP)的提取从云芝菌丝体中提取抗癌多糖主要有盐析法(硫酸铵盐)和喷雾干燥法。前者需要经透析、脱盐，工艺复杂，不利于生产。后者方法虽简单，但所得产品因未经分离，成份混杂，糖肽含量低。本发明采用乙醇醇析法，即用1份云芝菌丝体热水提取浓缩液和3份95%食用乙醇，在0～4℃下沉淀8小时的方法提取云芝糖肽(PSP)。本方法简便，所得糖肽成份也较纯。
四、云芝糖肽(PSP)的药效试验及慢性毒性试验用上述发明方法获得的云芝糖肽(PSP)抗癌活性强，不仅能抑制动物肿瘤(Sarcoma-180、Ehrlich细胞)的生长，且能抑制人肺癌、胃癌、单核细胞白血病和淋巴瘤的增殖。用标记前体掺入法测试，云芝糖肽(PSP)能阻抑Ehrlich腹水癌细胞RNA和DNA的合成。用体外培养法试验证明，云芝糖肽(PSP)能直接使人肺癌细胞发生畸变，如细胞核肿大、多核、染色质凝集、核膜粗糙等。下表1列举了云芝糖肽(PSP)对人和动物肿瘤细胞的抑制率。
此外，用本方法获得的云芝糖肽(PSP)，还能明显地提高荷瘤机体的免疫球蛋白(IgG)、补体C3和血清溶血素(HC30)的含量。下表2列举了云芝糖肽(PSP)对荷瘤(S-180)小鼠免疫功能的影响。
表1.
PSP浓度作用时间肿瘤细胞抑制率%体外试验1mg/ml48小时人胃癌(7901)38.11mg/ml72小时人肺癌(CPC)39.41mg/ml72小时人淋巴瘤(SLY)39.51mg/ml72小时人白血病(MEL)63.51mg/ml72小时鼠白血病(P.388)96.32mg/ml60分钟Ehrlich腹水癌RNA合成80.32mg/ml120分钟Ehrlich腹水癌DNA合成38.5体内试验50μg/ml21天Sarcoma-18064(小鼠品(Cip×10)系、ICR)100μg/ml(PO×10)13天Sarcoma-18052表2.
IgG(μg/10ml) 补体C3(μg/10ml) 血清溶血素(HC30)对照18±373±18316±100加PSP(1mg/kg、PO×10) 21±1＊95±12＊422±55＊＊＊表示P＜0.01＊＊表示P＜0.05
云芝糖肽(PSP)对腹腔巨噬细胞的吞噬功能也有明显的促进作用。用注射环磷酰胺小鼠作试验，云芝糖肽(PSP)能抵抗由环磷酰胺引起的白血球降低和食欲减退的作用。用醋酸扭体法及热板法试验，云芝糖肽(PSP)有明显的镇痛效果。总之，用本方法获得的云芝糖肽(PSP)，不仅抑制人癌细胞增生，而且能降低和消除由化疗和放射治疗引起的毒副反应。
云芝糖肽(PSP)的产生菌为无毒的中国云芝菌株Cov-1，生产所用培养基和乙醇溶剂均无毒性，后处理中的丙酮和无水乙醚是极易挥发的物质，云芝糖肽的成品中不会残留。经用哺乳动物灵长目猴子作慢性毒性试验证明，大剂量服用PSP半年，动物均无毒性反应。长期服用PSP的病人证明，PSP不仅不会产生任何毒副反应，反而能增强病员机体的抗癌免疫能力。
本发明的一种云芝糖肽(PSP)的生产方法，能获得高活性的有抑制人癌细胞与提高负瘤机体免疫功能的云芝糖肽(PSP)，概括起来有以下六点特色和实用效果1.本发明的云芝糖肽(PSP)的生产方法，以中国云芝菌株Cov-1为菌种，采用通气发酵法，能在2-3天内培养大量云芝菌丝体，比静止培养法10-25天快5-8倍。
2.本发明采用黄豆饼粉、花生饼粉等廉价原料代替昂贵的蛋白胨、酵母膏作氮源，大大降低了生产成本。
3.本发明采用醇析法提取抗癌多糖，比用硫酸铵盐析法提取的工艺更为简化，比用喷雾干燥法所得的产品成份更纯。
4.本发明用Cov-1菌株生产的云芝糖肽(PSP)含有较多的B组分，不仅能抑制动物肿瘤细胞，而且能抑制人肺癌、胃癌、淋巴瘤及单核细胞白血球病等细胞的增生。
5.用本发明方法获得的云芝糖肽(PSP)能明显提高机体抗癌免疫能力，增强吞噬功能，提高耐缺氧能力，提高IgG、补体C3、溶血素HC30值及白血球数。
6.用本发明方法获得的云芝糖肽(PSP)，能明显降低化疗放疗引起的毒副反应，提高食欲，缓解疼痛，提高耐缺氧能力。
下面提供本发明方法的三个实施例，以进一步阐述发明方法的技术与步骤。
实施例1.
取用液氮保存的中国云芝Cov-1菌株，移植在PDA斜面培养基上，25℃培育10天。PDA配方如下马铃薯煮汁＊960ml葡萄糖20g琼脂20gpH6.5＊去皮马铃薯200g，加水煮沸5分钟后取汁。灭菌1.2kg/cm230分钟。
取斜面菌种，将中国云芝Cov-1菌株菌丝体移入装有100ml液体培养基的500ml三角瓶中，25℃下往复振荡5天，冲程4cm，振荡频率100rpm。将摇瓶培养物合并，以压差法移接入50～100ml种子罐中，罐内装量70%(V/V)，接种量10%(V/V)，通气培养2天后移入500L3～1000L3繁殖罐。繁殖罐菌丝长浓后，再以1∶10的体积比扩大繁殖到发酵罐。罐温24-30℃，通气量1∶1(V/V)，机械搅拌速度100～200rpm。
发酵培养基配方为糖蜜40g黄豆饼粉20gMgSO41.0gK2HPO41.0gCaCO35.0gVB11000μg水加至1000ml发酵罐繁殖60-72小时后，醪液经板框压滤，得云芝菌丝体滤饼。将滤饼加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加90～99℃热水回流浸取3-5小时，将浸取液再经真空薄膜浓缩，取1份浓缩液加3份95%乙醇，在0～4℃条件下醇析8小时。取醇析物加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝胶(Sephadex-G75)进行层析分离，收集既含多肽(用紫外230nm法测定)，又含多糖(用蒽酮法测定)的部分，再经真空浓缩和冷冻干燥后即可获得褐色粉末状的云芝糖肽(PSP)。
实施例2.
取矿油保存下的中国云芝Cov-1菌株，移植于GMY培养基上进行活化培养。GMY培养基配方
葡萄糖10g酵母膏4g麦芽汁(糖度16)110ml水加足至1000mlpH自然琼脂20g将在GMY培养基上活化的中国云芝Cov-1菌株的菌丝体移入内装50ml培养基的250ml三角瓶内，用旋转式摇瓶机培养4天，转速200rpm，随后扩大接种入血清瓶中，並通入无菌空气。通气量为1∶1(V/V)，25℃下培养3天后即可移入50-100L3的种子罐中，繁殖后再扩大培养于10t自吸式发酵罐中。
发酵培养基配方如下糖蜜3%葡萄糖1%花生饼粉2%K2HPO40.1%KH2PO40.1%MgSO40.1%通气发酵2.5天后，用离心法滤去醪液。将沉淀物烘干磨碎，加入100倍热水(90-95℃)，回流浸取4小时。将热水浸取物经浓缩后用加入3倍体积的95%乙醇，低温下醇析6小时，醇析物用无水丙酮洗涤3次，再用无水乙醚洗涤3次，于50℃下烘干。处理过的醇析物用薄层双板层析法检验(用茚三酮和茴香醛显色)，其多肽显示的Rf值应与多糖显示的Rf值相一致，证明所提取的云芝糖肽是连接着多肽的多糖体。
实施例3.
取低温保藏的中国云芝Cov-1斜面菌种一支，移入装有50ml麦芽汁培养基的1500ml培养瓶中，通气培养5天。其培养基配方为黄豆芽煮汁＊1000ml葡萄糖10gK2HPO40.5gKH2PO40.5gMgSO40.1gpH6.5＊用200g黄豆芽加水煮10分钟后取汁。
然后依次接入50ml种子罐、500ml繁殖罐及5吨发酵罐中通气培养2-3天。将发酵醪经压滤后收得的湿菌丝体用100℃热水浸取3小时。将浸取液直接通过超滤膜(10Kd)。在4kg/cm2氮气压力下滤除小于1万分子量的物质，然后用150Kd滤膜压滤，收集其流出液，流出液经醇析后即为分子量为10万左右的云芝糖肽(PSP)粗品。本品用酚硫酸法及劳里法测定均呈阳性反应，含葡萄糖30-40%，含多肽15-25%。
按照上述实施例1.2.3.方法生产的云芝糖肽，不仅能使肿瘤患者的肿癌缩小或消失，而且能明显提高患者的白血球数，缓解疼痛，提高食欲。以下是部分服用用本方法生产的云芝糖肽的治疗效果。
病例1恶性淋巴瘤(B型，小裂细胞型)沈×× 女 44岁记者 1985年12月患鼻咽部恶性淋巴瘤，白血球3800/mm3。用钴60放射治疗后，味觉消失，食欲骤降。后用化学药物治疗，疗程未到 1/2 ，白血球下跌到2000/mm3。加服沙肝醇，利血生，鹅血片，茜草双酯等升白血球药物后亦未见显效，白血球数始终徘徊在2000-3000/mm3间，化疗无法继续进行。1986年4月起应用PSP，服药两周后，胃口顿开，白血球数上升到5200/mm3，体力渐渐恢复。1986年9月起已重上文坛，采访写作。
病例2恶性黑色素瘤闵×× 女 45岁二胡演奏家 1983年检查出患有恶性黑色素瘤，在上海肿瘤医院用手术及化学药物治疗(治疗方案CCNV)。化疗后毒副反应大，每天剧烈呕吐7-8次，白血球下降至4000以下，精神萎糜，食欲低下。后加服PSP，第二天呕吐次数就减少，精神有好转，食欲渐见提高，白血球上升，稳定在5800-6000/mm2，至今已连服2年半，总剂量2738g。现在已恢复健康，1987年起重上舞台，不仅在国内，而且还赴新加坡及香港地区多次独奏公演。
病例3转移性腹膜癌吴×× 女 37岁 1986年9月检查得知右下腹肿块明显，大5.5×5.0cm2，质硬，表面粗糙，伴有腹水及梗阻性便秘，不能进食，白血球数3800/cm3，抽腹水时发现有转移癌细胞，经用抗癌139注射无明显疗效。后加服PSP治疗，达126g时检查腹水基本消退，肿块缩小至3.0×3.0cm2，白血球数明显上升到5200/cm3，大便通畅，食欲良好。
病例4恶性淋巴瘤IVB褚×× 男 65岁军队离休干部 1983年因窦房结综合症安装了埋藏式心脏起博器，1985年6月又在上海中山医院诊断患有恶性淋巴瘤，肿块位於腹膜后主动脉处，大98×100mm3，立即进行COP化学药物治疗，共6个疗程，后转上海肿瘤医院，用COMP方案化疗13个疗程。开始化疗时，肠胃道反应严重，骨髓明显抑制，食欲减退。后加服PSP(每天1.6-2.4g)，肠胃道反应逐渐消失，骨髓抑制症状改善，经过19个疗程的化疗后，白血球仍持续稳定在4000/mm3以上。病人自我感觉良好，平时很少感染。1987年4月检查，肿块消失，随后停止化疗，改用CB1348维持治疗，並继续加服PSP，累计口服2190g，目前病情稳定，至今已活3年又9个月。
病例5晚期食道癌李×× 男 58岁患食道癌，右上纵隔转移，转移灶肿块7×9cm2，压迫食道，钡剂通不过，进食困难，声音嘶哑。1986年10月27日用CO60，加PSP(每天口服3g)进行综合治疗，至第二周时，因PSP短缺而中途停服，病人即诉说“食欲差”“精神疲惫”“人软无力”，不能坚持治疗，后又获PSP，服后次日病人即觉“精神好转”“饭食增加”，从而完成了治疗计划。至12月22日照光检查，原发灶、转移灶已完成缓解，肿块消失，病人进食正常，发音恢复如常。至今健在。
病例6胃癌陆×× 男 64岁 1987年9月常州中医医院胃镜检查及病理诊断患胃窦部大弯管状腺癌。1987年10月行根治手术。术后用FM方案治疗。化疗前白血球数为4000/mm3。第一次化疗总量5-Fu 1500mg，丝裂霉素16mg，给药后白血球数下降至1200/mm3，病人精神疲惫，纳差，消瘦，不得不中断化疗。经用常规升白药物(提高白血球数量的药物)两周后，白血球数未见回升。后改用PSP，每日三次，每天2.0克，口服两周后，白血球数上升到3500/mm3，全身症状改善。继续服用PSP，並恢复化疗(FM方案)，每周检查血象两次，均在正常值范围，至化疗结束，白血球数始终稳定在5000-6000/mm3。病人胃纳好转，精神恢复，睡眠改善，体重增加。
病例7胃癌张××女76岁1984年12月经X光消化道透视、胃镜检查及细胞培养，确诊为胃癌Ⅳ期。1985年3月，腹部开始阵痛。每日服用止痛片及安眠药，仍止不住。后发展到每天必须打阿托品针剂並口投安眠药。因剧痛，病人无法忍受，多次要求施行安乐死术。1985年4月开始服用PSP。3天后腹痛明显改善，7天后腹部剧痛基本停止。阿托品停用，安眠药也不必服用，病人只觉腹部有隐痛感，能忍受。病人反应服用PSP后自我感觉良好，精神好转，食欲也有提高。
病例8重症肝炎邹××男12岁1987年3月出现进行性黄疸及腹水。肝功能异常〔BI10mg%，TTT12μ，ZnT20μ，GPT100μ，HBsAg(-)〕，在常州一传染病医院住院部经保肝治疗，输血浆及服中药等措施治疗，均无好转，病症日益恶化。5月底转至常州中医医院。体检症状黄疸明显，肝脏右肋下未能触及，脾脏2cm，腹水征(+)，Mass(-)。加服PSP后两周(每天服PSP1.5g)，黄疸逐渐消退，尿量增加，随之，腹水开始消退。一月后复查肝功能，BI为6mg%，TTT10μ，ZnT20μ，GPT80μ，全身症状开始明显好转，至服PSP后三月，患者黄疸明显消退，肝脏右肋下可触及2cm，质地返软，脾肋下触及3cm左右，腹水症(-)，肝功能复查，全部正常，食欲佳，精神好，已恢复正常活动。
权利要求
一种具有抑制人癌细胞与提高负瘤机体免疫功能的云芝糖肽(PSP)生产方法，其特征在于1、生产菌株Cov-1是从中国和各地分离的46株云芝(coriolusversicolor)中经筛选、驯化后获得的一株优良菌株，其适宜于通气发酵培养，培养过程中会散发出浓郁的水果香味，其沉没菌丝呈球状。
2.把(1)所述的Cov-1菌株逐级引入通气发酵罐，通气量为1∶0.5～1∶1.0(V/V)，搅拌速度为100～200rpm，发酵时间为60～72小时。
3.按(1)所述的菌株Cov-1在通气发酵中是从黄豆饼粉或花生饼粉为氮源;以糖蜜和葡萄糖为碳源。
4.按(2)、(3)所述的培养物过滤得菌株Cov-1的菌丝体，破碎后，在90～100℃热水中浸取3～5小时，得到菌丝体浸取液。
5.由(4)得到的浸取液经浓缩后，用1∶3-4(V/V)比例的乙醇在0～4℃温度下醇析6～8小时，得醇析物。
6.由(5)得到的醇析物经干燥处理，即可获得褐色粉末状的云芝糖肽(Polysaccharide-pepetide of Coriolus versicolor简称PSP)。
全文摘要
本发明是一种云芝糖肽(PSP)的生产方法。它采用通气发酵法，经60～70小时培养，从中国云芝cov-1菌株的菌丝体中，用热水浸取和醇析提取获得的一种具有抑制癌细胞与提高机体免疫功能的糖肽。
文档编号C12P21/00GK1034957SQ8910547
公开日1989年8月23日 申请日期1989年2月1日 优先权日1989年2月1日
发明者杨庆尧 申请人:上海师范大学